CN103782902A - 一种借助60Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种借助⁶⁰Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法，利用⁶⁰Co-γ射线对花蕾辐照处理，从照射后的花蕾中分离小孢子进行培养，在再生的双单倍体植株中根据形态特征筛选出突变体。该方法旨在快速创制纯合的大白菜突变体，为大白菜遗传育种研究创制种质资源，并为大白菜功能基因组学研究创制纯合突变体。

Description

一种借助60Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种在小孢子培养过程中结合⁶⁰Co-γ射线诱变创制大白菜突变体的方法。

背景技术

大白菜属于十字花科芸薹属A基因组植物，是我国种植面积最大的蔬菜作物。大白菜的基因组序列已经于2011年释放，其分子生物学研究进入了功能基因组阶段，构建大白菜突变体库是研究其功能基因组学的重要基础。

诱变产生突变体的方法包括物理诱变，化学诱变，T-DNA插入诱变和AC/DS 转座诱变等。物理诱变是获得突变体的常用方法，具有诱变作用强，诱发突变谱广，突变频率高，突变体易稳定，微突变类型多而且有益变异相对较多等优点。

传统的诱变处理方法，主要是处理植株的种子，在田间对诱变植株进行鉴定和选择。利用小孢子为诱变材料与诱变种子相比具有明显的优势：一是以单个小孢子细胞为单元进行诱变处理，可以在很小的空间内处理非常大的群体，可以大幅度提高诱变效率；二是在单倍体小孢子培养前进行诱变处理，一旦突变了的小孢子再生成双单倍体植株，其突变基因是纯合的, 突变性状在当代就能表现，而且后代不再分离。本发明将⁶⁰Co-γ射线辐射诱变处理与小孢子培养技术相结合，可以快速创制出纯合的大白菜突变体，加快突变体库的创建步伐。

发明内容

本发明的目的是创建一种快速创制大白菜突变体的新方法，将⁶⁰Co-γ射线处理和小孢子培养技术相结合，快速获得纯合的大白菜突变体，大幅度提高突变体库创建的效率。

本发明提供的技术方案，主要过程如下：

（1）所用的诱变材料为小孢子DH系，在开花期，选取其长度为2-4 mm的未开放花蕾，小孢子发育期为单核晚期至二核早期，用⁶⁰Co-γ射线进行辐照处理，剂量为20～60Gy，剂量率为1.58 Gy/min；

（2）从照射后的花蕾中分离纯化小孢子，进行液体浅层培养，获得再生的小孢子植株M₀代；

（3）将M₀代植株移栽到温室，用流式细胞仪鉴定其倍性，筛选出双单倍体植株；

（4）在所获得的双单倍体植株中，通过鉴定叶色、叶形、株型、花瓣颜色、花瓣形态、花瓣大小和雄蕊育性植物学性状，初步筛选出突变体植株；

（5）所有双单倍体植株自交，其中雄性不育突变体与野生型杂交，收获M₁种子；

（6）播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。

上述过程（2）的具体内容：将照射后的花蕾分离小孢子进行培养。花蕾在超净工作台内经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％HgCl₂溶液消毒8 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，弃上清液，沉淀加5 mL B5培养基，摇匀，1000 rpm离心3 min，弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净小孢子。将纯化后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1~2×10⁵个·mL^-1，以每皿5 mL小孢子悬浮液分装入直径60 mm的无菌培养皿内, 每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口, 33℃恒温箱中暗培养24小时, 再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根培养；

其中，NLN培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-1 6-BA（ 6-苄氨基腺嘌呤）和0.05mg·L^-1 NAA（α-萘乙酸），PH值为5.8的NLN培养基；诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，6.5~7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8~6.0，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1 NAA，pH值为5.8~6.0的MS培养基。

上述过程（3）的具体内容：利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定，取直径为1～2cm 大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入1.5～2.0 mL Chopping Buffer缓冲液（15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5），用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI（碘化丙啶）染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，约20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的野生型诱变材料为对照, 使对照的DNA吸收峰处在200道（X轴）位置，每个待测植株分别测定3次, DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体, 而峰值处在100和400道的分别为单倍体和四倍体。

本发明的有益效果

（1）游离小孢子培养本身具有快速获得目标性状、缩短育种年限、降低育种成本等优点。将其与辐射诱变技术相结合，获得的后代群体大，增加了获得有益性状的机率，经过自然加倍在当代就能形成纯合的突变体，将会加快突变体的创制速度。

（2）所用的诱变材料为小孢子DH系，是遗传意义上的纯系。如果获得突变体，突变体和野生型植株之间遗传背景完全一致，且完全纯合，只是在突变位点存在差异，便于分离和克隆突变基因，进而分析基因功能。

（3）在单倍体阶段诱变处理，突变了的小孢子经培养再生成的二倍体即为纯合体，突变性状在当代就能表现，便于快速筛选突变材料。

（4）本发明获得纯合的大白菜突变体，不仅为育种研究提供了新的种质资源, 也为大白菜功能基因组学的研究提供良好的物质材料。

附图说明

图1：经⁶⁰Co-γ射线诱变后培养获得的小孢子胚状体。

图中：a: 0 Gy处理；b: 20 Gy处理；c: 40 Gy处理；d: 60 Gy处理

图2：利用流式细胞仪鉴定再生植株的倍性。

图中：a: 单倍体；b: 双单倍体；c: 四倍体；d: 六倍体；e: 八倍体

图3：M₀代筛选出的突变材料。

图中：a: 白化苗；b: 叶片边缘锯齿；c: 叶片(‘FT’)；d: 花瓣黄色 (右) 和‘FT’；e–f: 花瓣数目变异；g: 柱头外露(轻，左)；h: 柱头外露(重)；i: 柱头外露(轻，中), 柱头外露(重，右)和‘FT’

图4：M₁代鉴定出的株型突变材料。

图中：a: ‘FT’；b: 不结球突变体

图5：M₁代鉴定出的花器官突变材料。

图中：a: ‘FT’；b: 花瓣退化突变体；c: 少雄蕊突变体 (左) 和‘FT’

图6：M₁代鉴定出的雄性不育突变材料。

图中：a: ‘FT’；b: 雄性不育突变体 (雄蕊发育正常，无花粉)；c: 雄性不育突变体 (雄蕊发育退化，无花粉)；d: b图所示雄性不育突变体的雄蕊（左）和‘FT’(右)；e: c图所示雄性不育突变体的雄蕊（左）和‘FT’(右)

注：‘FT’指所用的诱变材料，它是小孢子DH系。

具体实施方式

实施例1、 ⁶⁰ Co-γ射线诱变处理过程

一、植物材料

所用的诱变材料是大白菜早熟品种‘福田50’经游离小孢子培养获得的DH系，我们将其命名为‘FT’，它具有耐热、白花、叶球卵圆型特点。

本实验室中刘洋等人以‘FT’作为试验材料在《Euphytica》杂志上已经发表了相关的文章，文章题目为《Mapping quantitative trait loci for yield-related traitsin Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis)》。

二、诱变处理

‘FT’的种子经过2℃低温春化处理15天后，于2011年3月播种于温室中。2011年5月，在开花期选取长度在2-4 mm的未开放花蕾（小孢子发育到单核晚期至二核早期），于辽宁省农科院辐射中心用⁶⁰Co-γ射线辐照处理，剂量为0(对照)、20、40、60Gy，剂量率为1.58 Gy/min，每处理重复3次。

实施例2、游离小孢子培养过程

一、游离小孢子培养

将照射后的花蕾分离小孢子进行培养。花蕾在超净工作台内经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％HgCl₂溶液消毒8 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，弃上清液，沉淀加5 mL B5培养基，摇匀，1000 rpm离心3 min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。将纯化后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1~2×10⁵个·mL^-1，以每皿5 mL小孢子悬浮液分装入直径60 mm的无菌培养皿内, 每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口, 33℃恒温箱中暗培养24小时, 再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根培养。

其中，NLN培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-1 6-BA（ 6-苄氨基腺嘌呤）和0.05mg·L^-1 NAA（α-萘乙酸），PH值为5.8的NLN培养基；诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，6.5~7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8~6.0，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1 NAA，pH值为5.8~6.0的MS培养基。

二、 ⁶⁰ Co-γ射线对小孢子胚发生的影响

辐射对于小孢子胚发生具有明显的剂量效应（图1），不同剂量的⁶⁰Co-γ射线处理花蕾，对小孢子胚状体的发生会产生不同的影响，我们在小孢子培养后第25天统计小孢子胚状体的诱导率。结果表明⁶⁰Co-γ射线抑制小孢子胚发生和胚状体的发育；随着辐射剂量的增加，小孢子胚状体的诱导率逐渐下降，不同辐射剂量之间差异显著（表1）。

 

表1  ⁶⁰ Co-γ射线对大白菜小孢子胚发生的影响

注：表中数据为3次重复平均值，邓肯新复极差测验，不同小写字母为差异显著(P= 0.05)。

 

实施例3、再生植株群体的倍性鉴定过程

一、利用流式细胞仪鉴定再生植株倍性

待再生植株生根后，于2011年10月将再生植株移栽到温室进行培养，温室内温度白天应为20～25℃，晚间温度应为5～10℃。

我们主要利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定（图2），筛选出双单倍体植株。取直径为1～2cm 大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入1.5～2.0 mL Chopping Buffer缓冲液（15 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol·L^-1精胺，80 mmo1·L^-1氯化钾，20 mmo1·L^-1 氯化钠，0.1% [v/v] 聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5），用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI（碘化丙啶）染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测， 20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的大白菜‘FT’为对照, 使对照的DNA吸收峰处在200道（X轴）位置，每个待测植株分别测定3次, DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体, 而峰值处在100和400道的分别为单倍体和四倍体。

二、辐射诱变后再生植株的倍性变化

经辐射诱变后，游离小孢子培养获得的再生植株的倍性也发生了一些变化。与对照相比，再生植株群体中双单倍体所占的比例变化不大，但单倍体和四倍体的比例发生了明显的变化，同时在再生植株群体中也出现了一些不常见的倍性植株（表2）。

 

表2 辐射诱变后小孢子再生植株的倍性变化

 注：总计是20 Gy，40 Gy 和60 Gy三个处理的总和。

百分比=100% × (株数)/鉴定再生植株数。

实施例4、筛选和鉴定突变体过程

一、突变体的筛选与鉴定

经游离小孢子培养共获得1483株再生植株（M₀），通过筛选，在M₀代双单倍体植株中发现了大量表型变异的突变植株（表3）。将所有双单倍体植株自交，其中雄性不育突变体与‘FT’杂交，收获M₁种子。

2012年9月，播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体（表4），并构建了一个包括株型、花器官和雄性不育等多种变异类型的突变体库。

在筛选突变体的过程中，很多突变性状仅仅出现在M₀代，M₁代便恢复正常（图3）。这些突变可能是由生理损伤造成的，并且容易受环境条件影响，是不可遗传的突变性状。

 

表3 M ₀ 代突变体性状的分类

 

表4 M ₁ 代突变体性状的分类

 二、突变体的分类与特征

1．株型突变体：

‘FT’的叶片皱缩、叠抱，叶球呈卵圆型；突变体表现为叶片松散、平滑、无皱褶，并且不结球（图4）。

2．花器官突变体：

(1) 花瓣退化突变体

‘FT’的花瓣平整，四片花瓣呈对称排列，完全展开；突变体表现为花瓣退化、卷缩，并且不能完全展开（图5）。

(2) 少雄蕊突变体

突变体表现为整株的花朵中雄蕊数目不稳定，多数为5个雄蕊，只有少量花朵中为正常的6个雄蕊（图5）。

3．雄性不育突变体：

根据雄蕊的发育形态，可将雄性不育突变体分为两类。一类是雄蕊发育正常，但雄蕊无花粉；另一类是雄蕊发育退化，瘦弱干瘪，无花粉（图6）。

对于雄性不育突变体，在M₀代将其与‘FT’杂交。雄蕊发育正常，无花粉突变体在M₁代全恢复为可育，自交后，后代出现分离；雄蕊发育退化，无花粉突变体在M₁代表现为全不育。

Claims (1)

1.一种借助⁶⁰Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法，其特征在于：

（1）所用的诱变材料为小孢子DH系，在开花期，选取其长度为2-4 mm的未开放花蕾，小孢子发育期为单核晚期至二核早期，用⁶⁰Co-γ射线进行辐照处理，剂量为20～60Gy，剂量率为1.58 Gy/min；

（2）从照射后的花蕾中分离纯化小孢子，进行液体浅层培养，获得再生的小孢子植株M₀代；

（3）将M₀代植株移栽到温室，用流式细胞仪鉴定其倍性，筛选出双单倍体植株；

（4）在所获得的双单倍体植株中，通过鉴定叶色、叶形、株型、花瓣颜色、花瓣形态、花瓣大小和雄蕊育性等植物学性状，初步筛选出突变体植株；

（5）所有双单倍体植株自交，其中雄性不育突变体与野生型杂交，收获M₁种子；

（6）播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。

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