CN115119748B - 一种离体培养获取水角纯合体的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种离体培养获取水角纯合体的方法，属于生物技术领域。本发明采用一种诱导水角离体试管开花、结实，获取纯合体的方法，完成水角无菌种子萌发、单株繁殖、离体开花诱导、自交结实完整的一个生命周期。本发明操作简单、周期短、科学性强，为加快凤仙花科植物纯合系纯化速度、性状遗传规律探讨、自交衰退等相关科学研究提供理论基础和技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种离体培养获取水角纯合体的方法，更具体地，涉及一种诱导水角离体试管开花、结实，获取纯合体的方法。
背景技术
水角(Hydrocera triflora)隶属于凤仙花科(Balsaminaceae)水角属(Hydrocera)，多年水生草本，单属种珍稀濒危植物，国内仅分布于海南省，生于海拔100m左右的湖泊、沼泽湿地及田边水沟等地方。水角开花时，呈粉红色，非常美丽，具有较高的园艺观赏价值，同时水角也是湿地中生物多样性的重要植被资源。凤仙花科植物是优美的盆栽花卉之一，品种丰富，具有近1000个野生原种，为该科种质的改良、创新和开发利用提供了有力保障和物质基础。凤仙花科是典型的异花授粉植物，开花生物学较为独特，分为雄蕊期和雌蕊期，雄蕊成熟脱落后，雌蕊柱头才开始发育，通过雌雄异熟和独特的花部结构来避免自交，保存着基因型的高度杂合性。纯合体是指由两个相同的显性基因或隐性基因的配子结合成的合子发育成的个体，其基因型能够稳定的遗传，不会出现性状分离，在杂种优势利用、性状遗传规律探讨、基因调控、自交衰退研究等方面具有重要的理论和实际意义。常规植物育种中纯合体获取往往通过在自然条件下采用人工套袋授粉的方法，经过若干代自交筛选获得。纯合体通常具有农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的特点。但因植物本身生长周期所限，凤仙花科植物的人工授粉实验往往一年只能进行一次，自交的材料进一步纯化更需要连续多代自交(5-8代)才能获得相对更纯的纯合体，整个过程需要消耗大量的人力、物力和财力。因此，开展水角获取纯合体方法相关研究，可以缩短育种时间，提高育种效率，对凤仙花科植物的品种选育、开发与利用具有重要意义。试管开花、结实是指利用组织培养技术，使植物在密闭的培养容器内完成整个生命周期过程，具有不受季节限制、培养周期短、避免病害和自然灾害等优点。目前，关于水角试管自交纯化方面的技术未见报道，也未见有通过离体培养获取水角纯合体的方法的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的旨在提供一种离体培养获取水角纯合体的方法，利用本发明所述培养基完成水角种子无菌萌发、单株繁殖、离体开花诱导、自交结实完整的一个生命周期。本发明操作简单、周期短、科学性强，为加快凤仙花科植物纯合系纯化速度、性状遗传规律探讨、自交衰退等相关科学研究提供理论基础和技术支持。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种离体培养获取水角纯合体的方法，该方法采用一种诱导水角离体试管开花、结实，获取纯合体，完成水角种子无菌萌发、单株繁殖、离体开花诱导、自交结实完整的一个生命周期。
一种离体培养获取水角纯合体的方法，该方法包括下述步骤：
在8-9月份，取水角植株上深褐色成熟假浆果，流水冲洗30min，在超净工作台中，外植体用75％乙醇浸泡20s，2％次氯酸钠灭菌10min，无菌水漂洗4-5 次，置于无菌滤纸上晾干，剖开假浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上培养，所述培养基为：花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L 蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间12h/d， 3-7d后种子开始萌发，将种子萌发培养40d后的材料切成带节茎段接种到培养基上进行单株扦插繁殖，所述培养基为：花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭 +20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，继代周期为21-28d，使植株处于营养生长状态，植株生长速度快，28d可长到6-11片叶片；
将上述水角无菌单株小苗切成带节的茎段接种到培养基上进行单株繁殖，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，继代周期为30d，增殖速率可达1:3，所述培养基为花宝1号3g/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+1g/L活性炭 +20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；
将增殖得到的材料切成带节的茎段接种到培养基上进行试管开花诱导，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d。60-70d后有花芽分化，继续培养30d至花朵开放，所述的培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭 +10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；在固定的培养瓶内，雌蕊发育时，雄蕊及花被片还未完全脱落，这期间植株自行完成自花授粉结实，培养30-40d后假浆果成熟，记为自交1代F1；
在超净工作台中，采收成熟的假浆果，置于无菌滤纸上剖开浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，所述培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L 蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，3-7d后种子开始萌发；
将种子萌发后的无菌苗材料重复上述单株繁殖、试管开花诱导及结实步骤获得自交2代F2，如此重复多代自交，获得水角纯合系。
一种离体培养获取水角纯合体的方法，该方法包括下述步骤：
以水角种子为原材料，将水角种子进行表面消毒和无菌萌发得到无菌小苗，建立无菌无性系，取水角试管苗为材料，
将上述水角无菌单株小苗切成带节的茎段接种到培养基上进行单株繁殖，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，继代周期为30d，增殖速率可达1:3，所述培养基为花宝1号3g/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+1g/L活性炭 +20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；
将增殖得到的材料切成带节的茎段接种到培养基上进行试管开花诱导，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d。60-70d后有花芽分化，继续培养30d至花朵开放，所述的培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭 +10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；在固定的培养瓶内，雌蕊发育时，雄蕊及花被片还未完全脱落，这期间植株自行完成自花授粉结实，培养30-40d后假浆果成熟，记为自交1代F1；
在超净工作台中，采收成熟的假浆果，置于无菌滤纸上剖开浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，所述培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L 蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，3-7d后种子开始萌发；
将种子萌发后的无菌苗材料重复上述单株繁殖、试管开花诱导及结实步骤获得自交2代F2，如此重复多代自交，获得水角纯合系。
采用本发明的上述方法所得到的水角种子萌发的植株基因组杂合度低，可大量扩繁和离体保存，为进一步开展凤仙花科植物的分子育种、性状遗传规律探讨、自交衰退机理等提供材料。
附图说明
图1为水角试管开花诱导与结实过程，其中(a)试管苗(b)带节茎段(c) 试管开花(d)试管结实(e)成熟假浆果(f)种子萌发，比例尺e，0.5cm。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
在8-9月份，取水角(Hydrocera triflora)植株上深褐色成熟假浆果，流水冲洗30min。在超净工作台中，外植体用75％乙醇浸泡20s，2％次氯酸钠灭菌10min，无菌水漂洗4-5次，置于无菌滤纸上晾干，剖开假浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基(花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8)，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间12h/d。 3-7d后种子开始萌发。将种子萌发培养40d后的材料切成带节茎段接种到培养基 (花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8) 上进行单株扦插繁殖，继代周期为21-28d，使植株处于营养生长状态，植株生长速度快，28d可长到6-11片叶片，平均增殖速率可达1:3。
将增殖得到的试管苗材料(图1a)切成带节的茎段(图1b)接种到培养基 (花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8) 上进行试管开花诱导，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d。 60-70d后有花芽分化，继续培养30d左右花朵开放(图1c)。在固定的培养瓶内，雌蕊发育时，雄蕊及花被片还未完全脱落，这期间植株可以自行完成自花授粉结实(图1d)，培养30-40d后假浆果成熟(图1e)，记为自交1代F1。种子萌发到收获种子完成一个生命周期所需时间约190-210d。
在超净工作台中，采收成熟的假浆果，置于无菌滤纸上剖开浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基(花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8)，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d。3-7d后种子开始萌发(图1f)。
将种子萌发后的无菌苗材料重复上述单株繁殖、试管开花诱导及结实等实验步骤可获得自交2代F2，如此重复多代自交获得水角纯合系。
对比例
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行水角试管开花诱导及其自交纯化试验，不同的是基本培养基花宝1号更换为WPM，添加NAA浓度为0.2、 0.5、1.0mg/L，添加椰汁50、100ml/L(表1，4、5、6号培养基)，植株生长缓慢，长势弱，叶片泛黄，培养70d后统计未见花芽分化，未能继续进行后期试管自交纯化。
实施例2
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行水角试管开花诱导及其自交纯化试验，不同的是诱导开花及结实培养基中添加NAA浓度为0.2mg/L，添加椰汁100ml/L(表1，2号培养基)，结果与实施例1相比，植株生长情况、开花率、结实率没有显著性差异。
实施例3
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行水角试管开花诱导及其自交纯化试验，不同的是诱导开花及结实培养基中添加NAA浓度1.0mg/L，添加椰汁50ml/L(表1，3号培养基)，结果与实施例1相比，植株生长情况、开花率、结实率没有显著性差异。
实施例4
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行水角试管开花诱导及其自交纯化试验，不同的是基本培养基花宝1号更换为MS，添加NAA浓度为0.2、0.5、 1.0mg/L，添加椰汁50、100ml/L(表1，7、8、9号培养基)，结果与实施例1 相比，生长情况较好，植株健壮，7号培养基也有花芽的分化及结实，但极显著低于实施例1。
表1不同培养基对水角试管开花的影响
注：不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著，大写字母表示在0.01 水平差异极显著。# 。
Claims (2)
1.一种离体培养获取水角纯合体的方法，该方法采用一种诱导水角离体试管开花、结实，获取纯合体，完成水角种子无菌萌发、单株繁殖、离体开花诱导、自交结实完整的一个生命周期，以水角种子为原材料，将水角种子进行表面消毒和无菌萌发得到无菌小苗，建立无菌无性系，取水角试管苗为材料，其特征在于，该方法包括下述步骤：
将上述水角无菌单株小苗切成带节的茎段接种到培养基上进行单株繁殖，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，继代周期为30d，增殖速率可达1:3，所述培养基为花宝1号3g/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；
将增殖得到的材料切成带节的茎段接种到培养基上进行试管开花诱导，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，
60-70d后有花芽分化，继续培养30d至花朵开放，所述的培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；在固定的培养瓶内，雌蕊发育时，雄蕊及花被片还未完全脱落，这期间植株自行完成自花授粉结实，培养30-40d后假浆果成熟，记为自交1代F1；
在超净工作台中，采收成熟的假浆果，置于无菌滤纸上剖开浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，所述培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，3-7d后种子开始萌发；
将种子萌发后的无菌苗材料重复上述单株繁殖、试管开花诱导及结实步骤获得自交2代F2，如此重复多代自交，获得水角纯合系。
2.一种离体培养获取水角纯合体的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
在8-9月份，取水角植株上深褐色成熟假浆果，流水冲洗30min，在超净工作台中，外植体用75%乙醇浸泡20s，2%次氯酸钠灭菌10min，无菌水漂洗4-5次，置于无菌滤纸上晾干，剖开假浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上培养，所述培养基为：花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间12h/d，3-7d后种子开始萌发，将种子萌发培养40d后的材料切成带节茎段接种到培养基上进行单株扦插繁殖，所述培养基为：花宝2号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，继代周期为21-28d，使植株处于营养生长状态，植株生长速度快，28d可长到6-11片叶片；
将上述步骤增殖得到的试管苗材料切成带节的茎段接种到培养基上进行试管开花诱导，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，
60-70d后有花芽分化，继续培养30d至花朵开放，所述的培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8；在固定的培养瓶内，雌蕊发育时，雄蕊及花被片还未完全脱落，这期间植株自行完成自花授粉结实，培养30-40d后假浆果成熟，记为自交1代F1；
在超净工作台中，采收成熟的假浆果，置于无菌滤纸上剖开浆果取出种子，选取饱满种子划破种皮后接种到培养基上，培养温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间12h/d，所述培养基为花宝1号3g/L+NAA0.5mg/L+1g/L活性炭+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.8，3-7d后种子开始萌发；
将种子萌发后的无菌苗材料重复上述单株繁殖、试管开花诱导及结实步骤获得自交2代F2，如此重复多代自交，获得水角纯合系。
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