CN103461132B - 利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法，包括黄瓜子房的取材，消毒，切片，高温诱导处理，继代培养与植株再生等步骤。采用本发明方法可使植株再生率达到20%，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率达到80%。本方法不仅适用于国内主栽密刺型黄瓜，旱黄瓜类型的黄瓜，还适用于日本类型黄瓜，欧洲类型黄瓜等，经过田间筛选可用作育种材料，应用于黄瓜品种的选育，从而加快育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术，具体地说，涉及一种利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法。
背景技术
新品种的推广和普及对于推动黄瓜生产的发展发挥了重要作用,选育抗逆性强、兼抗多种病害、能适应各种生态环境、高品质的品种仍将是今后黄瓜育种工作的发展方向。传统的育种方法耗时、耗力、效率低，另外由于种质资源的限制，可供利用的资源性状差异越来越小，因此仅靠常规育种方法和现有资源已难以使新育成品种在抗性、品质方面有很大突破，因而种质资源是育种研究的基础，没有突破性的种质资源，就不可能育成突破性的品种。采用单倍体育种方法进行品种选育弥补了传统育种的诸多不足，成为育种家关注的焦点。单倍体育种是利用花药培养、子房培养以及辐射花粉授粉诱导等方法诱导产生单倍体，并使其单一的染色体各自加倍成对，成为有活力、能正常结实的纯合体。它在遗传上是稳定的，不再分离，相当于同质结合的纯系（而从杂交到获得不分离的品系只需要两个世代的时间）。由于单倍体植株的基因型和表现型完全一致，大大降低了误选频率；而且以单倍体为诱变材料，突变隐性基因性状就可表现出来，获得突变体的速度可大大加快，从而缩短了育种年限，并可以快速产生纯合的育种新材料（纯系），为提高育种效率提供了可能，还可作为遗传转化的优良受体材料。
黄瓜单倍体研究在国外较为成熟，最常见的是利用花药培养的方法。然而，目前黄瓜大孢子单倍体培养技术存在效率低的问题，单倍体发生频率和植株再生频率均较低。
发明内容
本发明旨在提高单倍体发生频率和植株再生率，提供一种利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法，包括以下步骤：
1）取黄瓜植株开花前未授粉的子房，消毒后用无菌水洗净；
2）将子房切片，接种于MS固体培养基I中，置于33-36℃（优选35℃）黑暗条件下高温诱导24-72h（优选48h）；
3）将上述培养基置于16h光照，8h黑暗的室温条件下继续培养至出现胚状体和愈伤组织；
4）将胚状体转移至MS固体培养基II中，置于16h光照，8h黑暗的室温条件下培养，待胚状体长出5-6片叶后，炼苗，定植于大田。
其中，步骤2）中所述MS固体培养基I为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8-6.0（优选5.8）。
步骤4）中所述MS固体培养基II为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L，pH值5.8-6.0（优选5.8）。
前述的方法，步骤1）具体为：取黄瓜植株开花前2天未授粉的子房，用75%的酒精消毒30s，然后用0.1%的HgCL2溶液消毒7min，最后用无菌水冲洗3次。
前述的方法，步骤2）中是将无菌材料横切成2mm厚的子房切片。
前述的方法，步骤3）中使用的光源为光强1500Lux的LED灯光源。
前述的方法，步骤4）中使用的光源为光强2000Lux的LED灯光源。
本发明还提供用于诱导培养黄瓜大孢子单倍体的培养基，所述培养基为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8-6.0（优选5.8）。
本发明还提供用于继代培养黄瓜大孢子单倍体的培养基，所述培养基为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L，pH值 5.8-6.0（优选5.8）。
本发明的利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法中，在培养基中添加了激素成分，且在培养前期进行了高温诱导预处理，采用该方法可使植株再生率达到20%，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率达到80%。本方法不仅适用于国内主栽密刺型黄瓜，旱黄瓜类型的黄瓜，还适用于日本类型黄瓜，欧洲类型黄瓜等，经过田间筛选可用作育种材料，应用于黄瓜品种的选育，从而加快育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例1中经高温诱导处理后的大孢子在培养30多天后，产生成熟的胚状体。
图2为本发明实施例1中胚状体在伸长培养基中的生长。
图3为本发明实施例1中移栽前对伸长培养基中的再生植株进行炼苗。
图4为本发明实施例1中采用流式细胞仪鉴定再生植株为单倍体植株。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法
1材料来源
1.1基因型：国内主栽的密刺类型的黄瓜品种（津优35），旱黄瓜类型（唐山秋瓜），日本类型黄瓜（瑞光2号），欧洲类型的黄瓜（迷你2号）等，共计10个品种。其中，唐山秋瓜是常规种，其他均为杂交种，可市售获得。
1.2取材：供体材料种植于温室或大棚，取材要求植株处于生长旺盛的阶段（取材植株生长阶段在10-25节之间）。取开花前2天的 未授粉子房。
2消毒
选取子房用75%的酒精消毒30s，然后用0.1%的HgCL2消毒7min，最后用无菌水冲洗3次待用。
3接种
将无菌材料横切，切成厚度为2mm的子房切片。接种于添加有激素的MS固体培养基中。MS培养基配方为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8。
4高温诱导
将接种好的培养皿置于35℃的黑暗条件下高温诱导48h。
5胚胎诱导
将上述高温诱导处理后的大孢子培养皿静置培养，培养条件为：白天光强1500Lux的LED灯光源的光照16h。晚上8小时黑暗处理。培养室温度25℃，处理一个月后可见幼小的胚状体和愈伤组织出现（图1）。
6继代培养与植株再生
挑选健康的胚状体转移到MS伸长培养基中，MS伸长培养基为：MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L，pH值5.8。
培养条件为：白天光强2000Lux的LED灯光源的光照16h。晚上8小时黑暗处理。培养室温度25℃。
7移栽
待胚状体长成5-6片叶（图2）后，经过炼苗（图3），定植于大田。
8染色体倍性鉴定
取植株新生叶片，使用流式细胞仪进行染色体的倍性鉴定，并用普通2倍体植株的叶片做对照。熟练操作后，亦可通过明显的田间形态差异进行鉴定，例如，单倍体植株弱小，茎秆细，叶片小，雄花和 雌花多早衰；自然加倍后的双倍体植株与正常2倍体植株相同，叶片和茎秆正常，植株健壮，育性恢复，后代性状表现一致，不发生分离。
9实施结果
9.1胚胎诱导率
供试材料共计10个基因型，均能诱导出健壮的胚胎，并在伸长培养基中正常生根发芽伸长生长成长成再生植株，不同基因型的胚诱导率有差异，密刺溜类型的黄瓜品种（中农26、津优35等）胚胎诱导率较高，再生植株率可达到20%（见表1）。日本类型黄瓜和旱黄瓜类型黄瓜胚诱导率和植株再生率次之，欧洲类型的黄瓜，胚诱导率和植株再生率相对较低。
表1胚胎诱导率
9.2双单倍体的植株比率
经流式细胞仪鉴定（图4），本方法培养出来的双单倍体植株率可达80%（见表2）。为单倍体技术在黄瓜育种上的应用提供了技术支持。
表2双单倍体的植株比率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法，用于密刺型黄瓜，其特征在于，包括以下步骤：
1)取黄瓜植株开花前未授粉的子房，消毒后用无菌水洗净；
2)将子房切片，接种于MS固体培养基I中，置于33-36℃黑暗条件下高温诱导24-72h；
3)将上述培养基置于16h光照，8h黑暗的室温条件下继续培养至出现胚状体和愈伤组织；
4)将胚状体转移至MS固体培养基II中，置于16h光照，8h黑暗的室温条件下培养，待胚状体长出5-6片叶后，炼苗，定植于大田；
其中，步骤2)中所述MS固体培养基I为：MS+3％蔗糖+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8-6.0；
步骤4)中所述MS固体培养基II为：MS+3％蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L，pH值5.8-6.0；
步骤1)具体为：当黄瓜植株生长阶段在10-25节之间，取黄瓜植株开花前2天未授粉的子房，用75％的酒精消毒30s，然后用0.1％的HgCL2溶液消毒7min，最后用无菌水冲洗3次；
步骤2)中是将子房横切成2mm厚的子房切片；
步骤3)中使用的光源为光强1500Lux的LED灯光源；
步骤4)中使用的光源为光强2000Lux的LED灯光源。
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