CN104521750B - 一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养领域，提供一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，该方法通过将发生花打顶现象的再生植株移至恢复培养基进行恢复培养，并控制所述恢复培养的光照条件、温度条件、湿度条件，将所述发生花打顶的再生植株恢复为正常再生植株。所述恢复培养基为：以MS基本培养基为基础，添加赤霉素0.3‑1.0mg/L。本发明通过恢复培养基，与光照条件、温度条件、湿度条件协同作用，可以使发生花打顶的小植株打破花打顶生理障碍，大大提供黄瓜大孢子培养的植株再生率；本发明操作简便易行，成本低廉，适合在黄瓜大孢子培养中广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，特别涉及一种在黄瓜大孢子培养过程中，克服胚状体分化成再生植株后发生花打顶的方法。
背景技术
黄瓜大孢子培养通过诱导黄瓜大孢子出胚，可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，缩短了育种年限，提高育种效率，还可用作遗传转化的优良受体材料。通过黄瓜大孢子培养成功获得的胚状体，要转移到再生培养基中进行植株的再生，而在植株再生过程中由于培养基的成份和外界培养环境条件等因素，会导致很大比例的再生小植株发生花打顶的生理障碍(小植株在再生培养基上持续大量开花直至养分耗尽最后凋亡)，使得再生小植株不能成功的发育成健康的植株，花打顶现象严重影响黄瓜大孢子培养的植株再生率。
因此，在黄瓜大孢子培养的科研和实践中，需要找到一种有效地克服再生植株发生花打顶生理障碍的培养方法。
发明内容
本发明提供一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，该方法通过将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基进行恢复培养，并控制所述恢复培养的光照条件、温度条件、湿度条件，将所述发生花打顶的再生植株恢复为正常再生植株。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，通过将发生花打顶现象的再生植株移至恢复培养基进行恢复培养，并控制所述恢复培养的光照条件、温度条件、湿度条件，将所述发生花打顶的再生植株恢复为正常再生植株；
进一步地，所述恢复培养基为，以MS基本培养基为基础，添加赤霉素0.3-1.0mg/L，优选为0.5mg/L；
进一步地，所述光照条件为：白天光照强为度6000LUX-12000LUX，优选为9000LUX，光照时间12-18h，优选为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为6h-12h，优选为8h；
进一步地，所述温度条件为：白天温度为25-30℃，优选温度28℃；夜晚温度为18-25℃，优选为20℃；
进一步地，所述湿度条件为：白天空气湿度为30％-70％，优选为50％；夜晚空气为60％-90％，优选为85％。
进一步地，所述黄瓜的品种为北京102、中农26、津优1中的一种或几种。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过添加有赤霉素(GA)的恢复培养基，与光照条件、温度条件、湿度条件协同作用，可以使发生花打顶的小植株打破花打顶生理障碍，培养30天后花打顶植株转化为正常植株的比率达到20-70.3％，大大提供黄瓜大孢子培养的植株再生率。
2、本发明操作简便易行，成本低廉，适合在黄瓜大孢子培养中广泛推广使用，克服花打顶生理障碍。
附图说明
图1为实施例2中发生花打顶生理障碍的再生植株的照片。
图2为实施例2中培养30天后花打顶植株转化为健康植株的照片。
具体实施方式
本发明提供一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，该方法通过将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基进行恢复培养，并控制所述恢复培养的光照条件、温度条件、湿度条件，将所述发生花打顶的再生植株恢复为正常再生植株。
该方法包括如下步骤：
步骤一、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株。
上述发生花打顶的再生植株是通过以下方法获得的：
取品种为北京102、或中农26、或津优1的黄瓜植株上开花前1d的子房作为外植体；将该外植体清洗后，在超净工作台上用75％的乙醇溶液表面消毒30s，再用2.5％的NAClO溶液灭菌15min，再用无菌水清洗3-4遍，每次1min；再将子房横切为1mm厚度的切片，先接种到诱导培养基(MS+3％蔗糖+1％琼脂+0.04mg/L TDZ)，进行35℃热激处理，时间为2d；完成热激处理5-7d后，可观察到子房薄片上有球型胚状物的突起，将该子房薄片转移到分化培养基(MS+3％蔗糖+1％琼脂+0.2mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA)，室温下进行胚的分化和发育，得到发育成熟的胚状体；将该发育成熟的胚状体转移到再生培养基(MS+3％蔗糖+0.8％琼脂，或MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.05-0.1mg/L 6-BA)上进行植株再生培养，得到再生植株，该再生培养的环境为：白天光强3000LUX左右，16小时光照处理，夜晚光强0LUX，8小时处理；培养室温度为恒温25℃。
该再生培养过程中，部分再生植株最早在2-3片真叶长出后，就会发生严重的花打顶现象(再生植株在再生培养基上营养生长基本停止，同时连续大量开花直至植株最后凋亡)，发生花打顶现象植株的比例可以超过50％，有的花打顶植株在没有进行恢复培养的情况下，培养了一年之久仍旧在再生培养基上连续开花，不能自行打破花打顶的生理障碍，严重影响再生植株的成苗率。
上述各培养基PH值为5.8，实验中的器材均采用121℃高压灭菌20min；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.3-1.0mg/L(示例性地，可以为0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9、1.0等中任意或任意两者之间的范围)；
pH值为5.8；
上述MS基本培养基的成分为：
大量元素，包括：
硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸铵(NH4NO3)：1650mg/L，
硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，
氯化钙(CaCl2·2H2O)：440mg/L；
微量元素，包括：
硫酸锰(MnSO4·H2O)：16.9mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，
硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，
氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L；
铁盐，包括：
二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)：37.3mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)：27.8mg/L；
有机，包括：
甘氨酸：2.0mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.1mg/L，烟酸：0.5mg/L，肌酸：100mg/L；
蔗糖：25-30g/L(比如在25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L等任意或任意两者之间，优选为30g/L)；
琼脂：7-12g/L(比如在7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0等任意或任意两者之间，优选为10g/L)。
步骤二、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养。
恢复培养的光照条件为：白天光照强为度6000LUX-12000LUX(示例性地，可以为6000LUX、7000LUX、8000LUX、9000LUX、9500LUX、10000LUX、11000LUX、12000LUX等中任意或任意两者之间的范围，优选为9000LUX)，光照时间12-18h(示例性地，可以为12h、13h、14h、15h、16h、16.5h、17h、18h等中任意或任意两者之间的范围，优选为16h)；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为6h-12h(示例性地，可以为6h、7h、8h、8.5h、9h、10h、11h、12h等中任意或任意两者之间的范围，优选为8h)；
恢复培养的温度条件为：白天温度为25-30℃(示例性地，可以为25℃、26℃、27℃、28℃、28.5℃、29℃、30℃等中任意或任意两者之间的范围，优选为28℃)；夜晚温度为18-25℃(示例性地，可以为18℃、19℃、20℃、20.5℃、21℃、22℃、23、24、25℃等中任意或任意两者之间的范围，优选为20℃)；
恢复培养的湿度条件为：白天空气湿度为30％-70％(示例性地，可以为30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％等中任意或任意两者之间的范围，优选为50％)；夜晚空气为60％-90％(示例性地，可以为60％、70％、75％、80％、85％、87％、90％等中任意或任意两者之间的范围，优选为85％)。
上述培养方法通过添加有赤霉素(GA)的恢复培养基，与光照条件、温度条件、湿度条件协同作用，可以使发生花打顶的小植株打破花打顶生理障碍，培养30天后花打顶植株转化为正常植株的比率达到20-70.3％，大大提供黄瓜大孢子培养的植株再生率。
上述培养方法操作简便易行，成本低廉，适合在黄瓜大孢子培养中广泛推广使用，克服花打顶生理障碍。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
一种黄瓜(品种为北京102)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.3mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为8h；
温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
实施例2：
一种黄瓜(品种为北京102)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.5mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为8h；
温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
实施例3：
一种黄瓜(品种为中农26)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.8mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为8h；
温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
实施例4：
一种黄瓜(品种为中农26)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.5mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为6000LUX，光照时间为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为8h；
温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
实施例5：
一种黄瓜(品种为津优1)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.5mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为12h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为12h；
温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
实施例6：
一种黄瓜(品种为津优1)大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，包括如下步骤：
(1)、更换培养基：在无菌条件下，将发生花打顶的再生植株移至恢复培养基，得到更换完培养基的再生植株；该恢复培养基以MS基本培养基为基础，添加赤霉素(GA)0.5mg/L，该MS基本培养基含有蔗糖30g/L、琼脂10g/L；
(2)、恢复培养：将装有更换完培养基的再生植株的培养瓶，放置于智能人工气候箱(购于宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行恢复培养；
光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为16h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为8h；
温度条件为：白天温度为25℃；夜晚温度为25℃；
湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气湿度为85％。
试验例：
各取100棵发生花打顶的在再生植株，经实施例1-6的方法进行恢复培养，3次重复，经过15天和30天后分别统计花打顶植株转化为正常植株的比率，此时健康的植株可以成功定植到田间栽培(见表1)。实施例2中发生花打顶生理障碍的再生植株，在刚长成1-2片幼嫩叶片时就在培养基上大量地持续地开花，如图1所示；实施例2中培养30天后，花打顶植株转化为健康植株，如图2所示。
表1：不同浓度GA对再生植株花打顶的影响
Claims (9)
1.一种黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：该方法通过将发生花打顶现象的再生植株移至恢复培养基进行恢复培养，并控制所述恢复培养的光照条件、温度条件、湿度条件，将所述发生花打顶的再生植株恢复为正常再生植株；
所述恢复培养基为，以MS基本培养基为基础，添加赤霉素0.3-1.0mg/L。
2.根据权利要求1所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：
所述恢复培养基为，以MS基本培养基为基础，添加赤霉素0.5mg/L。
3.根据权利要求1所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述光照条件为：白天光照强度为6000LUX-12000LUX，光照时间12-18h；夜晚光照强度为0LUX，光照时间为6h-12h。
4.根据权利要求3所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述光照条件为：白天光照强度为9000LUX，光照时间为16h；夜晚光照时间为8h。
5.根据权利要求1所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述温度条件为：白天温度为25-30℃；夜晚温度为18-25℃。
6.根据权利要求5所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述温度条件为：白天温度为28℃；夜晚温度为20℃。
7.根据权利要求1所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述湿度条件为：白天空气湿度为30％-70％；夜晚空气为60％-90％。
8.根据权利要求7所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述湿度条件为：白天空气湿度为50％；夜晚空气为85％。
9.根据权利要求1-8中任一项所述黄瓜大孢子培养中克服再生植株花打顶的方法，其特征在于：所述黄瓜的品种为北京102、中农26、津优1中的一种或几种。
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