CN102657085A - 一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法 - Google Patents

一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法 Download PDF

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CN102657085A CN2012101437810A CN201210143781A CN102657085A CN 102657085 A CN102657085 A CN 102657085A CN 2012101437810 A CN2012101437810 A CN 2012101437810A CN 201210143781 A CN201210143781 A CN 201210143781A CN 102657085 A CN102657085 A CN 102657085A
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周国英
徐文华
刘卫根
贺丽华
赵晓辉
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Abstract

本发明涉及一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，该方法包括以下步骤：⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经浸泡灭菌、冲洗，即得消毒后的外植体单芽；⑵外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上形成2~3个丛生芽；⑶继代增殖培养：将2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上形成宽叶羌活丛生苗；⑷生根诱导：将宽叶羌活丛生苗分株后转入生根培养基中培养，形成完整再生小苗；⑸育苗基质消毒；⑹植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株。本发明克服了宽叶羌活育苗周期过长、繁殖系数低的问题，易于操作、可进行工厂化快速育苗。

Description

一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养和离体快速繁殖，尤其涉及一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法。
背景技术
羌活是伞形科（Umbelliferae）羌活属（Notopterygium）多年生植物，为我国特有的重要濒危植物，是中、藏、羌药中最常用的药材之一，也是市场缺口较大的中藏药材。宽叶羌活以根状茎及根入药，味辛、性温，有散表寒、祛风湿利关节等功效，主治感冒风湿、发热头痛、皮肤瘙痒、风水浮肿等症。我国历版药典对宽叶羌活均有收载，据《中华人民共和国药典》2005年版一部，为伞形科（Umbelliferae）多年生草本植物羌活（ Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang）和宽叶羌活（ N. forbesii Boissieu）的干燥根茎及根，用药开发历史悠久。依据药材性状一般划分为蚕羌、竹节羌、大头羌和条羌4个商品等级。按产地不同分为川羌（四川）和西羌（青海、甘肃等）。青海是宽叶羌活药材的道地产区，畅销全国并出口，主产果洛、玉树、黄南、海东等地2700~4500米以上的高海拔山区。
羌活药材长期依赖野生采挖来满足国内外市场需求，种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少，宽叶羌活种群遭到了毁灭性破坏，致使其资源已无法满足市场需要。尤其是近年来随着国内外对宽叶羌活需求量的增加，供需矛盾日益突出，加之利益驱使，大量掠夺性采挖，使宽叶羌活逐渐成为濒危植物，面临物种丧失，资源枯竭的危险，进行种质资源保护和扩大宽叶羌活繁育势在必行。
植物组织培养技术是利用细胞的全能性（即个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。），取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义：⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖；⑵便于保持优良生物学特性；⑶在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的宽叶羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。
文献报道了众多高山野生药材的组织培养，如雪莲、红景天等，但以野生宽叶羌活根芽为外植体的组织培养尚未见报道。从野外采集的外植体，其表面滋生大量细菌和真菌等微生物，有的甚至长到组织内部；加之宽叶羌活所含醌类、酚类物质较多，很容易氧化褐变，因此对外植体材料的选择和消毒处理方法都是非常关键。本发明首次采用根芽外植体组织培养方法，开展野生宽叶羌活种质离体繁殖研究工作，这为挽救珍稀濒危宽叶羌活种质资源，开展遗传改良、促进宽叶羌活的工厂化育苗提供了一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种易于操作、可进行大规模工厂化生产的宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗15~30分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌20~30秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.1%~0.2%的升汞中，浸泡灭菌8~13分钟，并用无菌去离子水冲洗3~6次，即得消毒后的外植体单芽；
⑵外植体接种：将所述消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml所述诱导芽分化培养基中接种1棵所述消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25~30天，使根芽基部形成2~3个丛生芽；
⑶继代增殖培养：将所述2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml所述继代增殖培养基中接种1棵所述丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25~35天，形成宽叶羌活丛生苗；
⑷生根诱导：将所述宽叶羌活丛生苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种1棵所述宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养20~30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质；
⑹植株移栽：将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
所述步骤⑴中的宽叶羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物宽叶羌活（ Notopterygium forbesii Boissieu）。
所述步骤⑵中的诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5~20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液2~10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
所述步骤⑶中的继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5~20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液2~10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
所述步骤⑷中的生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸母液5~15ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
所述步骤⑸中的育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
所述大量元素母液是指含有硝酸铵（NH4NO3）1650mg/L，硝酸钾（KNO3）1900mg/L，硫酸镁（MgSO4）370mg/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg/L，氯化钙（CaCl2 . 2H2O）440mg/L的混合液。
所述微量元素母液是指含有硫酸锰（MnSO4 . 4H2O）22.3mg/L，硫酸锌（ZnSO4 . 7H2O）8.6mg/L，硼酸（H3BO3）6.2mg/L，碘化钾（KI）0.83mg/L，钼酸钠（NaMoO4 . 2H2O）0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4 . 5H2O）0.025mg/L，氯化钴（CoCl2 . 6H2O）0.025mg/L的混合液。
所述有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L的混合液。
所述铁盐母液是指含有硫酸亚铁（FeSO4 . 7H2O）27.8mg/L，Na2 . EDTA . 2H2O 37.3 mg/L的混合液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明首次采用根芽外植体通过生物工程技术——组织培养技术进行组织培养，克服了宽叶羌活育苗周期过长（2年）、繁殖系数低的问题；同时开展野生宽叶羌活种质资源离体繁殖研究工作，为挽救珍稀濒危宽叶羌活种质资源，开展遗传改良、促进宽叶羌活的工厂化育苗提供了一条新途径，提供了一种能进行宽叶羌活的人工繁殖、种质资源离体保存、利用及选育药用成分含量高的突变系的组织培养离体繁殖方法。
2、由于本发明所用培养基中含有植物激素6-BA， 6-BA激素属细胞分裂素类，其具有诱导芽分化的主导作用，因此诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，炼苗后可直接成活，易于操作，可进行大规模工厂化生产。
3、本发明利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义：⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖，即启动快；⑵便于保持优良生物学特性，即同步性好；⑶在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的宽叶羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。
具体实施方式
实施例1    一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗15分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌20秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌8分钟，并用无菌去离子水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体单芽。
⑵外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml诱导芽分化培养基中接种1棵消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25天，使根芽基部形成2~3个丛生芽。
诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液5ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液2ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑶继代增殖培养：将2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml继代增殖培养基中接种1棵丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25天，形成宽叶羌活丛生苗。
继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液15ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液2ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑷生根诱导：将宽叶羌活丛生苗长至5~6厘米时分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种1棵宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养20~25天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。
生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸（IBA）母液5ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.5克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质。
其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
⑹植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
实施例2    一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗20分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌25秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.15%的升汞中，浸泡灭菌10分钟，并用无菌去离子水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体单芽。
⑵外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml诱导芽分化培养基中接种1棵消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养28天，使根芽基部形成2~3个丛生芽。
诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液10ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液5ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.5克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑶继代增殖培养：将2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml继代增殖培养基中接种1棵丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养30天，形成宽叶羌活丛生苗。
继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液5ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.5克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑷生根诱导：将宽叶羌活丛生苗长至5~6厘米时分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种1棵宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25~30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。
生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸（IBA）母液10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.5克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质。
其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
⑹植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
实施例3    一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗25分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.2%的升汞中，浸泡灭菌12分钟，并用无菌去离子水冲洗4次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体单芽。
⑵外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml诱导芽分化培养基中接种1棵消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养30天，使根芽基部形成2~3个丛生芽。
诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液15ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉7.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑶继代增殖培养：将2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml继代增殖培养基中接种1棵丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养35天，形成宽叶羌活丛生苗。
继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液15ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液8ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉7.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑷生根诱导：将宽叶羌活丛生苗长至5~6厘米时分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种1棵宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养20~30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。
生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸（IBA）母液15ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.5克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质。
其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
⑹植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
实施例4    一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗30分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.2%的升汞中，浸泡灭菌13分钟，并用无菌去离子水冲洗6次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体单芽。
⑵外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml诱导芽分化培养基中接种1棵消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养30天，使根芽基部形成2~3个丛生芽。
诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液2ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑶继代增殖培养：将2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml继代增殖培养基中接种1棵丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养30~35天，形成宽叶羌活丛生苗。
继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液5ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸（NAA）母液10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑷生根诱导：将宽叶羌活丛生苗长至5~6厘米时分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种1棵宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养20~30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。
生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸（IBA）母液12ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质。
其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
⑹植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
上述实施例1~4中的宽叶羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物宽叶羌活（ Notopterygium forbesii Boissieu）；超净工作台，型号为BCM-1000A，由苏州安泰空气技术有限公司生产。
诱导芽分化培养基、继代增殖培养基、生根培养基中大量元素母液是指含有硝酸铵（NH4NO3）1650mg/L，硝酸钾（KNO3）1900mg/L，硫酸镁（MgSO4）370mg/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg/L，氯化钙（CaCl2 . 2H2O）440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸锰（MnSO4 . 4H2O）22.3mg/L，硫酸锌（ZnSO4 . 7H2O）8.6mg/L，硼酸（H3BO3）6.2mg/L，碘化钾（KI）0.83mg/L，钼酸钠（NaMoO4 . 2H2O）0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4 . 5H2O）0.025mg/L，氯化钴（CoCl2 . 6H2O）0.025mg/L的混合液；有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L的混合液；铁盐母液是指含有硫酸亚铁（FeSO4 . 7H2O）27.8mg/L，Na2 . EDTA . 2H2O 37.3 mg/L的混合液。

Claims (10)

1.一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
⑴外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经流水冲洗15~30分钟，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌20~30秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.1%~0.2%的升汞中，浸泡灭菌8~13分钟，并用无菌去离子水冲洗3~6次，即得消毒后的外植体单芽；
⑵外植体接种：将所述消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上，其中每25ml所述诱导芽分化培养基中接种1棵所述消毒后的外植体单芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25~30天，使根芽基部形成2~3个丛生芽；
⑶继代增殖培养：将所述2~3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml所述继代增殖培养基中接种1棵所述丛生芽；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养25~35天，形成宽叶羌活丛生苗；
⑷生根诱导：将所述宽叶羌活丛生苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种1棵所述宽叶羌活丛生苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1的条件下培养20~30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；
⑸育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质；
⑹植株移栽：将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
2.如权利要求1所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤⑴中的宽叶羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物宽叶羌活。
3.如权利要求1所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤⑵中的诱导芽分化培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5~20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液2~10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
4.如权利要求1所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤⑶中的继代增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5~20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液2~10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
5.如权利要求1所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤⑷中的生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的吲哚丁酸母液5~15ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mM NaOH溶液调整pH值至5.8，最后加入琼脂粉6.0~8.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
6.如权利要求1所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤⑸中的育苗基质的总孔隙度为70%~75%，有机质含量为20%。
7.如权利要求3、4或5所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述大量元素母液是指含有硝酸铵1650mg/L，硝酸钾1900mg/L，硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，氯化钙440mg/L的混合液。
8.如权利要求3、4或5所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述微量元素母液是指含有硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，硼酸.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L的混合液。
9.如权利要求3、4或5所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L的混合液。
10.如权利要求3、4或5所述的一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于：所述铁盐母液是指含有硫酸亚铁27.8mg/L，Na2 . EDTA . 2H2O 37.3 mg/L的混合液。
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