CN102613089B - 一种二十年生木荷大树高效离体繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种二十年生木荷大树高效离体繁殖方法，采用二十年生木荷大树上生长的腋芽茎段为外植体，经消毒灭菌后，接种于启动培养基中，先放置于黑暗条件下培养7-12d，再放置于普通日光灯下，每日光照16h，温度23-25℃、湿度50％-60％，培养40d分化长成试管芽苗；将长成的试管芽苗剪切、转接于经高压灭菌的增殖培养基中进行增殖培养，然后再将增殖的试管芽苗剪切后接种于经高压灭菌的壮苗培养基中进行壮苗培养，32d后剪除基部愈伤组织和部分叶片，保留3-4片叶片，接种于经高压灭菌的生根培养基中进行生根培养12-15d，取出清洗，移栽到含有泥炭、黄心土、珍珠岩的混合基质中，其体积比为泥炭∶黄心土∶珍珠岩＝2∶1∶1，25d后生根成活，生根率达96％以上。
Description
技术领域
本发明涉及植物离体组织培养快速繁殖的方法，具体为二十年生木荷大树的高效离体组培快繁方法。
背景技术
木荷(Schima superba)属山茶科木荷属，为亚热带地带性常绿大乔木，作为速生景观防火特色树种广泛分布于南方12个省区。木荷生长迅速，少病虫害，对土壤条件要求不严，耐早力强，同时树冠浓密，叶片厚革质、含水量大、含油脂少、燃点较高、萌芽力强，是南方生物防火林带构建的当家树种和优良的高抗生态防护树种(70％以上的生物防火林带和大量的生态防护林由木荷构建而成)；木荷树干端直，木材坚重致密，结构均匀，力学性质良好，是木地板、木制家具、木制玩具、木制工艺品等优质木制工艺用材树种，如浙江70％的木制玩具用材都来自木荷。大径阶木荷工艺材销价在1500元／m3以上。木荷已列为国家林业局珍贵用材发展名录；木荷栽培容易、早期速生，宜与杉木、马尾松等混交培育大径阶优质用材，是杉木、马尾松二代迹地更新的优良替代树种，广为南方各省重视和喜爱，每年用种量都达到数万kg，是亚热带地区第一大珍贵优质阔叶用材造林树种。
国内外学者对该树种开展了一系列的研究工作，如有良种选育、播种、组织培养育苗，生物防火机理、防火林带构建配套等技术。在现有繁殖技术中，组织培养的方法已有报道，但报道中研究对象为种子、二至十年生树木顶芽和嫩枝茎段，采用原有方法对江苏省林业科学研究院种源试验林的二十年生大树开展组织培养研究未能成功。原因是利用原有方法培养时，发现外植体启动培养困难、增殖系数偏低、容易发生褐变和玻璃化苗、生根率低等问题。说明原方法对二十年生木荷大树进行组织培养的关键技术环节有明显缺陷。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适合木荷大树的高效离体组培快繁方法，为优良品种选育、良种规模化繁殖提供技术支撑。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种二十年生木荷大树的高效离体繁殖方法，按下列步骤进行：
(1)：准备基本培养基
每升基本培养基中含有：四水硝酸钙371-556mg，硝酸铵268-400mg，硫酸钾600-900mg，七水硫酸镁248-370mg，磷酸二氢钾115-170mg，二水氯化钙70-96mg，四水硫酸锰22.5mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁41.0mg，乙二胺四乙酸钠56.0mg，维生素B11.0mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇90mg，蔗糖20000mg，卡拉胶6500mg。
(2)：外植体的接种
采用经选育的二十年生木荷优良单株腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒20-30s，再用添加Tween-201-2滴／100ml的0.1％的升汞溶液消毒9-13min，用无菌水冲洗3-5次，作为外植体进行培养；
(3)：芽苗培养
在超净的工作台上，无菌条件下，将外植体接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，先将其置于黑暗条件下7-12d后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日光照16h，温度23-25℃、湿度为50％-60％，培养40d，分化长成试管芽苗。
所述的启动培养基由以下重量含量的原料组成：
每升基本培养基含：
玉米素(zT)0.5-1.5mg；
6-苄基嘌呤(BA)1.0-2.5mg；
吲哚丁酸(IBA)0.01-0.1mg；
(4)：增殖培养
将上述(3)步中长成的芽苗，剪切转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中进行增殖培养，不断增殖，视繁殖规模达1000瓶进入下一步。
所述的增殖培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(zT)1.0-1.5mg；
6-苄基嘌呤1.5-2.5mg；
吲哚丁酸(IBA)0.01-0.05mg；
柠檬酸(Citric acid)80-100mg；
(5)：壮苗培养
将(4)中培养的试管芽苗，剪切接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中进行壮苗培养，32d后进入下一步。
所述的壮苗培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(zT)0.5-1.0mg；
6-苄基嘌呤1.0-1.5mg；
吲哚丁酸(IBA)0.05-0.1mg；
柠檬酸(Citric acid)80-100mg。
(6)：生根培养
将(5)步中的试管壮苗，剪除基部愈伤组织和部分叶片，保留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根培养基的培养瓶中进行生根培养12-15d。
所述的生根培养基为：
每升基本培养基含：
α-萘乙酸(NAA)0.3-0.5mg；
吲哚丁酸(IBA)0.5-1.0mg；
柠檬酸(Citric acid)100-150mg；
硝酸镧(La(NO3)3·6H2O)8-10mg。
(7)：移栽
将(6)步生长的带根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭、黄心土、珍珠岩体积比为泥炭：黄心土：珍珠岩=2：1：1的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度85％以上，前10d遮光70％，后逐渐见光，25d后生根成活，生根率达96％以上，50d左右，全光照。
上述二十年生木荷大树高效离体繁殖方法，所有培养基其pH值均调至5.8左右，所述的基本培养基配方见表1。
表1每升基本培养基中含有物质种类和质量
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg／L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 371-556 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 268-400 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 600-900 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248-370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 115-170 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 70-96 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 41.0 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 56.0 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 90 |
| 蔗糖 | 20000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
本发明的有益效果是：本发明的二十年生木荷大树高效离体繁殖方法，能保持优选大树优良性状，离体组织培养启动速度快、可以有效控制玻璃化苗产生和褐变的发生、生根率高、繁殖速度快，在短期内生产大量优质种苗，促进优良品种推广应用。
具体实施方式
实施例1
二十年生木荷大树高效离体繁殖方法所用的基本培养基配方如表2
表2每升基本培养基中含有物质种类和质量
| 化学名称 | 中文名称 | mg／L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 371 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 268 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 600 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 115 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 70 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 41.0 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 56.0 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 90 |
| 蔗糖 | 20000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
启动培养基：每升基本培养基+zT0.5mg+BA2.5mg+IBA0.01mg；
增殖培养基：每升基本培养基+zT1.0mg+BA2.5mg+IBA0.01mg+柠檬酸80mg；
壮苗培养：每升基本培养基+zT0.5mg+BA1.5mg+IBA0.05mg+柠檬酸80mg；
生根培养：每升基本培养基+NAA0.3mg+IBA1.0mg+柠檬酸100mg+硝酸镧8mg。
将上述启动培养基注入培养瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1Kg／cm2)20min，待用。
1、采用经选育的二十年生木荷优良单株腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒20-30s，再用添加Tween-201-2滴／100mg的0.1％的升汞溶液消毒9-13min，用无菌水冲洗3-5次，作为外植体进行培养；
2、在超净的工作台上，无菌条件下，将外植体接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，先将其置于黑暗条件下7-12d后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-2000lx下，每日光照16h，温度23-25℃、湿度为50％-60％，培养40d，分化长成试管芽苗；
3、将从步骤2中长成的芽苗，剪切、转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中进行增殖培养，不断增殖，一个周期32d的繁殖倍数为4.2，生长高度达3.6cm，视繁殖规模需要达1000瓶时进入下一步；
4、将步骤3中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中进行壮苗培养，32d后进入下一步；
5、将步骤4中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，按步骤2接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养的培养基的培养瓶中，进行生根培养12-15d；
6、将步骤5中生长的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含泥炭：黄心土：珍珠岩为2：1：1的混合基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，前10d遮光70％，后逐渐见光，25d后生根成活，生根率达96.2％，50d左右，全光照，可实现规模化生产。
实施例2
本实施例按实施例1的步骤进行操作，只是培养基的重量配比和原料组分不同，本实施例所用的基本培养基配方如表3，培养后生根率为96.8％。
表3每升基本培养基中含有物质种类和质量
| 化学名称 | 中文名称 | mg／L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 556 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 400 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 900 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 170 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 96 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 41.0 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 56.0 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素B1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛B6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 90 |
| 蔗糖 | 20000 |
| 卡拉胶 | 6500 |
启动培养基：每升基本培养基+ZT1.0mg+BA1.0mg+IBA0.1mg；
增殖培养基：每升基本培养基+ZT1.5mg+BA1.5mg+IBA0.05mg+柠檬酸100mg；
壮苗培养：每升基本培养基+ZT1.0mg+BA1.0mg+IBA0.1mg+柠檬酸100mg；
生根培养：每升基本培养基+NAA0.5mg+IBA0.5mg+柠檬酸150mg+硝酸镧10mg。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种二十年生木荷大树高效离体繁殖方法，其特征是按下列步骤进行：
(1)、准备基本培养基，每升基本培养基中含有：四水硝酸钙371-556mg，硝酸铵268-400mg，硫酸钾600-900mg，七水硫酸镁248-370mg，磷酸二氢钾115-170mg，二水氯化钙70-96mg，四水硫酸锰22.5mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁41.0mg，乙二胺四乙酸钠56.0mg，维生素B11.0mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇90mg，蔗糖20000mg，卡拉胶6500mg ;
(2)、采用经选育的二十年生木荷大树优良单株的腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒20-35s，再用添加1-2滴吐温20／100ml的0.1％的升汞溶液灭菌9-13min，用无菌水冲洗3-5次；
(3)、在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，先将其置于黑暗条件下7-12d后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日光照16h，温度23-25℃、湿度为50％-60％，培养40d，分化长成试管芽苗；
所述的启动培养基为：每升基本培养基含：玉米素0.5-1.5mg、6-苄基嘌呤1.0-2.5mg和吲哚丁酸0.01-0.1mg；
(4)、将从(3)步中长成的芽苗，剪切，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中进行增殖培养，不断增殖，视繁殖规模达1000瓶进入下一步；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基含：玉米素1.0-1.5mg、6-苄基嘌呤1.5-2.5mg、吲哚丁酸0.01-0.05mg和柠檬酸80-100mg；
(5)、将(4)步中培养的试管芽苗，剪切、接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中进行壮苗培养，32d后进入下一步；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基含：玉米素0.5-1.0mg、6-苄基嘌呤1.0-1.5mg、吲哚丁酸0.05-0.1mg和柠檬酸80-100mg；
(6)、将(5)步中的试管壮苗，剪除基部愈伤组织和部分叶片，保留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根培养基的培养瓶中，进行生根培养12-15d；
所述的生根培养基为：每升基本培养基含：α-萘乙酸0.3-0.5mg、吲哚丁酸0.5-1.0mg、柠檬酸100-150mg和硝酸镧8-10mg；
(7)、将(6)步中生长的带有根的小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭、黄心土、珍珠岩体积比为泥炭：黄心土：珍珠岩=2：1：1的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度85％以上，前10d遮光70％，后逐渐见光，25d后生根成活，生根率达96％以上，50d左右，全光照。
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