CN103168692B - 一种灌木柳组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灌木柳组织培养方法，包括以下步骤：(1)选材及消毒处理；(2)试管苗培养；(3)增殖、生根培养；(4)炼苗和移栽。本发明所述的一种灌木柳组织培养方法具有繁殖效率高，占用空间小，不受季节及外界环境的限制，需要母体材料少，能够在短期内提供大量优质苗木。此外，灌木柳高效组培再生体系的成功建立，对其生物学研究、遗传改良和多目标分子育种等工作的开展均具有重要意义。

Description

一种灌木柳组织培养方法

技术领域

本发明涉及柳树的繁育方法，具体地说是涉及灌木类柳树的组织培养方法。 

背景技术

柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)植物的通称，全世界共有526种，主要分布在北半球温带地区。中国有257种，120个变种和33个变型，其中绝大多数为灌木柳。灌木柳分布广、生长快、产量高、热值高、抗逆性强、易于更新以及木材用途广泛，是防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成树种，也是备受关注的能源树种。特别是灌木柳种类及其杂交的家系间、无性系间都存在着非常丰富的遗传变异，因此进行速生、高生物量、耐盐碱、抗病虫害良种选育具有丰富的遗传基础。 

灌木柳的常规繁殖以扦插为主，不同种柳树插条生根能力除了由遗传因素决定以外，还受到插条年龄、粗度、木质化程度、有无生长叶或活动芽等指标的影响，特别是繁殖时间有严格的季节限制。灌木柳还可用播种育苗进行繁殖，但其种子较小，宜随采随播，且不能保持良种原有的优良特性。组织培养技术是目前林业生物技术的主要内容之一，其主要用途是林木的大规模繁殖和分子育种。该技术的优点在于繁殖效率高，占用空间小，不受季节及外界环境的限制，需要母体材料少，能够在短期内提供大量优质苗木。此外，灌木柳高效组培再生体系的成功建立，对其生物学研究、遗传改良和多目标分子育种等工作的开展均具有重要意义。 

本专利所应用的3种灌木柳材料为江苏省林业科学研究院遗传育种研究所杂交培育的高生物量杂种无性系2345、2367、1065，其中2345具有较强的耐盐性。其来源见下表： 

表1.3种灌木柳无性系及其来源 

发明内容

本发明的目的在于提供一种取材容易、增殖速度快、繁殖系数高、继代周期短的灌木柳组织培养繁殖方法，并为灌木柳多目标分子育种提供良好的实验体系。 

本发明是通过以下技术方案来实现的： 

一种灌木柳组织培养方法，包括以下步骤： 

(1)取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，置于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体； 

(2)将步骤(1)所选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次。 

(3)将步骤(2)中经消毒处理的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，培养15天，长成6～8cm高的无菌试管苗； 

(4)将步骤(3)中的试管苗，剪切成1.5～2.0cm带有1～2个腋芽的节段，转接于含有增殖培养基的培养瓶中进行增殖培养，培养20天既为一个继代周期，增殖系数为4～6倍；在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，可以省去专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率达100％，直接进入下一步骤； 

(5)将步骤(4)中的生根瓶苗开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率大于98％。 

以上步骤(2)～(4)消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为：温度26± 2℃，光照2000Lx，光照时间16h/d，相对湿度65％～75％。 

所述方法的步骤(3)诱导培养基为WPM基本培养基+0.4mg/L6-BA+0.1mg/L GA₃+500mg/L CH+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+6.3g/L卡拉胶，pH值为5.7～5.8。 

所述方法的步骤(4)增殖培养基为WPM基本培养基+0.6mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+500mg/L CH+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+6.3g/L卡拉胶，pH值为5.7～5.8。 

所述方法的步骤(5)移栽基质的配方为泥炭：黄心土，体积比为1：1。 

进一步，所述的WPM基本培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下： 

本发明的有益效果是： 

本发明以灌木柳嫩茎为外植体，利用其专用培养基，成功建立了一个灌木柳组织培养高效再生体系，为灌木柳快速繁殖提供了一种可参照的技术和方法，同时为开展柳树遗传改良工作奠定了基础。本发明具有以下优点： 

1、繁殖效率高：采用本发明组织培养方法，灌木柳杂种无性系15～20天增殖倍数达到4～6倍，与常规的组织培养方法相比，省去了壮苗、生根两个阶段，生长时间缩短了一半。 

2、苗木质量好：本发明方法配方组分简单，幼苗生长健壮。不易玻璃化，生根率100％，移栽成活率大于98％，成苗一致性好。 

3、便于良种保存及开展遗传改良研究：与扦插繁殖相比，本发明方法节约占地空间，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，继代周期短，无病虫害困扰，更加适合用于灌木柳良种保存以及快速高效的进行灌木柳多目标育种。 

综上所述：本发明所述的一种灌木柳组织培养方法具有操作简便、繁殖系数高、育苗周期短、苗木质量好、不受时间及外界条件限制等优点，在柳树苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。 

具体实施方式

下面将结合具体实例，详细说明本发明的具体实施方式： 

实例1 

基本培养基的配置： 

基本培养基为WPM培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵(NH₄NO₃)400mg/L、硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)556mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)96mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L、硫酸钾(K₂SO₄)990mg/L； 

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2mg/L、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/L、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L； 

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8mg/L； 

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸(Gly)2mg/L、盐酸硫胺素(VB₁)1mg/L、盐酸吡哆醇(VB₆)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L。 

利用上述的基本培养基配置诱导培养基、增殖(生根)培养基。 

其中，诱导培养基：每升基本培养基+0.2mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.1mg赤霉素(GA₃)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

增殖、生根培养基：每升基本培养基+0.6mg6-苄基腺嘌呤(6-BA+0.05mg萘乙酸(NAA)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM²。 

灌木柳组织培养快繁方法，按以下步骤进行： 

(1)选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，置于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次。 

(2)试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤(1)中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，培养15天，长成6～8cm的无菌试管苗； 

(3)增殖、生根培养：将步骤(2)中长成的试管苗，剪切成长度为1.5～2.0cm带有1～2 个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26士2℃，相对湿度65％～75％，在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率为100％，一个周期20天的繁殖倍数为4～6倍，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤； 

(4)炼苗和移栽：将步骤(3)中株高达6～8cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1：1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率达99.2％。 

实例2 

基本培养基的配置： 

基本培养基为MS培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg/L、硝酸钾(KNO₃)1900mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)440mg/L； 

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2mg/L、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L； 

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8mg/L； 

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸(Gly)2mg/L、盐酸硫胺素(VB₁)1mg/L、盐酸吡哆醇(VB₆)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L。 

利用上述的基本培养基配置诱导培养基、增殖(生根)培养基。 

其中，诱导培养基：每升基本培养基+0.2mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.1mg赤霉素(GA₃)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

增殖、生根培养基：每升基本培养基+0.6mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg萘乙酸(NAA)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM²。 

灌木柳组织培养快繁方法，按以下步骤进行： 

(1)选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，置于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次。 

(2)试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤(1)中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，培养20天，长成5～6cm长的无菌试管苗； 

(3)增殖、生根培养：将步骤(2)中长成的试管苗，剪切成长度为1.5～2.0cm带有1～2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率为92.5％，一个周期20天的繁殖倍数为3～4倍，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤； 

(4)炼苗和移栽：将步骤(3)中株高达6～8cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1：1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率达99％。 

实例3 

基本培养基的配置： 

基本培养基为1/2MS培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵(NH₄NO₃)825mg/L、硝酸钾(KNO₃)950mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)85mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)185mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)220mg/L； 

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2mg/L、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L； 

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8mg/L； 

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸(Gly)2mg/L、盐酸硫胺 素(VB₁)1mg/L、盐酸吡哆醇(VB₆)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L。 

利用上述的基本培养基配置诱导培养基、增殖(生根)培养基。 

其中，诱导培养基：每升基本培养基+0.2mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.1mg赤霉素(GA₃)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

增殖、生根培养基：每升基本培养基+0.6mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg萘乙酸(NAA)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM²。 

灌木柳组织培养快繁方法，按以下步骤进行： 

(1)选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，置于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次。 

(2)试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤(1)中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，培养20天，长成4～5cm长的无菌试管苗； 

(3)增殖、生根培养：将步骤(2)中长成的试管苗，剪切成长度为1.5～2.0cm带有1～2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率为94.2％，一个周期20天的繁殖倍数为2～3倍，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤； 

(4)炼苗和移栽：将步骤(3)中株高达6～8cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1：1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率达98.3％。 

实例4 

基本培养基的配置： 

基本培养基为WPM培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵(NH₄NO₃)400mg/L、硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)556mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)96mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L、硫酸钾(K₂SO₄)990mg/L； 

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2mg/L、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L； 

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8mg/L； 

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸(Gly)2mg/L、盐酸硫胺素(VB₁)1mg/L、盐酸吡哆醇(VB₆)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L。 

利用上述的基本培养基配置诱导培养基、增殖(生根)培养基。 

其中，诱导培养基：每升基本培养基+0.5mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+500mg酸水解酪蛋白(CH)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

增殖、生根培养基：每升基本培养基+0.6mg6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg萘乙酸(NAA)+1g活性炭+30g蔗糖+6.3g卡拉胶，pH值为5.7～5.8； 

将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM²。 

灌木柳组织培养快繁方法，按以下步骤进行： 

(1)选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，至于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次。 

(2)试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤(1)中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26士2℃，相对湿度65％～75％，培养18天，长成3～4cm长的无菌芽苗； 

(3)增殖、生根培养：将步骤(2)中长成的试管苗，剪切成长度为1.5～2.0cm带有1～2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26士2℃，相对湿度65％～75％，在该培养基中同时可获得健壮的 生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率为100％，一个周期20天的繁殖倍数为3～4倍，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤； 

(4)炼苗和移栽：将步骤(3)中株高达6～8cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1：1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率达98.7％。 

以上以较佳实例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或等效变换方式获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种灌木柳组织培养方法，其培养步骤如下： 

(1)选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的1～2年生灌木柳枝条，摘除老叶，置于室温下水培7天，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体，然后将所选取的外植体剪切成2～4cm长的带芽茎段，经70％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒5分钟，最后用无菌水冲洗5次； 

(2)试管苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤(1)中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，光照强度为1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，培养15天，长成6～8cm的无菌试管苗； 

(3)增殖、生根培养：将步骤(2)中长成的试管苗，剪切成长度为1.5～2.0cm带有1～2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，每日光照时间为16小时，温度26±2℃，相对湿度65％～75％，在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段，生根率为100％，一个周期20天的繁殖倍数为4～6倍，直至达到所需要的繁殖生产规模时进入下一步骤； 

(4)将步骤(3)中株高达6～8cm、根系发达且叶片展开的再生植株开瓶培养2天进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1：1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75％～85％，适当遮荫，培养15～20天至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率达99.2％； 

所述的诱导培养基为：每升WPM基本培养基+0.2mg6-苄基腺嘌呤+0.1mg赤霉素+500mg酸水解酪蛋白+1000mg活性炭； 

所述的增殖培养基为：每升WPM基本培养基+0.6mg6-苄基腺嘌呤+0.05mg萘乙酸+500mg酸水解酪蛋白+1000mg活性炭。 

2.根据权利要求1所述的灌木柳组织培养方法，其特征在于：步骤(1)中的带芽茎段为带有顶芽或腋芽且长度为2～4cm的茎段。 

3.根据权利要求1所述的灌木柳组织培养方法，其特征在于：WPM基本培养基由常量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成。 

4.根据权利要求3所述的灌木柳组织培养方法，其特征在于：所述WPM基本培养基中， 

所述的常量元素为：NH₄NO₃400mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O556mg/L、CaCl₂·2H₂O96mg/L、MgSO₄·7H₂O370mg/L、KH₂PO₄170mg/L、K₂SO₄990mg/L； 

所述的微量元素为：MnSO₄·H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、 CoCl₂ ·6H₂O 0.025mg/L； 

所述的铁盐为：Na₂·EDTA37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O27.8mg/L； 

所述的有机成分为：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L。