CN102550406A

CN102550406A - 一种诱导杨树愈伤组织分化的方法及分化培养基

Info

Publication number: CN102550406A
Application number: CN2011104409432A
Authority: CN
Inventors: 安新民; 李英; 李�昊; 季乐翔
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种诱导杨树愈伤组织分化的培养基和诱导杨树愈伤组织分化的方法，本发明所优化的愈伤组织分化培养基是：添加0.6-1.0mg/L BAP、0.1-0.5mg/LNAA、0-02mg/L GA₃、20-40g/L蔗糖和4.5-6.5g/L琼脂的MS固体培养基。使用本发明的愈伤组织分化培养基可提高杨树愈伤组织的分化率和杨树的遗传转化率，可以在短期内形成大量优良的杨树试管苗，可进行规模化、工厂化生产，解决了杨树生产中所存在的问题。

Description

一种诱导杨树愈伤组织分化的方法及分化培养基

技术领域

本发明涉及一种植物组培的方法，特别涉及一种诱导杨树愈伤组织分化的方法及分化培养方法，属于植物组织培育育种领域。

背景技术

北京杨(Populus beijingensis)为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点，是优良的用材林、防护林、行道树和“四旁”绿化树种，深受群众喜爱。主要分布于中国的华北和西北等地区。

杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将其进行加倍成为双单倍体(doubled haploids，DHs)，这样就明显的缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。

目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。愈伤组织培养是一种最常见的培养方式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种植物组织培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生植株。此外愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。愈伤组织分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织是指体细胞胚的愈伤组织，经过分化成幼嫩的植株。

在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是，以杨树为外植体进行花药愈伤组织培养过程中存在愈伤组织诱导率低、愈伤组织器官分化率低的问题，使得植物单倍体远远不能满足研究者们的需求，因此，愈伤组织器官分化率低成为制约杨属植物育种的瓶颈，提高杨属植物愈伤组织的器官分化率至关重要。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述杨树愈伤组织分化培养方法中存在的技术问题提供一种新的诱导杨树愈伤组织分化的方法和分化培养基，利用本发明分化培养基诱导杨树愈伤组织分化，杨树愈伤组织的分化率高，并且器官分化的不定芽的质量好，生根率高，在较短时间内形成大量优良的杨树单倍体试管苗，可进行规模化、工厂化生产。

为实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明一方面提供一种优化的诱导杨树愈伤组织分化的培养基，所述培养基的组成是：MS培养基+0.6-1.0mg/L BAP+0.1-0.5mg/L NAA+0-0.2mg/L GA₃+20-40g/L蔗糖+4.5-6.5g/L琼脂；优选为：MS培养基+BAP 0.6mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+GA₃0.02-0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L；进一步优选为：MS培养基+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L。

特别是，所述分化培养基的pH为5.8，呈弱酸性。

其中，所述杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)；所述杨树愈伤组织优选为北京杨的花药愈伤组织。

本发明另一方面提供一种诱导杨树愈伤组织分化的方法，包括将杨树愈伤组织接种于上述优化的分化培养基中进行分化培养，直至分化生长出不定芽。

其中，所述杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)；所述杨树愈伤组织为北京杨的花药经过愈伤组织诱导培养而成花药愈伤组织。

特别是，所述愈伤组织按照如下顺序进行的步骤制备而成：

1)从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体；

2)将无菌花药接种在愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得所述的愈伤组织。

为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率；其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，这些方法或手段均为本领域技术人员所通晓；本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。

以单核靠边期的花药为外植体，诱导得到的愈伤组织生长速度快，呈黄色或褐色，表面粗糙，质地疏松易碎，具有较高的活力。

由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤1)中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果：

1-A)用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽；

1-B)用酒精浸泡花芽；

1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗；

1-D)吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。

优选地，步骤1-A)中无菌水冲洗次数为4-5次；步骤1-B)中所述酒精的体积百分比浓度为70.0％；浸泡时间为30s；步骤1-C)中次氯酸钠的质量百分比浓度为7.0％；表面灭菌时间为5min；无菌水冲洗次数为3-5次。

步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基可以是诱导杨树愈伤组织时所公开的任何一种杨树愈伤组织诱导培养基，这些杨树愈伤组织诱导培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开；为了达到更好的效果，所述的愈伤组织诱导培养基优选是：H基本培养基+NAA 0.5-1.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L；更优选为：H基本培养基+NAA 0.5-1.0mg/L+KT 0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L；最优为：H基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。

此外，步骤2)中所述愈伤组织诱导培养优选在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为25±1℃。

所述分化培养优选在以下条件下进行：培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间16小时/天。

本发明为了提高杨树愈伤组织分化培养过程中愈伤组织分化率较低的问题，本发明对愈伤组织分化培养基的配方进行了优化，最终筛选得到了最适宜的不定芽分化培养基组成，显著提高了杨树愈伤组织器官分化率，最终提高了杨树单倍体的得率，为杨树的育种、品质改良、遗传研究等提供了物质基础。

本发明北京杨花药愈伤组织分化得到的不定芽生根培养，获得杨树试管苗的生根率高，试管小苗生长健壮、繁殖系数高，并且试管小苗移栽成活率高达92.0％，是工厂化、大规模生产北京杨植株的简便、快捷的技术体系，为杨树品质改良和新品种选育提供了有力的手段。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验材料

1、供试材料：北京杨(Populus beijingensis)

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(BAP)、6-糠氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA₃)。

3、培养基的配制：

(1)“MS基本培养基”的组成及配制方法：

表1 MS培养基(Murashige and Skoog，1962)

以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述MS培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取1.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至5.8。

(2)“H培养基”的组成及配制方法：

表2 H培养基

以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述H培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取1.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至5.5。

(3)N₆基本培养基的组成及配制方法：

表3 N₆培养基(北京植物所，黑龙江农业科学院，1974)

以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述N₆培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取1.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至5.8。

(4)愈伤组织诱导培养基：H基本培养基+NAA 0.5-1.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4.5-6.5g/L，调节pH值为6.0，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。

(5)不定芽生根培养基配方为：1/2MS基本培养基+IBA0.2-0.5mg/L蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.0，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。

实施例1 制备北京杨花药愈伤组织

1、离体培养的花药及小孢子的合适发育时期

剪取带有饱满花芽的北京杨花枝于室温25℃下水培数日。将杨树花芽放在载玻片上，剥出花药，然后采用醋酸洋红染色，显微镜镜检观察小孢子的发育时期，以确定花粉发育时期。本试验选取小孢子处于单核靠边期的花药进行接种，研究结果表明此时正是花药培养的最佳时期。

2、外植体消毒

将处于单核靠边期的花芽从柔荑花序上取下，先用毛笔轻刷北京杨花芽鳞片的表面，将外表的污物、细菌等去掉，提高消毒效果，接着无菌水冲洗5次，滤纸吸干水分。

将外植体置于超净工作台上，用体积百分比浓度为70.0％的酒精浸泡花芽30s，接着用质量百分比浓度为7.0％的次氯酸钠溶液中进行表面消毒5分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，取出花芽。

在解剖镜下将花芽的鳞片剥去，取花序中部的花药，接种于培养皿中，用保鲜膜封口，进行暗培养，每个培养皿接种30个花药，每个处理重复5次。培养条件：黑暗条件，培养温度25±1℃。

3、愈伤组织诱导培养

将花药接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，培养条件：黑暗条件下，培养温度为25±1℃，培养35天后统计花药愈伤组织数量，培养120天后计算愈伤组织诱导率为30％，其中，愈伤组织诱导培养基为：H+NAA 0.5-1.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L，pH 5.5；花药接种35天左右，在该培养基中观察到有愈伤组织的形成，愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面呈颗粒状，生长缓慢。此后在诱导培养基中相继观察到有愈伤组织的形成，培养至120天后愈伤组织极少再形成。

本发明中愈伤组织诱导培养基除了上述H+NAA 0.5-1.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L之外，其他诱导培养基如H+2，4-D 0.5-1.5mg/L+BAP0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L；MS+2，4-D 0.5-1.5mg/L+BAP0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L等也适用于本发明的杨树花药愈伤组织诱导培养。

实施例2 愈伤组织器官分化培养

1、愈伤组织器官分化培养基的筛选

将培养35天左右，直径约为3mm的北京杨花药愈伤组织分别接种到MS、H和N₆三种基本培养基中，每种基本培养基中添加1.0mg/L NAA和0.2mg/L BAP，蔗糖20g/L，琼脂5.5g/L，pH5.8。每个培养瓶接种1个愈伤组织，每个处理重复10次。培养条件：培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间16小时/天；培养20天后开始统计各处理分化形成的不定芽数，计算出不定芽分化率，统计和计算结果如表4所示。

表4 不同培养基对愈伤组织诱导分化的效果

试验结果表明：

1)采用MS培养基，杨树花药愈伤组织的器官不定芽分化率高，达到100.0％。

2)北京杨花药愈伤组织接种在MS培养基中，在接种7天左右，花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周后在愈伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，但是后期观察到不定芽抽茎困难，茎部短缩；

接种于H培养基的花药愈伤组织在接种7天左右，花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，30天后在愈伤组织表面看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，但是后期观察到不定芽抽茎困难，茎部短缩；

接种于N₆培养基的花药愈伤组织在接种7天左右，花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，50在愈伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，但是后期观察到不定芽抽茎困难，茎部短缩。

3)由上表可见，MS培养基中的愈伤组织分化速度快，分化率高，植株生长状态良好。H和N₆培养基类型中的愈伤组织分化较慢，培养周期较长，且分化率较低，因此，本发明中MS培养基适合于北京杨愈伤组织的器官分化培养。

2、愈伤组织器官分化培养基激素种类的筛选

根据筛选的MS基本培养基，筛选不同的激素种类。

将培养35天后，直径约为3mm的北京杨花药愈伤组织分别接种于添加不同激素种类和浓度的MS培养基中，添加不同激素种类和浓度的MS培养基如表5所示。

表5 含有不同激素的MS培养基

每种培养基中添加蔗糖20g/L，琼脂5.5g/L，pH5.8。每个培养皿接种1个花药愈伤组织，每个处理重复3次。培养条件：黑暗条件，培养温度25±1℃，培养20天后统计各处理分化形成的不定芽数，计算出愈伤组织不定芽分化率，统计和计算结果如表6。

表6 不同激素种类对愈伤组织不定芽分化的影响

试验结果表明：

1)激素BAP、NAA与GA₃的组合对花药愈伤组织器官分化率最高，达到100.0％，且能得到抽茎后的无根苗。

2)北京杨花药愈伤组织在同时添加了激素种类BAP、NAA与GA₃的MS基本培养基中的分化效率好，杨树花药愈伤组织在接种7天左右，逐渐由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周左右在愈伤组织表面可以看到绿色的突起芽点，接着叶片伸展出来，然后抽茎，20天左右不定芽生长高度可达1.5～2cm。

3、愈伤组织器官分化培养基激素浓度筛选

根据筛选的基本培养基和激素种类，筛选激素的配比。

将培养35天左右，直径约为3mm的北京杨花药愈伤组织分别接种于添加不同浓度的BAP、NAA、GA₃的MS培养基中，并且每种培养基中添加蔗糖20g/L，琼脂5.5g/L，pH5.8。每个培养皿接种1个愈伤组织，每个处理重复5次。培养条件：黑暗条件，培养温度25±1℃，培养20天后开始统计各处理愈伤组织数分化的不定芽数，计算出愈伤组织不定芽分化率，统计和计算结果如表7所示。

表7 不同激素组合对愈伤组织不定芽分化的影响

试验结果表明：

1)含有BAP和NAA的不同分化培养基对杨树花药愈伤组织具有一定的分化能力，但根据分化率、不定芽的数量和质量，以及不定芽的抽茎，茎段生长等方面综合考虑，确定MS+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8的培养基为杨树花药愈伤组织不定芽分化培养基，杨树花药愈伤组织器官分化效果最好，无根苗形态特征以及生长情况良好。

2)本发明中以MS+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L(pH5.8)为杨树花药愈伤组织的器官分化培养，愈伤组织的分化率为100％，GA₃在愈伤组织分化出不定芽的过程中发挥了关键的作用，尤其是在不定芽抽茎、发育成为无根苗的过程中有着重要的应用价值。

实施例3

1、制备无菌花药

取单核靠边期的杨树花芽，先用无菌水冲洗花芽3-5次，用滤纸吸干水分后用体积百分比浓度为70.0％的酒精浸泡花芽30s，接着用质量百分比浓度为7.0％的次氯酸钠溶液消毒5min，然后用无菌水冲洗花芽3-5次。在超净工作台上剥去花芽的鳞片，取出花序中部的花药，即得。

2、愈伤组织诱导培养

将花药接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，培养条件：黑暗条件下，培养温度为25±1℃，培养35天，开始统计花药愈伤组织的数量，培养120天计算愈伤组织的诱导率为30.0％，其中，愈伤组织诱导培养基为：H+NAA 0.5-1.5mg/L+KT0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L，pH5.5。

3、不定芽分化培养

将培养得到的直径为3mm左右的杨树花药愈伤组织接种到不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间16小时/天。分化培养过程中，杨树花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周后在愈伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，然后抽茎，20天左右不定芽生长高度可达1.5～2cm。培养20天后统计不定芽的分化率为100.0％，其中，不定芽分化培养基配方为：MS+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8。

4、生根培养

将培养至具有3-5片幼嫩叶片的不定芽接种到生根培养基中进行生根培养，培养条件：培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间16小时/天，培养20天后统计不定芽的生根情况，生根率达到100.0％，得到杨树试管小苗，其中，不定芽生根培养基配方为：1/2MS+IBA0.2-0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8。

不定芽生根培养基是诱导杨树不定芽生根培养时所公开的任何一种杨树不定芽生根培养基，这些杨树不定芽生根培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开，除了采用上述培养基：1/2MS+IBA 0.2-0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L之外，其他杨树不定芽生根培养基也适用于本发明，例如：H+IAA 1.0-1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L、1/2MS+IAA 1.0-1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L等。

5、炼苗、移栽

选取生根较好的试管小苗，放置在温室中的遮阴棚中炼苗培养2-3天，然后取出小苗并洗净根部培养基，移栽到杨树无土栽培基质(珍珠岩和蛭石的混合物)中，无土栽培基质为珍珠岩与蛭石的体积之比为1∶1的混合物。移栽后浇透水，15天统计移栽成活率，成活率为92.0％。

实际应用表明：采用本发明方法使得杨树花药愈伤组织器官分化得到不定芽，不定芽在多次不同重复试验中获得杨树单倍体植株，可靠性强。将单倍体植株经天然加倍或人工用秋水仙碱处理生长点，得到纯合的二倍体。

Claims

1.一种诱导杨树愈伤组织分化的培养基，其特征是所述培养基是：MS培养基+0.6-1.0mg/L BAP+0.1-0.5mg/L NAA+0-0.2mg/L GA₃+20-40g/L蔗糖+4.5-6.5g/L琼脂。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征是所述培养基是：MS培养基+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃0.02-0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L；优选为：MS培养基+BAP 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+GA₃ 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L。

3.一种诱导杨树愈伤组织分化的方法，包括：将杨树愈伤组织接种于权利要求1或2所述分化培养基中进行分化培养，直至分化生长出不定芽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述分化培养在以下条件下进行：培养温度为25±1℃，光照1500～2000lx，光照时间16小时/天。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是所述愈伤组织为杨树花药经过愈伤组织诱导培养而成花药愈伤组织。

6.如权利要求3所述的方法，其特征是所述愈伤组织按照如下顺序进行的步骤制备而成：

2)将无菌花药接种在愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基是H基本培养基+NAA 0.5-1.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基是H基本培养基+NAA0.5-1.0mg/L+KT 0.5-1.0mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L。

9.如权利要求8所述的方法，其特征是步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基是H基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。

10.如权利要求6所述的方法，其特征是步骤2)中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为25±1℃。