CN102326513B - 一种建立通用玉米再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立通用玉米再生体系的方法。通过将不同玉米自交系幼胚接种到附加不同激素组合的诱导培养基上，将诱导的合适胚状体转接到分化培养基上高频分化再生苗，再将再生苗转入到生根培养基上进行生根诱导，得到再生植株；其中，诱导培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸、0.1mg/L烟酸、0.1mg/L D-泛酸钙、0.04mg/L对甲基苯甲酸、蔗糖50g/L、2.4-D为0.4mg/L和6-BA5mg/L。本发明对不同玉米自交系具有很好的通用性以及获得再生植株时间较短等特性，具有重要的应用价值。
Description
发明领域
本发明涉及生物技术领域，具体说，本发明具体涉及一种建立通用玉米再生体系的技术领域。
背景技术
玉米是世界上第三大粮食作物，种植面积仅次于水稻和小麦。同时玉米又是重要的饲料作物。因此，提高玉米产量，改善玉米品质，关系到中国今后粮食安全的供给。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。随着生物技术的迅速发展，各国育种学家广泛地应用生物技术将一些控制优良性状的外源基因导入玉米中，达到培育抗逆性强、抗病虫的玉米新品种的目的。有效的玉米的组织培养及再生是开展植物遗传转化的先决条件之一。
目前，人们已经能从玉米的多种外植体如幼胚、成熟胚、花药、幼苗的芽顶分生组织、幼苗叶基部、幼苗切段中诱导出愈伤组织，且成功地获得了再生植株，但以幼胚作为外植体最佳，也是目前应用最多的外植体。最早成功进行玉米体细胞组织培养的是Green，该体系也是西方科学家常报道的玉米组培标准体系，他们利用玉米幼胚作为外植体，在愈伤诱导培养基中(主要包括MS培养基附加2mg/L2，4-D，4mg/LNAA)诱导愈伤。分化再生培养基激素浓度为0.25mg/2，4-D和1mg/L NAA。培养条件为16小时光照和8小时黑暗，并成功地获得了有限的再生植株，但是所用5个测试品种之一未诱导出愈伤。(Green CE，Phillips RL.Plant regeneration from tissue culture of maize.Crop Sci，1975，15：417-421)。此后Lu等利用MS培养基，包含3-12％蔗糖附加0.25-2.0mg/L 2，4-D诱导出了愈伤组织，生根培养基利用MS培养基附加3％蔗糖1mg/L GA3，获得了不多的再生玉米植株(Lu C，Vasil IK，Ozias-AkinsP，Somatic embryogenesis in Zea mays L.Theor Appl Gene，1982，62：109-112)。Todorova等对8个不同基因型的玉米幼胚进行培养，诱导愈伤发生率从1-28％，只有两个品种的到再生植株，结果发现仅A619表现出良好的再生能力为20％(Todorova L，Kruleva M，Krapchev B.Maize immatureembryo culture.Maize Genetics Cooperation Newsletter，1998，72：76)。
目前国内也相继报道以玉米幼胚为外植体诱导出愈伤组织。周逢勇等利用N6基本培养基诱导出的胚状体在微量元素改为MS微量元素的N6无激素培养基上分化成苗。待分化苗长出主茎后，移栽到温室中(周逢勇、王国英、谢友菊、崔洪志、郭三堆、戴景瑞(1998)玉米自交系P9-10遗传转化体系的建立.科学通报43(23)：2517-2521)。赵云云等对综31等自交系利用D培养基进行愈伤诱导，继代培养基中分别使用N6、B5、MS的微量成分以及N6和R有机成分等建立玉米再生体系(赵云云，周小梅，王国英玉米幼胚组织培养及其转化的研究，山西大学学报(自然科学版)，2006，29(3)：308-312)。李国圣等取玉米骨干自交系齐319和N10-6的幼胚为外植体，在加有2mg/L 2-4D的改良MS培养基上诱导胚性愈伤组织并得到再生植株(李国圣、杨爱芳、张举仁、毕玉平、单雷(2000)，玉米愈伤组织的遗传转化及抗除草剂植株再生.科学通报，45(20)：2181-2184)。肖莉杰利用MS+B5V为诱导培养基诱导愈伤，并在减少激素的分化培养基进行分化，在White培养基上生根培养，建立玉米再生体系(肖莉杰，苍晶，徐仲，侯艳华.黑龙江省骨干玉米自交系愈伤组织的诱导及植株再生，东北农业大学学报，2003，34(1)：63-6)。
因此综上所述大多数国外研究仅表明有些玉米品种不能再生或仅仅具有较低的再生频率，植株再生能力较好的基因型仍只限于模式自交系A188和B37及其衍生系等，不同研究培养基成份也不尽相同，由于试验条件和经验等限制，利用上述报道方法也很难重复出前人的研究结果。尽管国内也有很多报道获得了玉米再生植株，但也多利用MS培养基，诱导和再生效率多和玉米特定基因型有关如P9-10、综3和综31。培养基的成分是影响诱导率的主要因素之一，不同报道所使用的培养基配方也不尽相同，不同培养基的诱导能力和继代能力有很大差异。
因此建立高效稳定的玉米再生体系对培育一批抗病虫、抗逆转基因玉米新品种具有重要意义。综上所述尽管玉米再生体系比较成熟，但几乎所有报道玉米再生体系仅局限在有限的几个玉米自交系中，其综合经济性状较差，很难在育种中直接利用。
发明内容
尽管玉米再生体系的方法比较成熟，不同报道其培养基配方也不尽相同，并且其再生体系均和特定的基因型相关，获得再生苗时间也较长。本发明目的在于建立一种通用玉米再生体系的方法，克服培养基对特定玉米基因型的依赖，达到再生体系程序简单，获得再生苗时间较短。
本发明的技术方案：通过将通用玉米自交系幼胚接种到附加不同激素组合的诱导培养基上，将诱导的合适胚状体转接到分化培养基上高频分化再生苗，再将再生苗转入到生根培养基上中进行生根诱导，在光下培养成再生植株，以合理配方的营养土对再生植株进行炼苗，使再生植株的根部长出新的粗壮的根，最后移栽至大田中。
具体的，本发明提供了一种建立通用玉米再生体系的方法，具体步骤如下：
(1)表面消毒：根据不同基因型玉米的生长发育特点取幼培进行表面消毒，消毒后幼胚为实验材料。
(2)将消毒后的幼胚接到诱导培养基中进行诱导2-3周；诱导培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L，2.4-D为0.4mg/L，6-BA为5mg/L。
(3)将胚性愈伤转接到分化培养基中，2-3周分化出苗；分化培养基配方采用：N6培养基中大量元素、B5培养基中微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L、6-BA2mg/L、KT 0.5mg/L，28℃16h光培养和8h暗培养2-3周直到胚性愈伤分化出绿色的幼芽。
(4)将分化的幼苗接到生根培养基中生根，28℃16h光培养和8h暗培养，1-2周；生根培养基配方采用含NAA0.5mg/L的1/2MS。
(5)分化苗的移栽：将小植株根长至5～7cm，从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入培养土；移栽后浇透，移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住，可适当喷一些NAA0.5mg/L促进生根；温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长，1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活；幼苗长出两片新叶后，再移栽到田间或温室中；培养土按照蛭石∶泥炭体积比为1∶1。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果：
1.本发明建立7种不同玉米自交系的通用高效再生体系的方法，其中Condy3和Condy 4为公司西北区域玉米主栽品种自交系、郑958为中原地区主栽玉米品种，先玉335为东北区主栽玉米品种，B73，A188、综31为国内外已报道的高频再生自交系，本发明采用不同品系玉米自交系，在本领域基本上可以代表较大种植面积的玉米品系。不同品种胚性诱导率在30-60％之间，分化率10-40％之间，炼苗成活率高达70-90％。
2.本发明采用的培养基成分与已有技术相比，有机成份物减少，激素浓度提高，最终效果得到提高，在成本上降低。
3.本发明采用的蛭石与营养土配比和炼苗程序和已有技术相比，将小植株从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入蛭石∶营养土体积比为1∶1培养土中。移栽后浇透。移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住，三天后白天每天去塑料薄膜罩3-4小时。温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长。1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活，最终成活率可达70-90％。该程序从培养瓶到移栽成活大约需要2周，比已有报道节约1周时间，且成活率得到提高。
附图说明
图1所示为幼胚接到诱导培养基图。
图2所示为胚性愈伤图。
图3所示为分化的幼苗图。
图4所示为生根培养基中生长图。
图5所示为炼苗植株的移栽图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：
主要原辅材料：选用玉米优良自交系种子：Condy3、Condy 4、郑958，先玉335，B73，A188、综31等，由新疆康地种业公司提供。
主要试剂：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、核黄素，叶酸，烟酸，泛酸钙，对甲基苯甲酸，蔗糖，2.4-D，6-BA，全为分析纯。
主要仪器：生物超净台SW-CJ-2F(苏州安泰空气技术有限公司)，自动高压灭菌锅HVE-50(日本HIRAYAMA公司)，人工光照气候培养箱(哈尔滨东联公司)，冰箱(青岛海尔公司)。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：通用玉米再生体系的建立
(1)表面消毒：选用玉米优良自交系种子Condy3、Condy 4。在授粉后8-10d幼穗均可，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0-2.0mm，剥除果穗外苞叶，幼穗用70％酒精表面消毒，无菌水漂洗1-2次。
(2)玉米愈伤和胚性愈伤组织的诱导：在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，将消毒后的幼胚接到诱导培养基，在28℃，培养2-3周；诱导培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L，2.4-D为0.4mg/L，6-BA为5mg/L。Condy3、Condy 4两周内诱导出白色愈伤组织，愈伤率分别为68.6％和72.5％。其后1-2周白色愈伤组织转变为黄绿色、颗粒状胚性愈伤组织，胚性愈伤率最高为44.8％。
(3)将胚性愈伤转接到分化培养基中N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L+6-BA2mg/L+KT 0.5mg/L的分化培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养2-3周直到胚性愈伤分化出绿色的幼芽。Condy3、Condy 4胚性愈伤分化率分别为21.4％和23.7％。
(4)将分化的幼苗接到生根培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养，1-2周；生根培养基配方采用含NAA0.5mg/L的1/2MS生根培养基中，促使其生根，Condy3、Condy 4生根率达20％以上。
(5)植株的移栽：将小植株根长至5～7cm，从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入培养土；移栽后浇透，移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住，可适当喷一些NAA0.5mg/L促进生根；温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长，1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活；幼苗长出两片新叶后，再移栽到田间或温室中；培养土按照蛭石∶泥炭体积比为1∶1。
实施例二：郑958，先玉335玉米再生体系的建立
(1)表面消毒：选用玉米优良自交系种子郑958，先玉335。在授粉后9-11d幼穗均可，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0-2.0mm，剥除果穗外苞叶，幼穗用70％酒精表面消毒，无菌水漂洗1-2次。
(2)玉米愈伤和胚性愈伤组织的诱导：在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，将消毒后的幼胚接到诱导培养基，在28℃，培养2-3周；诱导培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L，2.4-D为0.4mg/L，6-BA为5mg/L。郑958，先玉335两周内诱导出白色愈伤组织，愈伤率分别为78.0％和88.3％。其后1-2周白色愈伤组织转变为黄绿色、颗粒状胚性愈伤组织，胚性愈伤率最高为29.5％。
(3)将胚性愈伤转接到分化培养基中N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L+6-BA2mg/L+KT 0.5mg/L的分化培养基中，28℃ 16h光培养和8h暗培养2-3周直到胚性愈伤分化出绿色的幼芽。郑958，先玉335胚性愈伤分化率分别为15.2％和21.5％。
(4)将分化的幼苗接到生根培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养，1-2周；生根培养基配方采用含NAA0.5mg/L的1/2MS生根培养基中，促使其生根，郑958，先玉335生根率达20％以上。
(5)植株的移栽：将小植株根长至5～7cm，从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入培养土；移栽后浇透，移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住，可适当喷一些NAA0.5mg/L促进生根；温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长，1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活；幼苗长出两片新叶后，再移栽到田间或温室中；培养土按照蛭石∶泥炭体积比为1∶1，移栽成活率大于80％。
实施例三：A188、综31玉米再生体系的建立
(1)表面消毒：选用玉米优良自交系种子A188、综31。在授粉后8-11d幼穗均可，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0-2.0mm，剥除果穗外苞叶，幼穗用70％酒精表面消毒，无菌水漂洗1-2次。
(2)玉米愈伤和胚性愈伤组织的诱导：在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，将消毒后的幼胚接到诱导培养基，在28℃，培养2-3周；诱导培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L，2.4-D为0.4mg/L，6-BA为5mg/L。A188、综31两周内诱导出白色愈伤组织，愈伤率大于90％。其后1-2周白色愈伤组织转变为黄绿色、颗粒状胚性愈伤组织，胚性愈伤率最高为65.5％。
(3)将胚性愈伤转接到分化培养基中N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L+6-BA2mg/L+KT 0.5mg/L的分化培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养2-3周直到胚性愈伤分化出绿色的幼芽。A188、综31胚性愈伤分化率分别为46.7％和41.3％。
(4)将分化的幼苗接到生根培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养，1-2周；生根培养基配方采用含NAA0.5mg/L的1/2MS生根培养基中，促使其生根，A188、综31生根率达40％以上。
(5)植株的移栽：将小植株根长至5～7cm，从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入培养土；移栽后浇透，移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住，可适当喷一些NAA0.5mg/L促进生根；温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长，1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活；幼苗长出两片新叶后，再移栽到田间或温室中；培养土按照蛭石∶泥炭体积比为1∶1，移栽成活率大于80％。
本发明通过应用不同品系，不同杂交种玉米都适合本发明提供的技术方案，同时，本发明列选自交系种子Condy3、Condy 4、郑958，先玉335、A188和综31基本上代表目前国内外玉米自交系主要和常用品系，从而说明本发明具有普遍的实用性和通用性。
Claims (1)
1.一种建立通用玉米再生体系的方法，其特征在于，具体方法步骤如下：
(1)表面消毒：选用不同玉米优良自交系种子，根据不同基因型玉米的生长发育特点，在授粉后8-14d幼穗均可，表面75％酒精消毒后无菌条件下剥取不同大小的幼胚为实验材料；
(2)将消毒后的幼胚接到诱导培养基，在28℃，培养2-3周；诱导培养基配方采用：N 6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸、0.1mg/L烟酸、0.1mg/L D-泛酸钙、0.04mg/L对甲基苯甲酸、蔗糖50g/L、2，4-D为0.4mg/L和6-BA 5mg/L；
(3)将胚性愈伤转接到分化培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养，2周；分化培养基配方采用：N6大量元素、B5微量元素、B5维生素、0.04mg/L核黄素，0.04mg/L叶酸，0.1mg/L烟酸，0.1mg/L D-泛酸钙，0.04mg/L对甲基苯甲酸，蔗糖50g/L、6-BA2mg/L、KT 0.5mg/L；
(4)将分化的幼苗接到生根培养基中，28℃16h光培养和8h暗培养，1周；生根培养基配方采用：1/2MS培养基、NAA0.5mg/L；
(5)植株的移栽：将小植株从培养基中取出，用清水洗净培养基，移入培养土；移栽后浇透，移栽后的小苗要用塑料薄膜罩住；温度白天保持25℃适于茎叶生长，夜间维持在20℃，有利于根系的生长，1-2周后，植株长出新叶，意味着移栽成活；幼苗长出两片新叶后，再移栽到田间或温室中；培养土按照蛭石∶泥炭体积比为1∶1。
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