CN103931492B - 苹果砧木m9的组培快速育苗方法 - Google Patents
苹果砧木m9的组培快速育苗方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苹果砧木M9的组培快速育苗方法，它包括以下步骤：(1)无菌系建立选择苹果砧木M9单株营养枝，剪取带顶芽茎段，接入诱导分化培养基上培养，所述培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6‑苄氨基嘌呤0.2‑1.0mg萘乙酸0.2‑0.6mg；(2)扩繁继代培养放入扩繁继代培养基中进行培养，所述培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6‑苄氨基嘌呤0.2‑1.0mg萘乙酸0.2‑0.6mg水解酪蛋白0.2‑0.5g；(3)生根培养放入生根培养基进行生根培养，所述培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g吲哚丁酸0.05‑0.12mg；(4)炼苗培养和移栽。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种通过植物组织培养技术繁殖苹果砧木M9的方法。
背景技术
苹果矮化栽培是世界苹果栽培的发展趋势，因此，在发展矮密苹果栽培时，因地制宜的选择矮砧品种非常重要，苹果砧木M9的优点是树体矮小，适于密植结果早，投产快，产量高果实品质好管理方便，降低生产成本。
植物组织培养方法是利用植物细胞的全能性，即组成植物的每一个细胞都具有发育成为一个完整植株的潜在能力，采取植物上的单个细胞、细胞团、分生组织或器官的一部分，通过人工配置不同营养成分和激素的培养基来培养并调控其发育，使这些细胞、组织等形成成千上万个小植株并且保持了母本植株的全部的优良性状。这种方法可以在短时间内获得大量的组培苗，并能在人工控制条件下一年四季生产，因而可以实现种苗繁殖的工厂化生产，在较小的面积内进行大规模生产，无需占用大量土地，可以有效的降低生产成本，实现规模化生产。
在现有技术中，苹果砧木M9组培苗扩繁系数低，生根困难，移栽成活率低，难以实现大规模工厂化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种苹果砧木M9的组培快速育苗方法。
本发明的技术方案是：一种苹果砧木M9的组培快速育苗方法，它包括以下步骤：(1)无菌系建立选择大田栽培的盛果期优良苹果砧木M9单株健壮营养枝作为外植体，剪取带顶芽或侧芽的茎段，经洗洁精、酒精、汞溶液消毒后切成长1.5-2cm单芽茎段，接入诱导分化培养基上培养，该诱导分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6-苄氨基嘌呤0.2-1.0mg萘乙酸0.2-0.6mg，培养条件：温度18-22℃，湿度55-75％，光照强度1000-1800Lx；(2)扩繁继代培养待步骤(1)中的初代培养材料长出1-2片真叶时，切成长0.5-1cm的茎段放入扩繁继代培养基中进行培养，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6-苄氨基嘌呤0.2-1.0mg萘乙酸0.2-0.6mg水解酪蛋白0.2-0.5g，培养条件：温度22-25℃，湿度55-75％，光照强度1800-2800Lx；(3)生根培养选取步骤(2)中2-6cm长扩繁继代培养材料，切成1.6-2.0cm长的带顶芽或侧芽茎段放入生根培养基进行生根培养，所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g吲哚丁酸0.05-0.12mg，培养条件：温度22-25℃，湿度55-75％，光照强度1800-2800Lx；(4)炼苗培养和移栽包括如下环节：闭瓶锻炼、开瓶锻炼、移栽到蛭石基质、移栽到由细砂石、田园土、牛粪组成的营养土中。
优选的，所述诱导分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6-苄氨基嘌呤0.8mg萘乙酸0.5mg；所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g6-苄氨基嘌呤0.8mg萘乙酸0.5mg水解酪蛋白0.4g；所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g琼脂粉5g吲哚丁酸0.1mg。
针对培养基组成及其配比与无菌系建立、扩繁继代培养、生根培养等阶段培养效果的关系或影响，发明人做了实验研究，为了进一步阐述本发明，将实验数据和研究结果分述如下：
表1不同激素浓度对芽成活的影响
1、不同6-苄氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)浓度对芽成活率影响
实验结果表明，在MS培养基中，加入0.8mg/16-BA(6-苄氨基嘌呤)和0.5mg/1NAA(萘乙酸)，进行初代培养时，外植体不仅成活率高而且生长健壮。
2、不同CH(水解酪蛋白)的浓度对扩繁的影响
本试验是在MS中，加入0.8mg/16-BA(6-苄胺基嘌呤)，0.5mg/1NAA(萘乙酸)和不同浓度的CH(水解酪蛋白)配制成相应的增殖培养基。置于温度25±2℃、光强1000～1800Lx的培养室中，时间16小时/天进行增殖培养，25天后统计实验结果(见表2)。
表2不同CH(水解酪蛋白)对瓶苗增殖影响
通过表2可以看出，在1升MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L的培养基中，琼脂粉5g，白砂糖25g，PH为5.6的培养基中加0.4g/L的CH(水解酪蛋白)，能有效的促进M9的芽的增殖生长，其污染率低，芽长势好，叶色浓绿，苗生长健壮，增值系数高。随着CH(水解酪蛋白)的浓度进一步增大时，尽管芽的增值系数提高，但试管苗污染增大，造成了财力物力的浪费。
3、组培苗不同茎段扩繁的比较
本实验是在增殖生长的基础上，选取整齐一致的组培苗分别切成上、中、下(带有愈伤组织)三段接在1升MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L的培养基中、置于温度25±2℃、光强1800～2800Lx的培养室中，时间16h/d进行增殖培养，25天后统计实验结果(见表3)。
表3不同茎段对芽增值影响
实验结论，上部茎段和下部(带有愈伤组织)的茎段增殖效果最好。
4、激素对生根的影响
在1/3MS中加入不同浓度的IBA(吲哚丁酸)配制成相应的生根培养基。每种培养基接50株，置于温度25±2℃，光强1800～2800Lx，时间16h/d进行生根培养，25天统计实验结果(见表2)。
表4不同浓度IBA对瓶苗生根的影响
| 培养基号 | IBA(mg/L) | 生根株数 | 生根率(％) |
| 1 | 0.04 | 36 | 72.0 |
| 2 | 0.06 | 39 | 78.0 |
| 3 | 0.08 | 41 | 82.0 |
| 4 | 0.1 | 43 | 86.0 |
| 5 | 0.12 | 42 | 84.0 |
实验结论：表4结果表明当IBA(吲哚丁酸)浓度为0.1mg/L时瓶苗生根率达86.0％，且根洁白、粗壮、整齐；当IBA(吲哚丁酸)浓度为0.12mg/L时虽然生根率有所提高，但根茎部诱发愈伤组织，且根的发育呈现畸形，抑制了根系和茎尖的生长，不利于生根及茎尖的正常生长，而且由愈伤组织产生的根与茎干的未相通，不利于移栽成活。
本发明的有益效果是，本发明组培步骤采用了适合苹果砧木M9快速繁殖的诱导分化培养基、扩繁继代培养基和生根培养基，初代培养成活率高，增殖系数高，生根效果好，使苹果砧木M9的生根率达75％以上，而且根系整齐，组培苗生长健壮，叶色浓绿，在生产中有效地节约了人力物力，移栽成活率达到85％，为工厂化生产奠定了基础。本发明组培方法具有简便易行，简化了程序，提高了工效，降到了成本等优点，可用于苹果砧木M9的快速繁殖。
具体实施方式
实施例1
(1)无菌系建立
4-5月份连续晴天的早晨，切苹果砧木M9新梢顶端3-4节的茎段，除去大叶片，剪2-3cm长，装入广口瓶内，带回实验室备用。把采来的茎段放在洗洁精1000倍稀释液中浸泡30分钟，用流水冲洗2小时，在无菌条件下，用75％的酒精浸泡10秒钟，用无菌水冲洗5次，依材料的老嫩，用0.1％升汞溶液浸泡5分钟，再用无菌水冲洗5次，然后将表面消毒后的材料置于无菌滤纸上，吸取材料上多余的水分，切去受伤药面，切成长约1.5-2cm单芽茎段，作为外植体接入启动分化培养基。该启动分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
将配好的培养基分装在培养瓶中，每瓶装25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1-0.15MPa下灭菌20-25分钟，将灭菌好的培养基在培养室放置3天后，接入M9处理好的外植体。转入温度为20-26℃，湿度为55-75％，光照强度为1000-1500Lx(时间14小时/天)的培养室中培养。长到20-25天后，选取2-4cm长，长势健壮的组培苗为材料，切成长1.3-1.7cm左右的带芽茎段进行扩繁继代培养。
(2)扩繁继代培养
将(1)中切好的初代培养材料放入扩繁继代培养基中进行培养，所用的扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
将配好的扩繁继代培养基分装在培养瓶中，每瓶装25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1-0.15MPa下灭菌20-25分钟，将灭菌好的培养基在培养室放置3天后，接入(1)中切好的初代培养材料。转入温度为22-28℃，湿度为55-75％，光照强度为1800-2800Lx的培养室中培养。30-35天后，选取2-6cm长，长势健壮，叶色浓绿的组培苗为材料，切成长1.6-2.0cm左右的带顶芽或侧芽茎段进行生根培养。
(3)生根培养
将(2)中切好的扩繁继代培养材料放入生根培养基中进行培养，所用的生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 25g
琼脂粉 5g
吲哚丁酸 0.05mg
将配好的生根培养基分装在培养瓶中，每瓶装25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1-0.15MPa下灭菌20-25分钟，将灭菌好的培养基在培养室放置3天后，(2)中切好的初代培养材料，转入温度为22-26℃，湿度为55-75％，光照强度为1800-2400Lx的培养室中培养。25-35天后，可长成高为3-5cm，有4-6片叶，约4-5条长0.5-1.0cm根的完整植株，此时可移入温室炼苗培养和移栽。
(4)炼苗培养
试管苗的移栽就是从“异养”到“自养”，从弱光、高湿、相对恒温的环境下到较高光强、较低湿度及变温的环境下的转变，需要有一个逐步适应的过程。因此在移栽前必须对试管苗进行提高其适应能力的锻炼，使植株生长粗壮，增强小苗体质以提高移栽成活率。具体做法是将生根状态理想的试管苗从培养室移入到温度为20-28℃，湿度为75-95％，(时间8-10小时/天)光照强度为1000-8000Lx的温室炼苗室，在自然散射光下逐步增强光照，进行光照适应性锻炼，然后再开启瓶盖，适应外界大气环境，使试管苗的叶片相对成熟后再移栽，瓶炼时间一般需3-5天，打开瓶盖，加入0.5-1.0cm高的自来水防污保湿，当苗高达到4-6cm，根长1.5-3cm时，进行移栽。
(5)移栽
试管苗从无菌异养培养转入到有菌自养环境，在温度高、湿度大的条件下，试管苗组织幼嫩，易于滋生杂菌，造成苗霉烂或根茎腐烂而死亡。因此在取出(3)中经过炼苗后的幼苗时，仔细洗去附在其上的培养基，不要损伤根系和茎叶，避免病菌感染。并将其在800倍多菌灵溶液中浸泡几分钟后，移栽到装有蛭石的营养钵中，放入小拱棚内，保持棚内温度18-28℃，相对湿度90％以上，另外小苗栽入基质后应立即用浓度为1/800-1/1000的百菌清、多菌灵、托布津等杀菌剂喷淋，以后每隔7-10天喷一次。培养20-35天，当苗高5-8厘米时，及时移栽到细砂石十田园土+牛粪比例为1∶1∶0.5的营养土中，放入日光温室2周后可长出新叶，移栽成活率达85％。
实施例2
在本实施例中，所述启动分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 25g
琼脂粉 5g
吲哚丁酸 0.12mg
在本实施例中，其他步骤与实施例1相同。
实施例3
在本实施例中，所述启动分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 25g
琼脂粉 5g
吲哚丁酸 0.1mg
在本实施例中，其他步骤与实施例1相同。
实施例4
在本实施例中，所述启动分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
白砂糖 25g
琼脂粉 5g
吲哚丁酸 0.06mg
在本实施例中，其他步骤与实施例1相同。
实施例5
在本实施例中，所述启动分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
在本实施例中，所述生根培养基与实施例2相同。在本实施例中，其他步骤与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种苹果砧木M9的组培快速育苗方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)无菌系建立 选择大田栽培的盛果期优良苹果砧木M9单株健壮营养枝作为外植体，剪取带顶芽或侧芽的茎段，经洗洁精、酒精、汞溶液消毒后切成长1.5-2cm单芽茎段，接入诱导分化培养基上培养，该诱导分化培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g、 琼脂粉5g 、 6-苄氨基嘌呤0.8mg、 萘乙酸0.5mg，培养条件：温度18-22℃，湿度55-75％，光照强度1000-1800Lx；(2)扩繁继代培养 待步骤(1)中的初代培养材料长出1-2片真叶时，切成长0.5-1cm的茎段放入扩繁继代培养基中进行培养，所述扩繁继代培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g 、琼脂粉5g、 6-苄氨基嘌呤0.8mg、 萘乙酸0.5mg 、 水解酪蛋白0.4g，培养条件：温度22-25℃，湿度55-75％，光照强度1800-2800Lx；(3)生根培养 选取步骤(2)中2-6cm长扩繁继代培养材料，切成1.6-2.0cm长的带顶芽或侧芽茎段放入生根培养基进行生根培养，所述生根培养基为在1升1/3MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：白砂糖25g 、 琼脂粉5g、 吲哚丁酸0.1mg，培养条件：温度22-25℃，湿度55-75％，光照强度1800-2800Lx；(4)炼苗培养和移栽包括如下环节：闭瓶锻炼、开瓶锻炼、移栽到蛭石基质、移栽到由细砂石、田园土、牛粪组成的营养土中。
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Granted publication date: 20191119 Termination date: 20220123 |