CN101926287A

CN101926287A - 中砧1号组织培养的方法

Info

Publication number: CN101926287A
Application number: CN 201010273794
Authority: CN
Inventors: 韩振海; 许雪峰; 王忆; 张新忠; 孙扬吾; 沈隽
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN101926287B

Abstract

本发明公开了一种中砧1号组织培养的方法。该方法是将中砧1号种子经无菌预培养，得到无菌苗，然后将所述无菌苗的茎尖进行初代培养，得到再生苗。实验证明：在生产中砧1号再生苗之前先经过预培养的话，预培养苗的茎尖分化率达87.77％；而普通营养土培养小苗的茎尖的分化率仅为21.07％。本发明以种子为外植体材料，以无菌苗进行预培养的方式，保证了优良性状的遗传稳定性；本发明还完善了杀菌处理方法；同时筛选出了适合防褐化物质和激素种类，及各物质的浓度，解决了目前研究中存在的污染和褐化问题，成功建立了中砧1号的无菌培养体系。

Description

中砧1号组织培养的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及中砧1号组织培养的方法。

背景技术

苹果是世界上列柑橘、香蕉、葡萄之后的第四大水果，也是我国栽培面积最大、产量最多的水果。我国苹果生产具有悠久的栽培历史，有较丰富的管理经验，已形成了种苗繁育、生产栽培、采后加工储藏和深加工的产业链。但从总体来讲，目前我国的苹果生产和发达国家相比，树种品种结构不合理，大多数还存在经营粗放、栽培管理水平不高、果品质量较差、效益不高的现象。要转变这种广种薄收、高投入低产出的现状，加强对现有低产园的改造，提高单产和果品品质，矮化密植是主要的发展趋势，选用矮化砧木是实现矮化密植栽培的前提与途径(朱树华，郁松林，权俊萍，石河子大学学报(自然科学版)，2003(4))。

我国育成的苹果矮化砧木，在正常条件下扦插压条都不易发根，无性繁殖困难，只能采用中间砧方式利用。而实生砧苗压条繁殖虽容易生根，可进行营养繁殖，扩大繁殖系数，但是基础材料不足限制推广速度。

小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是苹果属的四倍体(2n＝4x＝68)野生种质资源，作苹果砧木利用，其综合性状优良，是很有希望的苹果半矮化砧木(成明昊，杨晓红，曾继光，1984，西南农学院学报，3：38～43)。中砧1号是中国农业大学历时25年从中选出的耐缺铁优良种质，具有耐盐碱、耐热、耐旱、耐涝、抗寒(-45℃)、抗白粉病、固地性好等特性，对潜隐病毒也有较强的抗性，嫁接红富士、红星、金冠、国光、北斗、王林等苹果品种也表现嫁接亲和性好。去雄套袋后花朵坐果率为86.7％，具有无融合生殖特性，实生苗整齐一致，也可用实生苗压条扩大繁殖系数。但中砧1号果实出种率很低，平均每果饱满种子数仅0.9粒，约需200斤果实出一斤种子，所以实生繁殖远远不能满足生产要求。

组织培养作为生物工程的一项重要技术，近年来已在生物科学领域获得了长足发展，尤其是园艺植物的应用上取得了丰硕成果。据不完全统计，目前通过组织培养繁殖的果树包括多个科的多个种，外植体类型从茎尖、叶片、花药、胚乳、叶肉原生质体等均再生出植株，其中以茎尖培养的研究较多、进展快，在一些果树种类上已进入实用阶段(张庆田，山东农业大学，2007)。

木本植物组培苗生根普遍困难，关于这一问题的解释已趋向一致：除了基因型的差别外，年龄时期起了主要作用。在排除了基因型和年龄时期对生根的影响外，外源生长素对组培苗生根的诱导作用得到了广泛的认可；而且在生长素完成了诱导作用后，它们在培养基中的存在对新根的发生有抑制作用。

中砧1号属于木本植物，其在组织培养是发生褐变的问题很严重，随着苗龄增大褐变程度也有所增加，从而给这一类植物的组织培养快速繁殖带来了很大的困难。

目前尚未有对中砧1号建立高效组培快繁技术体系。

发明内容

本发明目的在于提供一种生产中砧1号再生苗的方法。

本发明提供生产中砧1号再生苗的方法是将中砧1号种子经无菌预培养，得到无菌苗，然后将所述无菌苗的茎尖进行初代培养，得到再生苗。

上述无菌预培养是所述中砧1号种子接种到预培养的培养基中培养；所述预培养的培养基是在水中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基；

所述凝胶剂是琼脂或卡拉胶，优选是琼脂，所述琼脂在所述预培养的培养基中的终浓度优选是7g/L；所述碳源是蔗糖或麦芽糖，优选是蔗糖，所述蔗糖在所述预培养的培养基中的终浓度优选是30g/L。

上述初代培养是将所述无菌苗的茎尖接种到初代培养基上培养，所述初代培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中所述6-BA的终浓度为0.5-2.0mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.10mg/L；所述6-BA的终浓度优选为1.0mg/L；NAA的终浓度为0.05mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

表1.MS基本培养液的溶质(mg/L)

上述初代培养基中的凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选是琼脂；所述凝胶剂在所述初代培养基中的终浓度是7g/L；

上述初代培养基中的碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述碳源在所述初代培养基中的终浓度是30g/L。

本发明的另一目的在于提供一种生产中砧1号再生植株的方法。

本发明提供的生产中砧1号再生植株的方法包括以下步骤：

1)根据任一上述的方法制备得到再生苗；

2)将步骤1)中得到再生苗进行生根培养，得到完整的再生植株。

步骤2)中，所述生根培养包括以下步骤：将所述再生苗在生根培养基中培养；所述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IBA、碳源和凝胶剂；所述生根培养基中IBA的终浓度是0.01-2.00mg/L，优选是0.50mg/L；所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质是将表1所示的溶质中的大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐浓度不变得到的溶质。

上述生根培养基中的凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选是琼脂；所述凝胶剂在所述生根培养基中的终浓度是7g/L；

所述生根培养基中的碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述碳源在所述生根培养基中的终浓度是30g/L。

上述生根培养的步骤中，所述再生苗在进入生根培养基之前还经过预生根的步骤；所述预生根是将所述再生苗置于预生根培养基中进行；所述预生根培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述预生根培养基，所述6-BA的终浓度为0.25mg/L，NAA的终浓度为0.05mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

进一步，上述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的继代培养，所述继代培养是将步骤1)得到的再生苗转接到扩繁培养基中培养，得到增殖的再生苗；

所述扩繁培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度为0.05-1.00mg/L，NAA的终浓度为0.05-1.00mg/l；所述6-BA的终浓度优选是0.5mg/L，NAA的终浓度优选是0.5mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

上述预生根培养基和扩繁培养基中，所述凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或Gelrite，均优选是琼脂；所述凝胶剂在预生根培养基和扩繁培养基中的终浓度均是7g/L；

上述预生根培养基和扩繁培养基的碳源均是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，均优选为蔗糖；所述碳源在所述预生根培养基和扩繁培养基中的终浓度均是30g/L。

实验证明：在生产中砧1号再生苗之前先经过预培养的话，预培养苗的茎尖分化率达87.77％，并且初代接种6-7天后，即启动开始生长，特别是带子叶的茎尖，启动生长更快(约5天)；而普通营养土培养小苗的茎尖的分化率仅为21.07％，并且生长在营养土上的中砧1号的茎尖，接种后，启动很慢。将再生苗进行生根之前优选是先经过预生根培养，经生根预培养后，分化新梢数减少，节间伸长，叶片伸展，叶色变深，叶面积明显大于未经生根预培养苗；其株高、茎粗度、生根率、平均单株数和单株长度皆显著地大于未经生根预培养苗(表5)。

本发明以种子为外植体材料，以无菌苗进行预培养的方式，保证了优良性状的遗传稳定性；本发明还完善了杀菌处理方法；同时筛选出了适合防褐化物质和激素种类，及各物质的浓度，解决了目前研究中存在的污染和褐化问题，成功建立了中砧1号的无菌培养体系。

附图说明

图1为本发明实施例1中砧1号在扩繁培养基中的生长情况。

图2为本发明实施例1中砧1号的生根情况。

图3为本发明实施例1移栽的中砧1号再生植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中6-卞氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)均购自亚太恒信生物科技(北京)有限公司。

升汞购自上海开通化工有限公司。

琼脂、蔗糖、封口膜、75％乙醇、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、钼酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、乙二胺四乙酸钠铁、甘氨酸、肌醇、Ph试纸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素均购自北京广达恒益科技有限公司。

实施例1、制备中砧1号再生植株及其观察统计与分析

1、外植体的获得

1)预培养得到预培养苗

将中砧1号(该材料已经于2009年12月30.日由北京市林木品种审定委员会审定为林木良种，良种编号为京S-SV-MX-015-2009，此信息可从2010年1月16日发布的《2009年北京市林木品种审定公告》上查询，公众可从中国农业大学获得)的种子进行层积处理，待种子开始发芽至胚根长到2cm以上时，将其小心地插入预培养培养基中，放入光照培养箱中，温度控制在23℃，光照强度为2000-2500Lx，光周期(光照/黑暗)16h/8h条件下培养，待种皮脱掉后得到预培养苗。

上述预培养培养基是在水中添加蔗糖和琼脂得到的固体培养基，琼脂在培养基中的终浓度为7g/L。蔗糖在培养基中的终浓度为30g/L。

2)非预培养获得外植体

将中砧1号的种子进行层积处理，待种子开始发芽，将其播种于营养土中，出土生长为小苗。

2、外植体的预处理

1)预培养苗的预处理

将上述步骤1中步骤1)得到的预培养苗的茎尖(包括带子叶的茎尖)切下，在超净工作台上消毒，即用质量浓度为0.1％的HgCl₂灭菌5分钟后，再用无菌水冲洗3遍。

2)非预培养(营养土培养)的外植体的预处理

切取上述步骤1中步骤2)得到的小苗的茎尖(可带子叶)用蒸馏水冲去泥土，在超净工作台上分别用以下①-⑦的消毒方案进行消毒(设7个处理，每个处理16-37个茎尖)，再用无菌水冲洗干净。

消毒方案为：

①先用2％新洁尔灭消毒2分钟，再用1∶1的过氧乙酸水溶液消毒5分钟，无菌水洗3遍；

②先用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％的HgCl₂消毒5分钟，无菌水洗3遍；

③先用75％酒精消毒2分钟，再用0.1％的HgCl₂消毒5分钟，不用无菌水冲洗；

④先用75％酒精消毒1分钟，再用0.01％的HgCl₂消毒8分钟，无菌水洗3遍；

⑤先用2％新洁尔灭消毒10分钟，再用漂白粉饱和液浸泡20分钟，无菌水冲洗3遍；

⑥先用洗衣粉液浸泡5分钟，再用75％酒精消毒1分钟，然后用漂白粉饱和液浸泡20分钟，无菌水冲洗3遍；

⑦先用洗衣粉液浸泡5分钟，再用75％酒精消毒1分钟，然后0.1％的HgCl₂消毒5分钟，无菌水洗3遍。

3)实验结果统计

培养3、10、17天后，分别统计预培养苗的茎尖和营养土培养的小苗的茎尖的污染情况，实验重复3次，经步骤1)预培养苗的茎尖污染率为0％。经步骤2)非预培养(营养土培养)小苗的污染率实验结果如表2所示。

表2、营养土培养苗的茎尖的芽污染情况(重复三次)

从上面结果看，处理③、④、⑦污染率较低，处理①、⑤其次，处理⑥污染率最高，说明在本培养试材的消毒中，HgCl₂杀菌效果最好，以下的实验涉及营养土培养的小苗都是采用第⑦种方法处理的。

3、初代培养得到再生苗及观察统计与分析

1)获得再生苗

分别将上述步骤2中预处理过的预培养苗的茎尖和营养土培养的小苗的茎尖接种于初代培养基上，在温度为23±2℃，相对湿度为50-60％、光强为2000-2500Lx，每天光照为10小时的条件下，培养6-7天后，茎尖开始生长，培养至30天，得到再生苗。

上述初代培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度为1.0mg/L，NAA的终浓度为0.05mg/L，碳源为蔗糖，蔗糖的终浓度为30g/L，凝胶剂是琼脂，琼脂的终浓度为7g/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.8。

2)观察统计与分析

I、观察统计

培养15天后，分别统计预培养苗的茎尖和营养土培养的小苗的茎尖的芽分化情况，实验重复3次，实验结果如表3和表4所示：预培养苗的茎尖分化率为87.77％，营养土培养小苗的茎尖的分化率为21.07％。

表3、预培养苗的茎尖的芽分化情况(重复三次)

表4、营养土培养小苗的茎尖的芽分化情况(重复三次)

II、分析

对上述步骤3的步骤1)中的试验进行观察分析：

①取自无菌苗预培养方式(即预培养苗)的茎尖，接种后未发生褐变问题，这类似于快速增殖阶段继代培养时的材料，对机械伤害不发生褐变反应。

取营养土培养小苗的茎尖，接种后会发生褐变，且随着苗龄增大褐变程度有所增加。

②取自无菌苗预培养方式(即预培养苗)的茎尖，初代接种6-7天后，即启动开始生长，特别是带子叶的茎尖，启动生长更快(约5天)，这种特点类似于快速增殖阶段的继代培养，接种后很快开始生长。

生长在营养土上的中砧1号的茎尖，接种后，启动很慢，以至于后面培养成功的再生植株没有一株是来自于这种方式的。

③上述步骤3的步骤1)中预培养苗消毒后污染率为0％。

营养土培养小苗的茎尖消毒后采用第7种方法污染率为3％。

由此可以分析得知：预培养方法使植物材料一定程度上适应了试管内的环境，从而能够继续生长。

4、继代培养

将步骤2中步骤1)得到的再生苗转接到扩繁培养基上，在温度为23±2℃，相对湿度为50-60％、光强为2000-2500Lx，每天光照为10小时的条件下培养，每25天继代一次，得到数量增殖的再生苗(如图1所示)。

上述继代培养的次数可根据所需再生苗的数量决定。

上述扩繁培养基是在是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中，碳源为蔗糖，蔗糖的终浓度为30g/L，凝胶剂是琼脂，琼脂的终浓度为7g/L，6-BA的终浓度为0.5mg/L，NAA的终浓度为0.5mg/L，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.8。

5、生根培养及统计观察

1)预生根培养

将上述步骤4中得到的再生苗接种到预生根培养基中培养，培养条件：温度为23±2℃，相对湿度为50-60％、光强为2000-2500Lx，每天光照为10小时。所述预生根培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；所述预生根培养基，所述6-BA的终浓度为0.25mg/L，NAA的终浓度为0.05mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为7g/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

2)生根培养获得再生植株

将上述步骤4得到的再生苗以及步骤5的1)预培养得到的苗接种到生根培养基中，在温度为23±2℃，相对湿度为50-60％，光强为2000-2500Lx，每天光照为10小时条件下，培养30天，得到中砧1号再生植株(如图2所示)。

上述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IBA、碳源和凝胶剂；其中IBA的终浓度是0.50mg/L，碳源为蔗糖，蔗糖的终浓度为30g/L，凝胶剂是琼脂，琼脂的终浓度为7g/L；所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质是将表1所示的溶质中的大量元素减半以后得到的溶质。培养基的pH为5.8。

统计观察

实验重复3次，统计观察上述经过步骤1)预生根后的步骤2)中生根培养的生根情况，并以未进行上述步骤1)预生根直接进行步骤2)的生根培养为对照。实验结果见下表5。

表5生根预培养与否对不定根发生的影响

注：**表示在0.01水平下差异极显著。

观察：中砧1号试管苗在快速增值阶段，分化新梢数增多，新梢生长缓苗。这种试管苗经生根预培养后，分化新梢数减少，节间伸长，叶片伸展，叶色变深，叶面积明显大于未经生根预培养苗；其株高、茎粗度、生根率、平均单株数和单株长度皆显著地大于未经生根预培养苗。由此可以看出，培育优质健壮的试管苗可以显著提高生根率。

木本植物组培苗生根普遍困难，关于这一问题的解释已趋向一致：除了基因型的差别外，年龄时期起了主要作用，处于成年期状态的组培苗生根困难，而处于幼年期状态的和经过多代培养从成年期状态回转到童年期状态的组培苗，生根要容易得多。在排除了基因型和年龄时期对生根的影响外，外源生长素对组培苗生根的诱导作用得到了广泛的认可；而且在生长素完成了诱导作用后，它们在培养基中的存在对新根的发生有抑制作用。含低浓度生长素的培养基中生根，效果明显优于含有高浓度生长素的培养基。

6、炼苗移栽

将步骤5中得到的生根良好的再生植株进行炼苗，移栽到添加蛭石加草炭土(蛭石与草炭土的比例为1∶1)的基质中(如图3所示)，成活率最高，可达93.3％，并且移栽后组培养缓苗时间短，地上部开始生长早，根系发育良好。

Claims

1.一种生产中砧1号再生苗的方法，是将中砧1号种子经无菌预培养，得到无菌苗，然后将所述无菌苗的茎尖进行初代培养，得到再生苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无菌预培养是所述中砧1号种子接种到预培养的培养基中培养；所述预培养的培养基是在水中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述初代培养是将所述无菌苗的茎尖接种到初代培养基上培养，所述初代培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中所述6-BA的终浓度为0.5-2.0mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.10mg/L；所述6-BA的终浓度优选为1.0mg/L；NAA的终浓度为0.05mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述初代培养基中的凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选是琼脂；所述凝胶剂在所述初代培养基中的终浓度是7g/L；

所述初代培养基中的碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述碳源在所述初代培养基中的终浓度是30g/L。

5.一种生产中砧1号再生植株的方法，包括以下步骤：

1)根据权利要求1-4中任一所述的方法制备得到再生苗；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述生根培养包括以下步骤：将所述再生苗在生根培养基中培养；所述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IBA、碳源和凝胶剂；所述生根培养基中IBA的终浓度是0.01-2.00mg/L，优选是0.50mg/L；所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质是将表1所示的溶质中的大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐浓度不变得到的溶质。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述生根培养基中的凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选是琼脂；所述凝胶剂在所述生根培养基中的终浓度是7g/L；

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述生根培养的步骤中，所述再生苗在进入生根培养基之前还经过预生根的步骤；所述预生根是将所述再生苗置于预生根培养基中进行；所述预生根培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述预生根培养基，所述6-BA的终浓度为0.25mg/L，NAA的终浓度为0.05mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的继代培养，所述继代培养是将步骤1)得到的再生苗转接到扩繁培养基中培养，得到增殖的再生苗；

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述预生根培养基和扩繁培养基中，所述凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或Gelrite，均优选是琼脂；所述凝胶剂在预生根培养基和扩繁培养基中的终浓度均是7g/L；

所述预生根培养基和扩繁培养基的碳源均是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，均优选为蔗糖；所述碳源在所述预生根培养基和扩繁培养基中的终浓度均是30g/L。