CN109892224A - 苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及木本植物的组织培养技术领域，尤其是涉及一种苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，步骤：1.外植体消毒：用漂白水浸泡外植体25‑30min，漂白水为“白猫”牌家用漂白水与无菌水的混合液；2.启动培养：将消毒过的外植体接种到启动培养基中培养5‑7周；3.增殖培养：将在启动培养中萌发的腋芽转接到增殖培养基中培养5‑7周；4.将在增殖培养基中增殖的団芽分割成单个芽，根据大小分级后，转接到生根培养基中培养5‑7周，生根后可进行驯化移栽。本发明为商业生产配方，具有稳定、宽泛、简单、批次整齐、成本低廉的特点。
Description
技术领域
本发明涉及木本植物的组织培养技术领域，尤其是涉及一种苹果砧木“SproutFree”组织培养种苗商业化繁育方法。
背景技术
传统的苹果砧木繁殖方法一般采用籽播、扦插或压条等方式进行种苗繁育。苹果栽培主要目的为结果，而生产上极少采用籽播方式育苗，因为采用籽播方式育出的苗木容易产生性状分离而很难保持母体的优良品种性状，造成不良的果品。扦插育苗受季节限制，一年之中只有短暂的5-9月可以进行相关作业，且根系生长不好、扦插口易感菌、个体生长缓慢、抗病性差。
现有技术的缺点：1.常规的种子繁殖速度过慢，籽播苗需要经过漫长的幼年期；并且种子繁殖过程中，发生性状分离的概率较大，难以维持性状一致，生产上一般很少采用此种繁殖方式。2.扦插育苗扦插时间短暂、扦插基质配比种类以及扦插微环境控制对生根率的影响比较大；而且扦插育苗需要截取大量枝条，须建立庞大的采穗圃，增加企业运营成本；此外，扦插切口在常规介质中会被微生物感染，植物体内带菌浓度高，且植物病毒会随着扦插育苗而逐渐积累，随着扦插繁殖代数的增加，植物生长缓慢，优良性状退化较为明显。3.Sprout Free砧木的组培育苗技术还未研发报道。现需要一种可解决上述问题的苹果砧木“Sprout Free” 的种苗繁育方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，用木本植物组织培养技术来克服苹果砧木常规扦插育苗的诸多弊端，实现种苗繁育工作的周年化、批次化、规范化、种苗洁净无菌化。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：一种苹果砧木“SproutFree”组织培养种苗商业化繁育方法，包括依次进行的外植体选择阶段、外植体消毒阶段、启动培养阶段、增殖培养阶段、生根培养阶段，用于商业化繁育，且所述外植体消毒阶段采用“白猫”牌家用漂白水与无菌水按1：4的体积比制成的漂白水对外植体消毒。
通过采用上述技术方案，这样操作的消毒效果更加好，对外植体消毒安全简单，能够大大降低外植体的死亡率，消毒成活率较高。
优选的，所述外植体选择阶段的操作方式为：在春季4月份选取苹果砧木品种“Sprout Free”植株健壮、性状纯正、无病虫害的砧木幼态嫩梢，从顶芽起向下截取约带3-5个腋芽茎段的枝条，去除叶片，整个茎段作为外植体。
优选的，所述外植体消毒阶段包括以下步骤：Step1.用酒精棉擦拭外植体表面灰尘；Step2.立即将外植体置于容器中，并于容器中倒入漂白水浸泡外植体25-30min，浸泡期间震荡容器3-5次；Step3.从漂白水中取出外植体，用无菌水浸泡洗涤外植体3次，每次浸泡清洗2-5分钟。
优选的，所述启动培养阶段的操作步骤为：Step1.将消毒后的外植体上下两端分别切除0.3-0.5cm接入启动培养基中；Step2.接种后将启动培养基暗培养5-7天，培养温度10-12℃；Step3.转入光照16h、黑暗8h、室温23-26℃、光强2000-2300lux的环境下培养4-6周，直至腋芽开始萌发。
通过采用上述技术方案，在涉及腋芽的启动培养中，先转入较低温度（10-12℃）下暗培养1周，再转入常规温度（光照16h、黑暗8h）、光照下培养，有效地降低了外植体的褐化反应，提高了萌芽率和存活率。
优选的，所述启动培养基的配方：MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA31.0-2.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
通过采用上述技术方案，该配方能够快速打破腋芽休眠，促进腋芽萌发，同时能够有效避免愈伤组织的产生。
优选的，所述增殖培养阶段的操作步骤为：Step1.将在启动培养基中萌发的无菌苗株的腋芽切下，接种于增殖培养基中；Step2.在培养室23-26℃的环境下暗培养1周，再转入光照16h、黑暗8h、光强4000-5000lux、温度23-26℃的环境下培养4-6周，直至产生丛生芽2-3个。
通过采用上述技术方案，采用腋芽产生丛生芽的方式，避免从愈伤细胞再生植株，在保持母本优良性状的同时保障了所生产种苗的性状一致性，大大降低性状分离或变异的概率。
优选的，所述增殖培养基的配方：MS+BA0.3-0.5mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
通过采用上述技术方案，该配方能够保障腋芽增殖人为可控，增殖倍率为2-3倍，且芽体健壮，重复性好。
优选的，所述生根培养阶段的操作步骤为：Step1.将增殖培养后健壮的丛生芽分割成单个芽，接种于生根培养基中进行诱导生根；Step2.接种后在培养室先暗培养3-5天，再转入光照时间16h、黑暗8h、光强4000-5000lux、温度23-26℃的环境下全光照培养3-5周直至生根。
优选的，所述生根培养基的配方：1/2MS+IBA0.8-1.0mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
通过采用上述技术方案，该配方能够促进植物产生的根与植物体木质部结构相连，且生长出的根短而粗壮，能够在移栽时降低损伤、提高移栽存活率。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
本发明通过组织培养以芽繁芽的技术途径进行种苗快速繁殖，在培养过程中避免产生愈伤组织，避免了性状分离和变异，保持了母本的优良特性，种苗性状稳定；
本发明只需要少量外植体材料，不再需要采集大量枝条，避免了对成品苗木的取枝伤害；也不依赖于植物种子，能够根据订单需要按批周年生产；
本发明中涉及的培养基配方（三个阶段的配方），能够保持2-3倍的增殖倍率，重复性好，性状稳定，且丛生芽健壮、大小一致，符合商业生产对种苗健壮度、整齐度、重复性的要求；
本发明中涉及的培养基配方，省略了壮苗阶段，减轻了劳动力成本、缩短了生产周期；
本发明中涉及腋芽的启动培养中，先转入较低的10-12℃温度下暗培养1周，有效地降低了外植体的褐化，提高了萌芽率；
本发明采用家用“白猫”牌漂白水作为外植体消毒剂，与传统的酒精、双氧水、升汞等消毒剂相比，具有简单易操作、安全、成本低廉、消毒效果好的特点。
附图说明
图1是本发明的流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
一种苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法：如图1所示，第一步，春季4月份，选择晴朗的天气，选取苹果砧木品种Sprout Free植株健壮、性状纯正、无病虫害的砧木幼态嫩梢，从顶芽起向下截取约带3-5个腋芽茎段的枝条，去除叶片，整个茎段作为外植体。
第二步，在无菌操作台上，将外植体用医用酒精棉擦拭干净，然后将外植体放入容器，立即向容器内倒入漂白水（“白猫”牌家用漂白水与无菌水体积比为1:4的混合液）浸泡外植体25-30min，期间需不连续震荡容器3-5次，最后将外植体从漂白水中取出，用无菌水浸泡洗涤3次，每次浸泡洗涤2-5分钟。
第三步，在操作工作台上，将消毒后的外植体上下两端分别切除0.3-0.5cm接入启动培养基中，启动培养基为MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA31.0-2.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。接种后放入培养室暗培养5-7天，温度调至10-12℃；然后转入光照时间16h、黑暗8h、室温23-26℃、光强2000-2300lux的环境中培养4-6周，直至腋芽开始萌发。
第四步，将在启动培养基中萌发的无菌苗株的腋芽切下，接种于增殖培养基中，增殖培养基为MS+BA0.3-0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。先在培养室暗培养1周，培养温度为23-26℃；剩余时间在光照16h、黑暗8h、培养温度为23-26℃、光强4000-5000lux的环境中培养4-6周可诱导产生丛生芽约2-3个，芽丛高度约2-3cm，增殖率达到2-3倍。
第五步，将增殖培养后健壮的丛生芽分割成单个芽，接种于生根培养基中进行诱导生根，生根培养基为1/2MS+IBA0.8-1.0mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。接种后在培养室先暗培养3-5天，然后全光照培养，光照时间16h，黑暗8h，光强4000-5000lux,培养温度为23-26℃，培养3-5周可生根，植株长高约至2-3cm、主根为2-5条、长度约2-5cm即达到健壮状态。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，包括依次进行的外植体选择阶段、外植体消毒阶段、启动培养阶段、增殖培养阶段、生根培养阶段，其特征在于：用于商业化繁育，且所述外植体消毒阶段采用“白猫”牌家用漂白水与无菌水按1：4的体积比制成的漂白水对外植体消毒。
2.根据权利要求1所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述外植体选择阶段的操作方式为：在春季4月份选取苹果砧木品种“SproutFree”植株健壮、性状纯正、无病虫害的砧木幼态嫩梢，从顶芽起向下截取约带3-5个腋芽茎段的枝条，去除叶片，整个茎段作为外植体。
3.根据权利要求1所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述外植体消毒阶段包括以下步骤：
Step1.用酒精棉擦拭外植体表面灰尘；
Step2.立即将外植体置于容器中，并于容器中倒入漂白水浸泡外植体25-30min，浸泡期间震荡容器3-5次；
Step3.从漂白水中取出外植体，用无菌水浸泡洗涤外植体3次，每次浸泡清洗2-5分钟。
4.根据权利要求1所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述启动培养阶段的操作步骤为：
Step1.将消毒后的外植体上下两端分别切除0.3-0.5cm接入启动培养基中；
Step2.接种后将启动培养基暗培养5-7天，培养温度10-12℃；
Step3.转入光照16h、黑暗8h、室温23-26℃、光强2000-2300lux的环境下培养4-6周，直至腋芽开始萌发。
5.根据权利要求4所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述启动培养基的配方：MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA31.0-2.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
6.根据权利要求1所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述增殖培养阶段的操作步骤为：
Step1.将在启动培养基中萌发的无菌苗株的腋芽切下，接种于增殖培养基中；
Step2.在培养室23-26℃的环境下暗培养1周，再转入光照16h、黑暗8h、光强4000-5000lux、温度23-26℃的环境下培养4-6周，直至产生丛生芽2-3个。
7.根据权利要求6所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述增殖培养基的配方：MS+BA0.3-0.5mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
8.根据权利要求1所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述生根培养阶段的操作步骤为：
Step1.将增殖培养后健壮的丛生芽分割成单个芽，接种于生根培养基中进行诱导生根；
Step2.接种后在培养室先暗培养3-5天，再转入光照时间16h、黑暗8h、光强4000-5000lux、温度23-26℃的环境下全光照培养3-5周直至生根。
9.根据权利要求8所述的苹果砧木“Sprout Free”组织培养种苗商业化繁育方法，其特征在于，所述生根培养基的配方：1/2MS+IBA0.8-1.0mg/L +蔗糖15g/L+琼脂6.8g/L，pH为5.80。
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