CN105900836B - 用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法 - Google Patents

用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法 Download PDF

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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法，包含有腋芽萌发启动培养基，其中：腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS、BA、IBA，在MS、BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基上，对苹果矮化砧木离体叶片产生不定芽的效果好，因此实现了苹果矮化砧木离体叶片高频率不定芽再生。

Description

用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养 方法
一、技术领域
本发明涉及一种产生不定芽的培养基和培养方法，尤其是一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法。
二、背景技术
离体叶片再生不定芽技术是在细胞水平进行诱变育种、体细胞变异筛选、嵌合体分离的基础，也是利用植物遗传工程进行外源基因转移的基础，同时也是在材料较少时实现植物快速克隆的基础。因此用于果树离体叶片的产生不定芽的培养基和培养方法是植物繁殖方法，被广泛地应用在植物的种质创新及新品种选育中。植物叶片培养第一个获得成功的是1953年Steeves 和Susex培养紫箕叶获得了再生不定植株。之后，由于培养基成分的不断研究和完善，越来越多的植物种获得了叶片培养成功。特别是植物遗传工程的发展，使叶片培养研究越来越受到植物育种研究者们的重视，因为植物遗传转化操作的成功应用依赖于离体叶片不定芽再生体系的建立。到现在，植物叶片培养已走过了半个多世纪，获得不定芽再生成功的植物种类也在日益增多，但由于不同物种基因型及遗传背景的复杂性，至今研究者们还不能实现对所有植物种的叶片培养再生。即使已成功的物种，由于不同类型和不同品种其基因型的差异，其再生的难易和所需的培养基条件也存在较大差异。特别是一些果树的品种其离体叶片再生非常困难，因此现有的组培技术都是对特定物种的类型或品种是适宜的，换一个品种或类型可能就是不适宜的或说不是最佳的。如苹果砧木‘M26’、‘MM106’建立了高效离体叶片不定芽再生体系并利用这个再生体系获得了转基因植株，我国吉林农科院选育的苹果抗寒矮化砧木‘GM256’也获得了不定芽再生成功，但同样是吉林农科院选育出的综合性状优于‘GM256’的另一个抗寒矮化砧木‘GM310’的叶片培养再生困难。利用培养‘GM256’的叶片培养基及培养条件，不能成功诱导‘GM310’叶片产生不定芽。利用已报道的苹果属其他种的叶片培养方法来培养‘GM310’也未能成功。表明现有的培养条件都不适宜‘GM310’的叶片培养，需要研究开发一种适宜‘GM310’叶片培养的培养基，为更好的开发利用具有我国自主知识产权的苹果优良砧木‘GM310’奠定基础。
三、发明内容
本发明的技术客体是一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，
本发明的技术客体是一种用于苹果抗寒矮化砧木叶片产生不定芽的培养基。
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法，因此获得了苹果抗寒矮化砧木离体叶片高频率不定芽再生成功。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于果树离体叶片产生不定芽的培养基，包含有腋芽萌发启动培养基，其中：腋芽萌发启动培养基设置为：MS、 BA、IBA。
由于设计了MS、 BA和IBA，在MS、 BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基上，果树离体叶片的产生不定芽的效果好，因此实现了果树离体叶片的产生不定芽的育苗。
本发明设计了，按照离体叶片产生不定芽的不同阶段，还包含有绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基；
其中：腋芽萌发启动培养基设置为：MS、 BA、IBA，绿苗增殖培养基设置为：WPM、BA、 IBA、 GA3、蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：MS、TDZ、NAA、山梨糖醇，幼苗生根培养基设置为包含有：MS(MS1)、IBA、蔗糖。
本发明设计了，腋芽萌发启动培养基设置为：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA +30 g/L蔗糖。
绿苗增殖培养基设置为：WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖。
不定芽诱导培养基设置为：MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L 山梨糖醇。
幼苗生根培养基设置为：MS(MS1) + 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
本发明设计了，MS（Murashige and Skoog）培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
改良MS即MS1：对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 825
KNO3 950
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440，
WPM培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 400
KNO3 190
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
Ca(NO3)2·4H2O 684
无机成分 微量元素
EDTA-NaFe.3H2O 84.2
H3BO3 6.2
MnSO4·H2O 16.9
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.25
有机成分
烟酸 0.5
VB1 1.0
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁烟酸（IBA），萘乙烟酸（NAA），赤霉素（GA3），
碳源：蔗糖，山梨糖醇，
无离子水，
琼脂粉。
本发明设计了，一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，其步骤是：
选择品种编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法。
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的抗寒矮化苹果砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8 分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯烟酸钠用无菌水洗4~6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立的技术目的；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基: WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4-5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3-6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L 山梨糖醇；在培养室中培养实现不定芽培养和离体叶片不定芽诱导培养的技术目的；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.5 厘米以上的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS(MS1) + 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目的。
本发明设计了，所有培养基在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2℃，光照周期为16小时/天。
本发明设计了，MS（Murashige and Skoog）培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
改良MS即MS1：对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 825
KNO3 950
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
WPM培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 400
KNO3 190
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
Ca(NO3)2·4H2O 684
无机成分 微量元素
EDTA-NaFe.3H2O 84.2
H3BO3 6.2
MnSO4·H2O 16.9
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.25
有机成分
烟酸 0.5
VB1 1.0
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁烟酸（IBA），萘乙烟酸（NAA），赤霉素（GA3）。
碳源：蔗糖，山梨糖醇
无离子水
琼脂粉。
本发明设计了，苹果优良抗寒矮化砧木‘GM310’的离体叶片不定芽再生。
本发明的技术效果在于：对苹果砧木‘GM310’叶片不定芽再生很困难这一问题，能有效克服叶片不定芽不能再生和再生率低的问题，成功获得高频率叶片不定芽再生。并获得了不定芽继代繁殖后绿苗的生根。本专利技术可用于砧木的无性繁殖、植物的细胞工程及基因工程的遗传改良等，我们实验室在建立苹果抗寒矮化砧木‘GM256’快繁技术体系的基础上，又建立了综合性状优于‘GM256’的另一苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的试管苗。在‘GM310’试管苗繁殖中，我们发现这一砧木的增殖和生根培养基都和‘GM256’不同，和以前报道的其他苹果砧木的试管苗快繁的培养基也不同，增殖和生根都比较困难。取其离体叶片进行不定芽诱导，不定芽再生困难，表现在用已报道的苹果品种及其砧木叶片培养的培养基都未能诱导‘GM310’叶片获得再生不定芽。这一结果说明已报道的培养基中的某些成分可能不适宜‘GM310’叶片的培养。本专利的发明目的就是解决我国自选苹果优良砧木‘GM310’叶片培养不定芽再生困难的问题，建立‘GM310’叶片不定芽再生技术体系，为这一优良砧木的无性快繁提供技术基础，同时也为利用基因工程和细胞工程技术对这一砧木进行遗传改良提供基础，叶片不定芽再生率高，为85%，有效解决了苹果矮化砧木‘GM310’难再生的难题。
在本技术方案中，改良MS是指MS1。
在本技术方案中，腋芽萌发启动培养基中MS、 BA和IBA为重要技术特征，在用于果树离体叶片的产生不定芽的培养基和培养方法的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。
四、附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的试管苗的建立和增殖的效果图：
其中：1A：腋芽萌发；1B：在WPM上增殖；1C：在MS1上增殖；1D:在MS上增殖
图2为本发明的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的叶片不定芽再生和试管苗生根的效果图：
其中：2A： 培养基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L山梨糖醇上诱导不定芽再生；2B：培养基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10g/L~50 g/L 蔗糖上诱导不定芽再生；2C：培养基MS + 3~7 mg/L BA + 0.1~0.5 mg/L NAA+ 10 g/L~50 g/L 蔗糖上诱导不定芽再生；2D：健康绿苗经生根诱导培养20天生根率在85%以上。
五、具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第一个实施例，其步骤是：
选择品种编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法。
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8 分钟，期间摇动3次，倒出次氯烟酸钠用无菌水洗4次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA+ 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立的技术目的；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基: WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + 0.1mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS+ 0.1 mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/Lg/L 山梨糖醇；在培养室中培养实现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.5 厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS(MS1) + 0.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目的。
在本实施例中，所有培养基在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2℃，光照周期为16小时/天。
在本实施例中，基本培养基
MS（Murashige and Skoog）培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
改良MS即MS1：对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 825
KNO3 950
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
WPM培养基组成：
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 400
KNO3 190
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
Ca(NO3)2·4H2O 684
无机成分 微量元素
EDTA-NaFe.3H2O 84.2
H3BO3 6.2
MnSO4·H2O 16.9
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.25
有机成分
烟酸 0.5
VB1 1.0
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
琼脂粉 6000
植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁烟酸（IBA），萘乙烟酸（NAA），赤霉素（GA3）。
碳源：蔗糖，山梨糖醇
无离子水
琼脂粉。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第二个实施例，其步骤是：
选择品种编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法。
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8 分钟，期间摇动5次，倒出次氯烟酸钠用无菌水洗6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA+ 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立的技术目的；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基: WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS+ 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 10 50 g/L 山梨糖醇；在培养室中培养实现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.9 厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS(MS1) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目的。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第三个实施例，其步骤是：
选择品种编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法。
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8 分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯烟酸钠用无菌水洗4~6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/LIBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立的技术目的；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基: WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4~ 5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3~6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L 山梨糖醇；在培养室中培养实现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.5 厘米以上的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS(MS1) + 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目的。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第四个实施例，其步骤是：
选择品种编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法。
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8 分钟，期间摇动4次，倒出次氯烟酸钠用无菌水洗5次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA+ 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立的技术目的；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基: WPM + 0.75 mg/L BA + 0.25 mg/L IBA + 0.25mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切4刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS+ 0.28 mg/L TDZ + 0.35mg/L NAA + 30 g/L山梨糖醇；在培养室中培养实现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.7厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS(MS1) + 1.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目的。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第一个实施例，按照离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基；其中：
腋芽萌发启动培养基设置为：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖。
绿苗增殖培养基设置为：WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + 0.1mg/L GA3 +30 g/L蔗糖。
不定芽诱导培养基设置为：MS + 0.1mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/L 山梨糖醇。
幼苗生根培养基设置为：改良MS(MS1) + 0.1mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养的试验结果：苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的芽段成功获得了腋芽萌发生长的绿芽梢（图1A），说明培养基MS 、BA和IBA对‘GM310’的腋芽的启动培养是有效的。
腋芽萌发获得的无菌绿苗转移到增殖培养基上继代增殖培养，结果表明在培养基WPM 、BA 、 IBA 、GA3 、蔗糖上生长最好，表现为苗既有增殖生长又有伸长生长，且叶色绿(图1B)；但在添加相同植物生长调节物质的改良MS（MS1）上增殖较差，苗表现老化，叶色也较黄（图1C）；在MS培养基上虽然有增殖，但苗不伸长，且表现黄化（图1D），也不是理想的增殖培养基。
叶片产生不定芽的适宜培养基为MS 、 TDZ 、NAA 、 山梨糖醇（图2A），不定芽再生率为85%。而在培养基MS 、TDZ 、 NAA 、蔗糖（图2B）和培养基MS 、 BA 、 NAA 、蔗糖（图2C）上，不定芽再生率都在15%以下。
健康绿苗经生根诱导培养20天,生根率在85%以上（图2D），说明所选用生根培养基能A： 培养基MS 、TDZ 、NAA 、 山梨糖醇上诱导不定芽再生；B：培养基MS、TDZ、NAA 、蔗糖上诱导不定芽再生；C：培养基MS 、 BA 、NAA 、蔗糖上诱导不定芽再生有效诱导‘GM310’试管苗的生根。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第二个实施例，按照离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基；其中：
腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖。
绿苗增殖培养基设置为包含有：WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/LGA3 + 30 g/L蔗糖。
不定芽诱导培养基设置为包含有：MS + 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 50 g/L山梨糖醇。
幼苗生根培养基设置为包含有：改良MS(MS1) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第三个实施例，按照离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基；其中：
腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖。
绿苗增殖培养基设置为包含有：WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA+ 0.1~ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖。
不定芽诱导培养基设置为包含有：MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA +10 g/L~50 g/L 山梨糖醇。
幼苗生根培养基设置为包含有：改良MS(MS1) + 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第四个实施例，按照离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基；其中：
腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖。
绿苗增殖培养基设置为包含有：WPM + 0.75 mg/L BA + 0.21mg/L IBA + 0.3mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖。
不定芽诱导培养基设置为包含有：MS + 0.21 mg/L TDZ + 0.3mg/L NAA + 30 g/Lg/L 山梨糖醇。
幼苗生根培养基设置为包含有：改良MS(MS1) + 1.1mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
本发明具有下特点：
1、由于设计了MS、 BA和IBA，在MS、 BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基，对果树离体叶片的产生不定芽的效果好，因此实现了果树离体叶片的产生不定芽的育苗。
2、由于设计了绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基实现了对萌发启动腋芽的后续培育，提高了育苗率。
3、由于设计了基本培养基和碳源，通过MS、WPM、MS(MS1)、山梨糖醇对果树离体叶片细胞的诱导，激发了果树离体叶片体细胞的不定芽分化能力。
4、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值范围的技术特征取得了很好的技术效果。
5、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用，通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具有很好的市场价值。
还有其它的与腋芽萌发启动培养基中MS、 BA和IBA的相同或相近似的其它技术特征都是本发明的实施例之一，并且以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为满足专利法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合的实施例都进行描述。
因此在用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法技术领域内，凡是包含有内层1设置为化学肥料与植物秸秆或植物叶体的高压形成的混合体的技术内容都在本发明的保护范围内。
上述实施例只是本发明所提供的用于苹果矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基，其特征是：针对苹果抗寒矮化砧木‘GM310’，包含有腋芽萌发启动培养基，其中：腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS、 BA、IBA，
按照离体叶片产生不定芽的不同阶段，还包含有绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基，
其中：绿苗增殖培养基设置为：WPM、 BA、 IBA、 GA3、蔗糖，不定芽诱导培养基设置为包含有：MS、TDZ、NAA、山梨糖醇，幼苗生根培养基设置为：改良MS、IBA、蔗糖，
腋芽萌发启动培养基设置为：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
绿苗增殖培养基设置为：WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖，
不定芽诱导培养基设置为：MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50g/L 山梨糖醇；
幼苗生根培养基设置为：改良MS+ 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，
MS（Murashige and Skoog）培养基组成：
WPM培养基组成：
改良MS：对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度mg/L
NH4NO3 825
KNO3 950
KH2PO4 170
MgSO4·7 H2O 370
CaCl2·2 H2O 440。
2.一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，其步骤是：
选择编号为‘GM310’的苹果抗寒矮化砧木并且建立‘GM310’的离体叶片产生不定芽的培养方法，
a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木‘GM310’的小树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加入其中有效氯为5%的次氯酸钠溶液，杀菌8 分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯酸钠用无菌水洗4~6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基：MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗建立；
b、绿苗培养:启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖；
c、不定芽培养:试管苗继代增殖培养生长至4~5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3~6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为：MS+ 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L 山梨糖醇；在培养室中培养实现离体叶片不定芽诱导培养；
d、幼苗生根培养：切取生长高度在1.5 厘米以上的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS+ 0.1～2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根，
所有培养基在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2℃，光照周期为16小时/天，
MS（Murashige and Skoog）培养基组成：
改良MS：对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度mg/L
NH4NO3 825
KNO3 950
KH2PO4 170
MgSO4·7 H2O 370
CaCl2·2 H2O 440
WPM培养基组成：
。
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