CN105557522A - 一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，包括以下步骤：（1）选材；（2）无菌试管苗增殖培养；（3）诱导体胚形成培养；（4）体细胞胚的生长与分化培养；（5）壮苗生根培养。本发明所述的梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，使种子繁殖困难的梨树通过体细胞胚胎发生途径快繁，并使得植株移栽成活率达到95%以上，种苗生长健壮，可有效解决优良种苗种质退化问题，也可为生产上提供大量优质提纯复壮的苗木，此外，还可为梨树遗传转化或诱变育种选育新品种提供一个理想的受体体系。

Description

一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法
技术领域
本发明涉及一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，属于植物学领域。
背景技术
梨树是蔷薇科梨属，多年生落叶果树，乔木,在全球均有广泛分布，全世界约有35个原生种，野生分布于欧、亚及非洲，分类上分为东方梨及西洋梨两大类。中国梨栽培面积和产量仅次于苹果。
梨树为一种具有较高开发价值的树种，目前，通常采用的繁殖方式为扦插繁殖，而此种繁殖方式易感染叶斑病等真菌性病害，春夏季其又易受蚜虫危害，其病毒严重，叶片花斑易脱落，良种化程度降低；而劣质种苗的使用又导致梨树固有的优良特性日益丧失，这在一定程度上约束了该树种的发展和推广应用，因此,选择、繁育优良梨树品系成为一个十分突出的生产问题,组培快繁是梨树良种产业化的一种有效途径，相关方面的报道也较多，但有关梨树叶片直接诱导体细胞胚及再生快繁系统的技术研究未见有成功的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够有效为生产上提供量大质优、提纯复壮的梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法。
为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选材：于春季选取生长健壮、性状表现优良的单株，剪取嫩枝，经清洗、灭菌处理后，剪取1-2cm茎段，将茎段插入芽启动培养基上，在培养室温度白天22±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1500—2000lx，光照时间12h／d的条件下，进行30-40d的培养，形成无菌试管苗；
（2）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1-2个腋芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，22-25d后继代1次，形成梨树无菌试管苗再生体系；
（3）诱导体胚形成培养：以试管苗第2-4片展开叶为外植体，接种在诱导体胚形成培养基上，暗培养15-20d，诱导不定芽的形成；
（4）体细胞胚的生长与分化培养：将诱导体胚形成培养基培养的外植体转接到体细胞胚的生长与分化培养基上，然后暗室培养40-45d，中间继代一次，外植体上形成许多丛生芽；
（5）壮苗生根培养：将步骤（4）生长发育且长度为5-6cm的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，培养30-35d，根长至2cm以上时，进行炼苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到种植地进行常规管理。
进一步，所述的芽启动培养基为：1/2改良SH+0.5～0.8mgL-16-BA+3～5mgL- 12,4-D+0.1～0.2mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
所述的试管苗增殖培养基为：1/2改良SH+0.5～1.0mgL-16-BA+1～2mgL-12,4-D+0.3～0.5mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
所述的诱导体胚形成培养基为：1/2改良MS+0.5～1.0mgL-16-BA+0.3～0.5mgL-12,4-D+0.5～1.0mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
所述的体细胞胚的生长与分化培养基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.0～1.5mgL-16-BA+0.5～1.0mgL-12,4-D+2.0～3.0mgL-1KT+6.0～7.0gL-1琼脂+20gL-1蔗糖+2.0～2.5%phytagel；
所述的体细胞胚的壮苗生根培养基，包括1/2改良SH+0.2～0.5mgL-16-BA+0.05～0.1mgL-12,4-D+0.1～0.15mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖,且pH值为5.8～6.0。
更进一步，所述的改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾2100mg/L；
硫酸铵583mg/L；
七水硫酸镁210mg/L；
二水氯化钙220mg/L；
无水磷酸二氢钾380mg/L；
乙二胺四乙酸二钠3.5mg/L；
七水硫酸亚铁5.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰15.2mg/L；
硫酸锌1.5mg/L；
硼酸6.2mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.1mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
而所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾1900mg/L；
硫酸铵1500mg/L；
七水硫酸镁350mg/L；
二水氯化钙420mg/L；
无水磷酸二氢钾185mg/L；
乙二胺四乙酸二钠26.8mg/L；
七水硫酸亚铁15.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰22.5mg/L；
硫酸锌6.8mg/L；
硼酸5.4mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.02mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
本发明的有益效果是：本发明所述的梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，使得植株移栽成活率可达到96%以上，种苗生长健壮，可有效解决优良种苗种质退化问题，也可为生产上提供大量优质提纯复壮的梨树苗木，此外，还可为梨树遗传转化或诱变育种选育新品种提供一个理想的受体体系。
具体实施方式
下面将结合具体实施例详细说明本发明的具体实施方式：
以下实施例中所应用到的改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾2100mg/L；
硫酸铵583mg/L；
七水硫酸镁210mg/L；
二水氯化钙220mg/L；
无水磷酸二氢钾380mg/L；
乙二胺四乙酸二钠3.5mg/L；
七水硫酸亚铁5.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰15.2mg/L；
硫酸锌1.5mg/L；
硼酸6.2mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.1mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
而所述的改良SH则包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾1900mg/L；
硫酸铵1500mg/L；
七水硫酸镁350mg/L；
二水氯化钙420mg/L；
无水磷酸二氢钾185mg/L；
乙二胺四乙酸二钠26.8mg/L；
七水硫酸亚铁15.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰22.5mg/L；
硫酸锌6.8mg/L；
硼酸5.4mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.02mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
实施例1
梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，包括以下步骤：
（1）选材：于春季选取生长健壮、性状表现优良的单株，剪取嫩枝，经清洗、灭菌处理后，剪取1-2cm茎段，将茎段插入芽启动培养基上，芽启动培养基为：1/2改良SH+0.5mgL-16-BA+3mgL-12,4-D+0.1mgL-1NAA+6.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1%phytagel,且pH值为5.8，在培养室温度白天22±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1500—2000lx，光照时间12h／d的条件下，进行30d的培养，形成无菌试管苗；
（2）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1-2个腋芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，试管苗增殖培养基为：1/2改良SH+0.5mgL-16-BA+1mgL-12,4-D+0.3mgL-1NAA+6.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1%phytagel,且pH值为5.8，22d后继代1次，形成梨树无菌试管苗再生体系；
（3）诱导体胚形成培养：以试管苗第2-4片展开叶为外植体，接种在诱导体胚形成培养基上，诱导体胚形成培养基为：1/2改良MS+0.5mgL-16-BA+0.3mgL-12,4-D+0.5mgL- 1NAA+6.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1%phytagel,且pH值为5.8，暗培养15d，诱导不定芽的形成；
（4）体细胞胚的生长与分化培养：将诱导体胚形成培养基培养的外植体转接到体细胞胚的生长与分化培养基上，所述的体细胞胚的生长与分化培养基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.0mgL-16-BA+0.5mgL-12,4-D+2.0mgL-1KT+6.0gL-1琼脂+20gL-1蔗糖+2.0%phytagel，然后暗室培养40d，中间继代一次，外植体上形成许多丛生芽；
（5）壮苗生根培养：将步骤（4）生长发育且长度为5-6cm的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，体细胞胚的壮苗生根培养基，包括1/2改良SH+0.2mgL-16-BA+0.05mgL- 12,4-D+0.1mgL-1NAA+6.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖,且pH值为5.8，培养30d，根长至2cm以上时，进行炼苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到种植地进行常规管理。
实施例2
（1）选材：于春季选取生长健壮、性状表现优良的单株，剪取嫩枝，经清洗、灭菌处理后，剪取1-2cm茎段，将茎段插入芽启动培养基上，芽启动培养基为：1/2改良SH+0.8mgL-16-BA+5mgL-12,4-D+0.2mgL-1NAA+7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.3%phytagel,且pH值为6.0，在培养室温度白天22±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1500—2000lx，光照时间12h／d的条件下，进行40d的培养，形成无菌试管苗；
（2）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1-2个腋芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，试管苗增殖培养基为：1/2改良SH+1.0mgL-16-BA+2mgL-12,4-D+0.5mgL-1NAA+7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.3%phytagel,且pH值为6.0，25d后继代1次，形成梨树无菌试管苗再生体系；
（3）诱导体胚形成培养：以试管苗第2-4片展开叶为外植体，接种在诱导体胚形成培养基上，诱导体胚形成培养基为：1/2改良MS+1.0mgL-16-BA+0.5mgL-12,4-D+1.0mgL- 1NAA+7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.3%phytagel,且pH值为6.0，暗培养20d，诱导不定芽的形成；
（4）体细胞胚的生长与分化培养：将诱导体胚形成培养基培养的外植体转接到体细胞胚的生长与分化培养基上，所述的体细胞胚的生长与分化培养基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.5mgL-16-BA+1.0mgL-12,4-D+3.0mgL-1KT+7.0gL-1琼脂+20gL-1蔗糖+2.5%phytagel，然后暗室培养45d，中间继代一次，外植体上形成许多丛生芽；
（5）壮苗生根培养：将步骤（4）生长发育且长度为5-6cm的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，体细胞胚的壮苗生根培养基，包括1/2改良SH+0.5mgL-16-BA+0.1mgL- 12,4-D+0.15mgL-1NAA+7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖,且pH值为6.0，培养35d，根长至2cm以上时，进行炼苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到种植地进行常规管理。
实施例3
（1）选材：于春季选取生长健壮、性状表现优良的单株，剪取嫩枝，经清洗、灭菌处理后，剪取1-2cm茎段，将茎段插入芽启动培养基上，芽启动培养基为：1/2改良SH+0.6mgL-16-BA+4mgL-12,4-D+0.15mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.2%phytagel,且pH值为5.9，在培养室温度白天22±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1500—2000lx，光照时间12h／d的条件下，进行35d的培养，形成无菌试管苗；
（2）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1-2个腋芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，试管苗增殖培养基为：1/2改良SH+0.8mgL-16-BA+1.5mgL-12,4-D+0.4mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.2%phytagel,且pH值为5.9，24d后继代1次，形成梨树无菌试管苗再生体系；
（3）诱导体胚形成培养：以试管苗第2-4片展开叶为外植体，接种在诱导体胚形成培养基上，诱导体胚形成培养基为：1/2改良MS+0.8mgL-16-BA+0.4mgL-12,4-D+0.8mgL- 1NAA+6.5gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.2%phytagel,且pH值为5.9，暗培养18d，诱导不定芽的形成；
（4）体细胞胚的生长与分化培养：将诱导体胚形成培养基培养的外植体转接到体细胞胚的生长与分化培养基上，所述的体细胞胚的生长与分化培养基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.2mgL-16-BA+0.8mgL-12,4-D+2.5mgL-1KT+6.5gL-1琼脂+20gL-1蔗糖+2.2%phytagel，然后暗室培养42d，中间继代一次，外植体上形成许多丛生芽；
（5）壮苗生根培养：将步骤（4）生长发育且长度为5-6cm的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，体细胞胚的壮苗生根培养基，包括1/2改良SH+0.4mgL-16-BA+0.08mgL- 12,4-D+0.12mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂+30gL-1蔗糖,且pH值为5.9，培养32d，根长至2cm以上时，进行炼苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到种植地进行常规管理。
本发明利用近几年植物细胞和组织培养中的热点研究植物体细胞胚胎发生技术快繁种子繁殖困难的梨树才是解决上述问题的根本途径,它不但能解决梨树种质退化的问题，达到优良种苗、提纯复壮及快速繁殖的目的，而且也是高效再生种子来源的重要途径，还是进行遗传转化或诱变育种选育新品种的理想受体材料。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选材：于春季选取生长健壮、性状表现优良的单株，剪取嫩枝，经清洗、灭菌处理后，剪取1-2cm茎段，将茎段插入芽启动培养基上，在培养室温度白天22±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1500—2000lx，光照时间12h／d的条件下，进行30-40d的培养，形成无菌试管苗；
（2）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1-2个腋芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，22-25d后继代1次，形成梨树无菌试管苗再生体系；
（3）诱导体胚形成培养：以试管苗第2-4片展开叶为外植体，接种在诱导体胚形成培养基上，暗培养15-20d，诱导不定芽的形成；
（4）体细胞胚的生长与分化培养：将诱导体胚形成培养基培养的外植体转接到体细胞胚的生长与分化培养基上，然后暗室培养40-45d，中间继代一次，外植体上形成许多丛生芽；
（5）壮苗生根培养：将步骤（4）生长发育且长度为5-6cm的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，培养30-35d，根长至2cm以上时，进行炼苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到种植地进行常规管理。
2.根据权利要求1所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，所述的芽启动培养基为：1/2改良SH+0.5～0.8mgL-16-BA+3～5mgL-12,4-D+0.1～0.2mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
3.根据权利要求1所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，所述的试管苗增殖培养基为：1/2改良SH+0.5～1.0mgL-16-BA+1～2mgL-12,4-D+0.3～0.5mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，所述的诱导体胚形成培养基为：1/2改良MS+0.5～1.0mgL-16-BA+0.3～0.5mgL-12,4-D+0.5～1.0mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖+0.1～0.3%phytagel,且pH值为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，所述的体细胞胚的生长与分化培养基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.0～1.5mgL-16-BA+0.5～1.0mgL-12,4-D+2.0～3.0mgL-1KT+6.0～7.0gL-1琼脂+20gL-1蔗糖+2.0～2.5%phytagel。
6.根据权利要求1所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，所述的体细胞胚的壮苗生根培养基，包括1/2改良SH+0.2～0.5mgL-16-BA+0.05～0.1mgL- 12,4-D+0.1～0.15mgL-1NAA+6.0～7.0gL-1琼脂+30gL-1蔗糖,且pH值为5.8～6.0。
7.根据权利要求4或5所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于所述的改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾2100mg/L；
硫酸铵583mg/L；
七水硫酸镁210mg/L；
二水氯化钙220mg/L；
无水磷酸二氢钾380mg/L；
乙二胺四乙酸二钠3.5mg/L；
七水硫酸亚铁5.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰15.2mg/L；
硫酸锌1.5mg/L；
硼酸6.2mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.1mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
8.根据权利要求2、3或6所述的一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂，且所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾1900mg/L；
硫酸铵1500mg/L；
七水硫酸镁350mg/L；
二水氯化钙420mg/L；
无水磷酸二氢钾185mg/L；
乙二胺四乙酸二钠26.8mg/L；
七水硫酸亚铁15.9mg/L，
所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰22.5mg/L；
硫酸锌6.8mg/L；
硼酸5.4mg/L；
碘化钾1.0mg/L；
钼酸钠0.2mg/L；
硫酸铜0.02mg/L；
氯化钴0.05mg/L，
所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素10.0mg/L；
烟酸1.0mg/L；
盐酸吡哆醇1.0mg/L；
肌醇100.0mg/L。
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