CN109156359B - 一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，步骤如下：(1)外植体的获取：来源两种，一种为叶龄在20～50d的砀山酥梨组培苗叶片；另一种，先利用梨种无菌播种，再采用无菌实生苗的叶片作为外植体；(2)外植体的预处理：在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再置于预培养培养基暗培养；(3)不定芽的诱导及增殖：将叶片接种至诱导培养基上暗培养，再转至光周期培养室诱导不定芽；剪下不定芽，接种至增殖培养基。本发明首次建立了遗传稳定的砀山酥梨叶片直接再生体系，叶片再生率达78.6％，平均每叶产生不定芽数3.8，褐化率0；此方法不仅可由梨叶片器官直接产生大量不定芽，还具有遗传稳定、周期短、成本低等优势。

Description

一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法
技术领域
本发明涉及植物细胞工程技术领域，尤其涉及一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法。
背景技术
梨是世界性果树树种，属蔷薇科，在五大洲的85个国家均有梨的栽培和分布。梨栽培历史悠久，至少有3000多年的历史，中国早在先秦时代，《诗经·秦风晨风篇》就有记载：“山有苞棣，隰有树檖”。目前梨属植物中被广泛认可的有22种，其中，中国起源的就占13种，因此，中国乃世界上梨品种资源最为丰富的国家。我国梨的主要栽培种包括：白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨，其中白梨和砂梨的栽培面积最为广泛。
砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Dangshan Su)属于白梨系品种，在我国栽培面积达23.3万hm2，为我国栽培面积最大的梨品种，也是世界第一大商业化栽培品种。砀山酥梨的年产量约4百万吨，具有产量高、耐贮藏等优良性状。与其他栽培品种相比，砀山酥梨具有相对低的杂合率。梨果新鲜味美、果肉酥脆多汁，酸甜可口，风味芳香而且具有较高的营养价值。
目前，随着消费者生活水平的提高以及梨品种的丰富，砀山酥梨石细胞含量较高、石细胞团面积大的固有缺陷日益凸显，严重影响了其市场份额。虽然在生产上采取一些调控栽培措施可以在一定程度上改善砀山酥梨果实品质，但是该方法并不能从根本上解决砀山酥梨品质问题，并且各地配套栽培措施水平良莠不齐，不能同步、整体的提升其品质。此外，梨是典型的自交不亲和性物种，遗传背景复杂，且具有杂合性，这使得群体遗传研究难度大，加之梨童期长等原因，导致传统的梨遗传育种改良周期长、效率低。因此，基于植物组织培养、离体组织再生为主体的遗传转化技术在梨上的应用，可以极大推动梨的种质创新和新品种的选育过程。利用基因工程对砀山酥梨品质进行分子改良是其产业发展中的重要任务。
与其他物种相比，梨遗传转化起步较晚。1988年，Viseur等率先开始了梨属植物上的转基因工作，他用梨试管苗叶片作外植体，用带致瘤质粒的农杆菌(pTiT37)感染转化，虽然成功诱导出了瘤组织并分化出了不定芽，但最终并未能获得转基因植株。1996年，Fabienne Mourgues等通过农杆菌EHA101介导法将含有npt II和gus基因的双元载体pFAJ3000转入西洋梨康佛伦斯中，这是第一次梨转化成功的报道。此后，各个国家的科学者对梨的遗传转化都做了进一步的研究，但同国外的研究相比，中国关于该方面的研究比国外晚了近10年，而且在现有的报道中，梨遗传转化主要集中在西洋梨品种上，东方梨鲜有报道，特别是属于东方梨的白梨系品种砀山酥梨。
建立遗传稳定、周期短的再生体系是进行植物遗传转化的前提。对于植物组织培养过程中的器官发生途径，可以分为间接器官发生与直接器官发生两种。其中，间接器官发生途径需经过愈伤组织阶段，该阶段耗时长且容易发生体细胞无性系变异，这种自然的遗传变异不定向、不可控，会导致遗传转化的结果可信度下降，同时也可能使得外源基因丢失、沉默，或者使得再生植株产生其他不利的变异性状，因此，此种器官发生途径不稳定，不适用于以性状定向改良为主旨的基因工程育种；而直接器官发生途径，可以不经过愈伤组织阶段直接分化出器官；相比间接器官发生途径而言，直接器官发生途径的周期短、变异率低、遗传稳定，更适合于遗传转化。
目前为止，梨叶片再生途径多为间接器官发生途径，因此，建立一种砀山酥梨遗传稳定的再生体系迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种遗传稳定的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，以建立砀山酥梨高效稳定的再生体系。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
外植体的获取方式有以下两种，任选其一；
方式一：选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；
方式二：选择梨种子进行层积处理，层积处理后，先利用0.8～1.2％氯化汞消毒10～15min，再利用无菌水清洗3～5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940～960mg/L，NH4NO3使用浓度为815～835mg/L，其余成分含量不变，另附加5～7g/L琼脂，pH 6.8～7.0；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5～2.5天，以完成外植体的预处理；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10～30g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5～3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2～3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0～3.0mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3，培养基pH5.8～6.0；
增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5～3.0mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L蔗糖+6～7g/L琼脂，培养基pH 5.8～6.0；
所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41～42mg/L，KH2PO4使用浓度为21～21.5mg/L，其余成分含量不变。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，层积处理指：将梨种子埋在湿沙中，置于1～10℃温度中，经1～3个月的低温处理，有效解除休眠。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为950mg/L，NH4NO3使用浓度为825mg/L，其余成分含量不变，另附加6g/L琼脂，pH 7.0。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，不定芽诱导培养基具体为：NN69培养基+2.5mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.75ml/L AgNO3，培养基pH5.9。
作为本发明的优选方式之一，所述NN69培养基配方为：每升培养基中含720mg/LNH4NO3，950mg/L KNO3，185mg/L MgSO4·7H2O，166mg/L CaCl2·2H2O，68mg/L KH2PO4，37.3mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，3.0mg/L H3BO3，25mg/L MnSO4·4H2O，10mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.08mg/L CuSO4·5H2O，100mg/L肌醇，2.0mg/L甘氨酸，5.0mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇B6，0.5mg/L盐酸硫胺素B1。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，增殖培养基具体为：改良MS2培养基+2.25mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，培养基pH 5.9。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41.59mg/L，KH2PO4使用浓度为21.25mg/L，其余成分含量不变。
作为本发明的优选方式之一，还包括砀山酥梨叶片不定芽的组织学观察以及运用梨SCoT分子标记体系检测遗传稳定性的步骤。
作为本发明的优选方式之一，所述砀山酥梨叶片不定芽再生的组织学观察，指采用石蜡切片法制片，HE苏木精尹红染色，中性树脂封片，最后置于显微镜下观察。
作为本发明的优选方式之一，所述运用梨SCoT分子标记体系检测遗传稳定性，指提取母株和子代植株的DNA，运用SCoT分子标记体系技术检测其DNA多态性，分析两者之间DNA水平的变异。
本发明相比现有技术的优点在于：
本发明公开了一种遗传稳定的梨叶片器官直接发生型再生途径的构建方法，首次建立了遗传稳定的砀山酥梨叶片直接再生体系，叶片再生率可达到78.6％，平均每叶产生不定芽数为3.8，褐化率为0；此方法不仅可由梨叶片器官直接产生大量的不定芽，而且方法简单方便、节约成本，可以在植物组织培养和遗传转化中广泛应用。另外，本方法以砀山酥梨为材料，该品种为我国栽培面积最大梨品种，不但有利于为其他白梨系品种提供依据，还可以推动梨的组织培养及遗传转化进程。具体优点如下：
(1)培养基的配制简单省时、成本低：本方法所需要的培养基都是常用基础培养基或加以改良，例如NN69，改良MS1和改良MS2，激素是最常用的6-BA和IBA，不需要加入较为昂贵的细胞分裂素TDZ等，这样工厂化繁育与大批量遗传转化可以极大的节约成本。
(2)扩充了叶片来源并降低了叶片的选择的要求：有之前报道，叶片的选择在叶龄20～30d，而本方法选择20～50d的叶片均可以长出不定芽；特别是无菌实生苗生长速度比组培苗快，叶片数目比组培苗多，而且无菌实生苗可以持续不断的快速生长，满足叶片的大量需求；组培苗继代次数过多会发生茎尖坏死、叶片展不开等现象，从而极大的限制的外植体的获取数量，利用无菌实生苗可以有效避免此类问题。
(3)再生体系高效、周期短：以往的梨再生体系均是通过间接再生途径，但脱分化、再分化过程耗时久，有些品种出愈率低或者愈伤组织分化率低，限制了再生体系的建立；此外，脱分化、再分化需要在不同种类的培养基之间转接，费时费力，也提高了成本；本发明建立的方法可以直接从砀山酥梨叶片上再生不定芽，有效缩短了再生植株形成的时间，可以短时间的获得大量再生植株，而且仅需要一种诱导培养基即可获得再生植株，简化了操作，节约了成本。
(4)再生体系遗传稳定：经过愈伤组织分化的植株，不可避免的会发生体细胞变异，导致再生植株性状发生改变，无论对遗传转化还是工厂化扩繁都是极其不利的，本方法诱导的不定芽未经过愈伤组织而直接产生于叶片的表皮或近表皮等表层细胞，通过分子标记检测发现子代与母本谱带带型完全一致，未发生变异，遗传稳定性高；该发明可为开展砀山酥梨基因工程育种和工厂化扩繁奠定基础。
附图说明
图1是实施例4中梨无菌实生苗的萌发状态图；
图2是实施例4中砀山酥梨叶片的预处理过程图(图2a为暗培养处理开始前，图2b为暗培养处理后)；
图3是实施例4中砀山酥梨叶片不定芽诱导图(图3a为诱导前期，图3b为诱导后期)；
图4是实施例4中砀山酥梨叶片直接再生的不定芽状态图；
图5是实施例4中砀山酥梨叶片不定芽的增殖培养图；
图6是实施例5中砀山酥梨叶片不定芽的再生显微观察结果图；
图7是实施例6中砀山酥梨母株及再生子代植样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切3个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养2天，以完成外植体的预处理；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+20g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.8ml/LAgNO3；所述改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为950mg/L，NH4NO3使用浓度为825mg/L，其余成分含量不变，另附加6g/L琼脂，pH 6.9；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2.5cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.5mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.75ml/L AgNO3，培养基pH 5.9；
增殖培养基为：改良MS2培养基+2.25mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，培养基pH 5.9；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41.59mg/L，KH2PO4使用浓度为21.25mg/L，其余成分含量不变。
本实施例砀山酥梨叶片再生率可达到78.6％，平均每叶产生不定芽数为3.8，褐化率为0。
实施例2
本实施例的一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
选择梨种子进行层积处理(将梨种子埋在湿沙中，置于1℃温度中，经1个月的低温处理，有效解除休眠)，层积处理后，先利用0.8％氯化汞消毒10min，再利用无菌水清洗3次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940mg/L，NH4NO3使用浓度为815mg/L，其余成分含量不变，另附加5g/L琼脂，pH 6.8；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5天，以完成外植体的预处理；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10g/L山梨醇+6g/L琼脂+0.5ml/L AgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+28g/L山梨醇+6g/L琼脂+0.5ml/L AgNO3，培养基pH 5.8；
增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基pH 5.8；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41mg/L，KH2PO4使用浓度为21mg/L，其余成分含量不变。
本实施例砀山酥梨叶片再生率可达到78.6％，平均每叶产生不定芽数为3.8，褐化率为0。
实施例3
本实施例的一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
选择梨种子进行层积处理(将梨种子埋在湿沙中，置于10℃温度中，经3个月的低温处理，有效解除休眠)，层积处理后，先利用1.2％氯化汞消毒15min，再利用无菌水清洗5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为960mg/L，NH4NO3使用浓度为835mg/L，其余成分含量不变，另附加7g/L琼脂，pH 7.0；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养2.5天，以完成外植体的预处理；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+30g/L山梨醇+7g/L琼脂+1.0ml/L AgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+32g/L山梨醇+7g/L琼脂+1.0ml/L AgNO3，培养基pH 6.0；
增殖培养基为：改良MS2培养基+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+32g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH 6.0；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为42mg/L，KH2PO4使用浓度为21.5mg/L，其余成分含量不变。
本实施例砀山酥梨叶片再生率可达到78.6％，平均每叶产生不定芽数为3.8，褐化率为0。
实施例4
本实施例的一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
选择梨种子进行层积处理(将梨种子埋在湿沙中，置于5℃温度中，经2个月的低温处理，有效解除休眠)，层积处理后，先利用1.0％氯化汞消毒12min，再利用无菌水清洗4次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体(图1为梨无菌实生苗的萌发状态图)；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为950mg/L，NH4NO3使用浓度为825mg/L，其余成分含量不变，另附加6g/L琼脂，pH 6.9；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切3个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养2天，以完成外植体的预处理(图2为砀山酥梨叶片的预处理过程图，图2a为暗培养处理开始前，图2b为暗培养处理后)；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+20g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.8ml/LAgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.8周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽(图3为砀山酥梨叶片不定芽诱导图，图3a为诱导前期，图3b为诱导后期)；待不定芽生长2.5cm时，剪下不定芽(见图4)，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁(图5为砀山酥梨叶片不定芽的增殖培养图)；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.5mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.75ml/L AgNO3，培养基pH 5.9；
增殖培养基为：改良MS2培养基+2.25mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，培养基pH 5.9；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41.59mg/L，KH2PO4使用浓度为21.25mg/L，其余成分含量不变。
本实施例砀山酥梨叶片再生率可达到78.6％，平均每叶产生不定芽数为3.8，褐化率为0。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中砀山酥梨叶片不定芽的组织学观察实验，包括如下具体步骤：
一、石蜡切片制作
1、取材：取新鲜砀山酥梨叶片不定芽，用固定液固定24h以上，再将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，最后，将修切好的砀山酥梨叶片不定芽和对应的标签放于脱水盒内；
2、脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里，于脱水机内依次进行梯度酒精脱水，即，75％酒精4h、85％酒精2h、90％酒精2h、95％酒精1h、无水乙醇30min、无水乙醇30min、醇苯5～10min、二甲苯5～10min、二甲苯5～10min、65°融化石蜡1h、65°融化石蜡1h、65°融化石蜡1h；
3、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前，将组织从脱水盒内取出，并按照包埋面的要求放入包埋框，并贴上对应的标签；接着，于-20°冻台冷却，待蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；
4、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上进行切片，厚4μm；切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片；水烤干蜡烤化后，取出常温保存备用。
二、HE染色
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯20min、二甲苯20min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、75％酒精5min，自来水洗；
2、苏木素染色：切片入苏木素染液染3～5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；
3、伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min；
4、脱水封片：切片依次放入无水乙醇5min、无水乙醇5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲苯5min、二甲苯5min透明，中性树胶封片；
5、显微镜镜检，图像采集分析。
图6为砀山酥梨叶片不定芽的再生显微观察结果，由图6可知，砀山酥梨叶片不定芽直接起源于叶片的表皮或近表皮等表层细胞，并未通过愈伤组织分化而来。
实施例6
本实施例运用SCoT分子标记体系检测上述实施例中再生体系遗传稳定性，包括如下具体步骤：
先利用DNA提取试剂盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit(购自全式金生物技术有限公司)提取母株和不定芽再生植株(随机抽取3株)的DNA；再分别以母株和不定芽再生植株的DNA为模板，利用梨SCoT-PCR反应体系进行PCR扩增；最后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA多态性。其中，梨SCoT-PCR反应体系为：模板DNA 30mg/L，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，10×Easy Taq Buffer(2mmol/L，含Mg 2+)2.5μL，总体积25μL；SCoT引用选用多态性及重复性较好的SCoT5(5’-CAACAATGGCTACCACGA-3’)完成。
琼脂糖凝胶电泳检测如图7所示(图中，M表示Marker，泳道1表示砀山酥梨母株样品，泳道2-4表示再生子代植株样品)，分析图7可知，子代与母本谱带的带型完全一致，未发生变异，说明子代与母株之间未发生明显变异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)外植体的获取：
外植体的获取方式有以下两种，任选其一；
方式一：选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；
方式二：选择砀山酥梨种子进行层积处理，层积处理后，先利用0.8～1.2％氯化汞消毒10～15min，再利用无菌水清洗3～5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940～960mg/L，NH4NO3使用浓度为815～835mg/L，其余成分含量不变，另附加5～7g/L琼脂，pH 6.8～7.0；
(2)外植体的预处理：
获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5～2.5天，以完成外植体的预处理；
其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10～30g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；
(3)不定芽的诱导及增殖培养：
将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5～3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2～3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；
其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0～3.0mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3，培养基pH 5.8～6.0；
增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5～3.0mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L蔗糖+6～7g/L琼脂，培养基pH 5.8～6.0；
所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41～42mg/L，KH2PO4使用浓度为21～21.5mg/L，其余成分含量不变；
所述NN69培养基配方为：每升培养基中含720mg/L NH4NO3，950mg/L KNO3，185mg/LMgSO4·7H2O，166mg/L CaCl2·2H2O，68mg/L KH2PO4，37.3mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，3.0mg/L H3BO3，25mg/L MnSO4·4H2O，10mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.08mg/L CuSO4·5H2O，100mg/L肌醇，2.0mg/L甘氨酸，5.0mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇B6，0.5mg/L盐酸硫胺素B1。
2.根据权利要求1所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为950mg/L，NH4NO3使用浓度为825mg/L，其余成分含量不变，另附加6g/L琼脂，pH 7.0。
3.根据权利要求1所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，不定芽诱导培养基具体为：NN69培养基+2.5mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.75ml/L AgNO3，培养基pH 5.9。
4.根据权利要求1所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，增殖培养基具体为：改良MS2培养基+2.25mg/L 6-BA+0.35mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，培养基pH 5.9。
5.根据权利要求1所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41.59mg/L，KH2PO4使用浓度为21.25mg/L，其余成分含量不变。
6.根据权利要求1-5任一所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，还包括砀山酥梨叶片不定芽的组织学观察以及运用梨SCoT分子标记体系检测遗传稳定性的步骤。
7.根据权利要求6所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述砀山酥梨叶片不定芽再生的组织学观察，指采用石蜡切片法制片，HE苏木精尹红染色，中性树脂封片，最后置于显微镜下观察。
8.根据权利要求6所述的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，所述运用梨SCoT分子标记体系检测遗传稳定性，指提取母株和子代植株的DNA，运用SCoT分子标记体系技术检测其DNA多态性，分析两者之间DNA水平的变异。
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