CN108522281B - 一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法 - Google Patents

一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法。本发明提供了一种获得梁山慈竹的突变体植株的方法，包括如下步骤：利用甲基磺酸乙酯对来源于梁山慈竹的愈伤组织进行诱变。所述获得梁山慈竹的突变体植株的方法还包括如下步骤：将诱变后的愈伤组织培养为再生植株。所述获得梁山慈竹的突变体植株的方法还包括如下步骤：从再生植株中筛选突变体植株。本发明所提供方法中将诱变技术与离体培养相结合，利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的愈伤组织，可以获得数量大而且同质的诱变群体。本发明极大程度提高了突变频率和育种效率，有利于提高梁山慈竹诱变育种，将推动梁山慈竹的产业化发展，具有重大的应用推广价值。

Description

一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法
技术领域
本发明属于植物诱变育种领域，具体涉及一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法。
背景技术
制浆造纸工业当前存在废纸回收利用率比较低的问题。竹作为一种广泛的植物自然资源，具有分布广、适应性强、生长快、成才早、经济价值高等特点，一次造林成功后，经过3-5年就可以年年砍伐，且持续几十年以致上百年。竹材的纤维素含量在40％-60％，其优良的制浆性能可与部分木材纤维比美，并且竹浆的纤维形态质量介于草浆和木浆之间，更接近于木浆，这些都促使其成为一种优良的非木材类造纸原材料。因此，培育生物量大、纤维素高的竹子品种对提高竹浆造纸的可持续发展有重要意义。然而，由于竹类植物开花具有不确定性，且开花后即死亡等特点，很难通过传统的育种方法对其进行品种改良。此外，竹类遗传转化体系尚不成熟，很难通过基因工程的手段对其进行遗传改良。
化学诱变技术是利用化学诱变剂处理育种材料，以诱发遗传物质的突变，从而引起形态特征的变异，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最终育成新品种。迄今为止，在竹类植物上还未见诱变育种的研究报道。
梁山慈竹(Dendrocalamus farinosus)为牡竹属亚科植物，是一种地下茎合轴型丛生竹，主要生长于四川盆地、重庆、贵州以及云南部分地区，为中北亚热带竹种。梁山慈竹纤维素含量高、纤维长，是造纸的优良原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法。
本发明提供了一种获得梁山慈竹的突变体植株的方法，包括如下步骤：利用甲基磺酸乙酯对来源于梁山慈竹的愈伤组织进行诱变。
所述甲基磺酸乙酯的诱变浓度为：体积百分含量0.6％。
“利用甲基磺酸乙酯对来源于梁山慈竹的愈伤组织进行诱变”的方法具体为：将愈伤组织置于甲基磺酸乙酯溶液。愈伤组织置于甲基磺酸乙酯溶液的时间具体可为30min。愈伤组织置于甲基磺酸乙酯溶液的过程中，可采用震荡处理。甲基磺酸乙酯溶液具体可为甲基磺酸乙酯的体积百分含量为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液。甲基磺酸乙酯溶液的制备方法具体可为：将甲基磺酸乙酯用磷酸缓冲液稀释。所述磷酸缓冲液具体可为pH4.8、0.01M的磷酸缓冲液。
所述愈伤组织为竹节愈伤组织或种子胚诱导的愈伤组织。所述愈伤组织为原代愈伤组织或者继代愈伤组织(继代培养得到的愈伤组织)。
所述原代愈伤组织的制备方法包括如下步骤：采用愈伤组织诱导培养基培养外植体，得到原代愈伤组织；所述外植体为梁山慈竹侧枝的茎段，且茎段上至少具有一个节。所述侧枝为幼嫩侧枝。原代愈伤组织的制备方法中，所述培养分两个阶段：第一个阶段为暗培养，第二个阶段为每天光照16小时培养。所述培养分两个阶段：第一个阶段为暗培养2周，第二个阶段为每天光照16小时培养6-8周。所述培养的温度为25±2℃。
所述继代愈伤组织的制备方法包括如下步骤：将原代愈伤组织继代至愈伤组织诱导培养基进行培养，得到继代愈伤组织。继代愈伤组织的制备方法中，所述培养为每天光照16小时培养。继代愈伤组织的制备方法中，所述培养为每天光照16小时培养2周。所述培养的温度为25±2℃。
所述获得梁山慈竹的突变体植株的方法还包括如下步骤：将诱变后的愈伤组织培养为再生植株
“将诱变后的愈伤组织培养为再生植株”的方法依次包括如下步骤：
(1)取诱变后的愈伤组织，接种至丛生芽分化培养基培养至丛生芽长出；
(2)切取丛生芽，转移至生根培养基中，培养至根长为1-2cm。
所述步骤(1)中，培养条件可为：25±2℃，每天光照16h。
所述步骤(2)中，培养条件可为：25±2℃，每天光照16h。
“将诱变后的愈伤组织培养为再生植株”的方法还包括如下步骤：
(3)完成步骤(2)后，将幼苗移栽至装有培养基质的营养钵中，进行培养。
所述获得梁山慈竹的突变体植株的方法还包括如下步骤：从再生植株中筛选突变体植株。
从再生植株中筛选突变体植株的方法包括如下步骤：
①分别以待测再生植株和对照植株的基因组DNA为模板，分别采用引物ISSR-C、引物ISSR-D和引物ISSR-E进行PCR扩增，然后进行电泳；所述对照植株为将未进行甲基磺酸乙酯诱变的梁山慈竹的愈伤组织进行培养得到的再生植株；引物ISSR-C如序列表的序列1所示；引物ISSR-D如序列表的序列2所示；引物ISSR-E如序列表的序列3所示；
②如果满足标准甲、标准乙和标准丙中的至少一条，待测再生植株为突变体植株；
标准甲：采用引物ISSR-C，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致；
标准乙：采用引物ISSR-D，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致；
标准丙：采用引物ISSR-E，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致。
所述电泳具体可为1.5％琼脂糖凝胶电泳。
所述带型不一致为目测带型不一致。
所述带型不一致为主带型不一致。
本发明还保护一种制备梁山慈竹的竹节愈伤组织的方法，包括如下步骤：采用愈伤组织诱导培养基培养外植体，得到原代愈伤组织；所述外植体为梁山慈竹侧枝的茎段，且茎段上至少具有一个节。所述侧枝为幼嫩侧枝。所述培养分两个阶段：第一个阶段为暗培养，第二个阶段为每天光照16小时培养。所述培养分两个阶段：第一个阶段为暗培养2周，第二个阶段为每天光照16小时培养6-8周。所述培养的温度为25±2℃。“制备梁山慈竹的竹节愈伤组织的方法”还包括如下步骤：将原代愈伤组织继代至愈伤组织诱导培养基进行培养，得到继代愈伤组织。所述培养为每天光照16小时培养。继代愈伤组织的制备方法中，所述培养为每天光照16小时培养2周。所述培养的温度为25±2℃。
本发明还保护以上任一所述方法在梁山慈竹育种中的应用。
本发明还保护一种用于获得梁山慈竹的突变体植株的试剂盒，包括：愈伤组织诱导培养基、丛生芽分化培养基和生根培养基。
所述试剂盒还包括所述试剂盒还包括引物ISSR-C、引物ISSR-D和引物ISSR-E；引物ISSR-C如序列表的序列1所示；引物ISSR-D如序列表的序列2所示；引物ISSR-E如序列表的序列3所示。
所述试剂盒还包括甲基磺酸乙酯的体积百分含量为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液。甲基磺酸乙酯溶液的制备方法具体可为：将甲基磺酸乙酯用磷酸缓冲液稀释。所述磷酸缓冲液具体可为pH4.8、0.01M的磷酸缓冲液。
以上任一所述愈伤组织诱导培养基为含有如下物质的培养基：2,4-D、KT、IBA、蔗糖。
以上任一所述愈伤组织诱导培养基为含有如下物质的培养基：2,4-D 2mg/L、KT0.2mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L。
以上任一所述愈伤组织诱导培养基为含有如下物质的培养基：2,4-D 2mg/L、KT0.2mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、MS大量元素、MS微量元素、MS有机元素、MS铁盐。
以上任一所述愈伤组织诱导培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O 0.0373g/L，2,4-D 2mg/L、KT 0.2mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水。
以上任一所述愈伤组织诱导培养基的pH为5.8。
以上任一所述丛生芽分化培养基为含有如下物质的培养基：KT、IAA、蔗糖。
以上任一所述丛生芽分化培养基为含有如下物质的培养基：KT 2.5mg/L、IAA0.5mg/L、蔗糖30g/L。
以上任一所述丛生芽分化培养基为含有如下物质的培养基：KT 2.5mg/L、IAA0.5mg/L、蔗糖30g/L、MS大量元素、MS微量元素、MS有机元素、MS铁盐。
以上任一所述丛生芽分化培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na ·2H2O0.0373g/L，KT 2.5mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水。
以上任一所述丛生芽分化培养基的pH为5.8。
以上任一所述生根培养基为含有如下物质的培养基：NAA、IBA、蔗糖。
以上任一所述生根培养基为含有如下物质的培养基：NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L。
以上任一所述生根培养基为含有如下物质的培养基：NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、MS大量元素、MS微量元素、MS有机元素、MS铁盐。
以上任一所述生根培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，余量为水。
以上任一所述生根培养基的pH为5.6-5.8。
所述突变体植株为与出发植株相比，基因组DNA中发生突变的植株和/或表型发生变化的植株。
所述突变体植株为与梁山慈竹野生株相比，基因组DNA中发生突变的植株和/或表型发生变化的植株。
所述突变体植株为与对照植株(将未进行甲基磺酸乙酯诱变的梁山慈竹的愈伤组织进行培养得到的再生植株)相比，基因组DNA中发生突变的植株和/或表型发生变化的植株。
结果表明，通过EMS离体诱变梁山慈竹愈伤组织获得突变体的方法是诱导获得长纤维、高含量、低木素的梁山慈竹育种材料的有效手段。
本发明所提供方法中将诱变技术与离体培养相结合，利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的愈伤组织，诱变剂容易吸收，可以获得数量大而且同质(或基本一致)的诱变群体，大幅降低了常规诱变技术中产生嵌合体的比例。进一步的，本发明所提供的方法中，结合ISSR分子标记技术，筛选到了3条ISSR引物，可以对诱变后得到的再生植株进行有效筛选，获得发生遗传变异的突变体，提高了选择效率。本发明极大程度提高了突变频率和育种效率，有利于提高梁山慈竹诱变育种，将推动梁山慈竹的产业化发展，具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例1中完成步骤2的照片。
图2为实施例2的步骤6中培养2周后愈伤组织的照片。
图3为实施例2的步骤6中培养4周后愈伤组织的照片。
图4为实施例2的步骤6中培养6周后愈伤组织的照片。
图5为实施例2的步骤7中培养4周后幼苗的照片。
图6为实施例3中分别采用ISSR-C、ISSR-D和ISSR-E进行扩增，某一突变株和对照株(CK)的示例性电泳图。
图7为实施例3中采用ISSR-G进行扩增，若干突变株和对照株的示例性电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
梁山慈竹带芽的侧枝采集于西南科技大学实验基地(四川绵阳)，获取时间为2011年04月。直接来源的提供者为龙治坚；联系方式：四川绵阳西南科技大学生命学院；E-Mail：longzhijian@swust.edu.cn；邮编：621000。
2,4-D全称为2,4-二氯苯氧乙酸。KT，又称激动素，全称为6-糠基氨基嘌呤。IBA，全称为3-吲哚丁酸。NAA的全称为α-萘乙酸。IAA的全称为吲哚-3-乙酸。EMS的全称为甲基磺酸乙酯。
愈伤组织诱导培养基(又称MS2培养基)：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，2,4-D 2mg/L、KT 0.2mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；pH5.8。
丛生芽分化培养基(又称MS4培养基)：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，KT 2.5mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；pH5.8。
生根培养基(又称MS5培养基)：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，余量为水；pH5.6-5.8。
实施例1、制备竹节愈伤组织
一、制备外植体
1、取梁山慈竹的幼嫩侧枝，去除叶鞘，然后依次进行如下消毒步骤：用70％乙醇水溶液清洗，然后用流水冲洗，然后用70％乙醇水溶液浸泡30sec，然后用无菌水充分清洗，然后用0.1％HgCl2水溶液消毒10min，然后用无菌水充分冲洗。
2、完成步骤1后，取侧枝，切割为长度1±0.2cm的茎段(每个茎段上至少具有一个节)。
二、制备愈伤组织(整个过程培养温度均为25±2℃)
1、取步骤一得到的茎段，接种至愈伤组织诱导培养基上，先培养2周(暗培养)，然后再培养6-8周(每天光照16h)，获得愈伤组织。
2、将愈伤组织进行继代培养。
继代培养采用的培养基：新鲜的愈伤组织诱导培养基。
培养条件：每天光照16h。
培养时间：2周。
完成步骤2的照片见图1。获得了质地均一的愈伤组织。
实施例2、利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹
1、制备pH4.8、0.01M的磷酸缓冲液，高压灭菌后冷却至室温。
2、取甲基磺酸乙酯，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
3、取步骤2得到的甲基磺酸乙酯，用步骤1得到的磷酸缓冲液稀释，得到甲基磺酸乙酯溶液。
甲基磺酸乙酯溶液中，甲基磺酸乙酯的体积百分含量分别为0.6％、0.8％或1.0％。
4、取实施例1得到的愈伤组织(数量为n1)，置于甲基磺酸乙酯溶液中，震荡处理30min。
5、完成步骤4后，取愈伤组织，用无菌水充分冲洗。
6、完成步骤5后，取愈伤组织，接种至丛生芽分化培养基中，培养至丛生芽长出(通常为6-8周)。
培养条件：25±2℃，每天光照16h。
完成培养后，统计存活的愈伤组织的数量，为n2。
培养2周后愈伤组织的照片见图2。能够存活的愈伤组织即为抗EMS的愈伤组织。
培养4周后愈伤组织的照片见图3。可以观察到到有绿色的芽点产生。
培养6周后幼苗的照片见图4。
7、完成步骤6后，从愈伤组织切取丛生芽，转移至生根培养基中，培养至根长为1-2cm(通常为4周左右)。
培养条件：25±2℃，每天光照16h。
培养4周后幼苗的照片见图5。
8、完成步骤7后，取根系状态良好的幼苗，移栽至装有培养基质的营养钵中，进行培养。
培养基质：2体积份腐叶土、1体积份石英砂和1体积份土壤混匀。
培养条件：14小时光照(25℃)/8小时黑暗(18℃)。
完成培养后，统计得到的再生植株的数量，为n3。
统计愈伤组织存活率(n2÷n1×100％)和再生植株获得率(n3÷n1×100％),结果见表1。n1＝300。
表1
Figure BDA0001625390490000071
Figure BDA0001625390490000081
9、取实施例1得到的愈伤组织，依次按照上述步骤6、步骤7和步骤8，得到再生植株，将其命名为对照株。
实施例3、利用ISSR分子标记技术分析诱变后代
从实施例2中采用0.6％甲基磺酸乙酯溶液进行诱变后得到的96株再生植株中随机取47株，即为候选突变株。
各个候选突变株和对照株分别进行ISSR分子标记技术分析。
1、取叶片，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用ISSR引物进行ISSR-PCR扩增。
分别采用表2中的14条ISSR引物。表2中，Y代表C或T，R代表A或G，B代表C或G或T，D代表A或G或T，S代表G或C。
表2
引物名称 引物序列(5’-3’)
ISSR-A AGAGAGAGAGAGAGAGYA
ISSR-B GAGAGAGAGAGAGAGAYC
ISSR-C(序列表的序列1) CTCTCTCTCTCTCTCTRC
ISSR-D(序列表的序列2) AGAGAGAGAGAGAGAGYC
ISSR-E(序列表的序列3) GAGAGAGAGAGAGAGAYT
ISSR-F GAGAGAGAGAGAGAGAC
ISSR-G ACACACACACACACACC
ISSR-H TGTGTGTGTGTGTGTGA
ISSR-I BDBCACACACACACACA
ISSR-J AGAGAGAGAGAGAGAGT
ISSR-K GCACACACAC
ISSR-L CSCGAGAGAGAGAGA
ISSR-M CCCGTGTGTGTGTGT
ISSR-N GCGACACACACACACA
反应体系(20μL)：2μL 10×PCR Buffer I、2μL dNTP混合溶液(2.5mM each)、0.5μL基因组DNA、0.6μL引物溶液(10μM)、0.15μL rTaq DNA聚合酶溶液(5U/μL)，余量为ddH2O。10×PCR Buffer I：Takala公司。
反应条件：94℃5min；94℃30s、50℃45s、72℃90min，36个循环；72℃7min；4℃保存。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
采用相同引物时，与对照植株电泳显示的带型不一致的候选突变株，为突变株。从14条ISSR引物中筛选可以高效筛选突变株的引物。并且，筛选得到的引物需要满足如下性能：对每个样本进行多次重复试验，每次电泳条带的均带型清晰，多次重复试验的带型显示均一致。47株候选突变株中，引物ISSR-C筛选到了15株突变株，引物ISSR-D筛选到了13株突变株，引物ISSR-E筛选到了14株突变株。其他引物筛选到的突变株均为3株以下(例如引物ISSR-G仅筛选到了1株突变株)，筛选效率很低。
采用引物ISSR-C、引物ISSR-D或引物ISSR-E，某一突变株(XK15)和对照株(CK)的示例性电泳图见图6。图6中，M代表DL 2000DNA marker，C代表采用引物ISSR-C的扩增产物，D代表采用引物ISSR-D的扩增产物，E代表采用引物ISSR-E的扩增产物。图6中，细箭头表示与对照株相比突变株有新条带出现，粗箭头表示与对照株相比条带缺失。
采用引物ISSR-G，若干突变株(XK7、XK10、XK12、XK14)和对照株(CK)的示例性电泳图见图7。只有XK10显示为突变株。
综合引物ISSR-C、引物ISSR-D或引物ISSR-E的结果，将每条引物筛选到的突变株合并，共筛选得到22株突变株，再生植株中突变株的获得率为46.8％。
实施例4、EMS离体诱变获得的梁山慈竹突变体分析
从实施例3中筛选到的22株突变株中随机取11株(Xk12、Xk10、Xk1、Xk13、Xk2、Xk14、Xk15、Xk16、Xk7、Xk17、Xk8)。
分别对11株突变株和对照株(CK)进行性状鉴定。将植株移栽于田间，11株突变株和对照株同期出笋，从出笋开始计天数，后30天后，取茎秆中部，作为待测材料。
一、植株的纤维素和木质素含量的检测
1、取待测材料，105℃杀青30min，然后60℃烘干至恒重(干重)，然后研磨并过60目筛，收集粉末。
2、取步骤1得到的粉末，利用FOSS公司FibertecTM M61020/1021型纤维素测定仪，通过酸性洗涤木素(ADL)和酸性洗涤纤维(ADF)法，进行纤维素和木质素含量的测定。每个样品生物重复、技术重复各3次。
纤维素含量指的是纤维素占干重的质量百分含量。木质素含量指的是木质素占干重的质量百分含量。
结果见表3。对照株的纤维素含量为53.8％。4株突变株(突变株Xk1、突变株Xk12、突变株Xk15和突变株Xk16)的纤维素含量低于对照株，但未达到差异显著水平。突变株Xk2、突变株Xk14、突变株Xk7和突变株Xk17的纤维素含量均明显高于对照株，且差异达到了显著或极显著水平。对照株的木质素含量为6.43％。突变株Xk1、突变株Xk10、突变株Xk2和突变株Xk8的木质素含量显著或极显著的高于对照株。突变株Xk14和突变株Xk15的木质素含量显著或极显著的低于对照株。
表3
纤维素含量(％) 木质素含量(％)
CK 53.8±3.7 6.43±0.33
Xk12 50.6±2.55 6.46±0.47
Xk10 56.4±3.40 8.09±0.72<sup>*</sup>
Xk1 48.7±3.32 10.82±0.54<sup>**</sup>
Xk13 54.5±2.85 6.58±0.31
Xk2 59.7±1.20<sup>*</sup> 9.97±0.27<sup>**</sup>
Xk14 63.4±1.58<sup>**</sup> 4.78±0.57<sup>*</sup>
Xk15 51.3±3.22 3.96±0.46<sup>**</sup>
Xk16 52.1±2.97 7.50±0.59
Xk7 62.5±1.35<sup>**</sup> 6.55±0.29
Xk17 65.1±2.05<sup>**</sup> 7.34±0.47
Xk8 55.1±3.85 8.16±0.71<sup>*</sup>
*表示与CK的差异达到显著性水平(P<0.05)；**表示与CK的差异达到极显著性水平(P<0.01)。
二、植株纤维形态分析
采用LDA02型纤维质量分析仪(FQA)对纤维形态的以下指标进行分析：纤维长度、纤维宽度、纤维长宽比(纤维长宽比＝平均长度/平均宽度)。
取待测材料，长约2cm，将其削成火柴棍状，然后置于1.5mL离心管内，倒入Tefferg氏离析液(10％硝酸水溶液和10％铬酸水溶液等体积混合)浸没，离析时间为36～72h，之后将离析液倒出并将样品洗涤至中性，然后利用Fiber Quality Analyzer(LDA02)检测纤维的长度和宽度，每个试样测试5000根纤维。
结果见表4。对照株的平均纤维长度为0.651mm，平均宽度为0.016mm，平，纤维长宽比为40.6。6株突变株(突变株Xk7、突变株Xk8、突变株Xk12、突变株Xk10、突变株Xk14和突变株Xk15)的平均纤维长度显著高于对照株，其中突变株Xk7、突变株Xk8和突变株Xk14的纤维长度均在800μm以上。3株突变株(突变株Xk2、突变株Xk13和突变株Xk17)的平均纤维长度显著低于对照株。突变株Xk17的纤维长宽比显著低于对照株，其他突变株的纤维长宽比均高于突变株(其中8株突变株的纤维长宽比显著高于对照株)，突变株Xk7、突变株Xk8和突变株Xk15的纤维长宽比达到57-63。
表4
Figure BDA0001625390490000101
Figure BDA0001625390490000111
*表示与CK的差异达到显著性水平(P<0.05)；**表示与CK的差异达到极显著性水平(P<0.01)。
综合步骤一和步骤二的结果，突变体Xk7、突变体Xk8和突变体Xk15，具有高纤维含量且具有较长纤维，是培育优良纸浆用竹的很好的育种材料。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南科技大学
<120> 一种利用甲基磺酸乙酯离体诱变梁山慈竹的育种方法
<130> GNCYX180858
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> r =a or g
<400> 1
ctctctctct ctctctrc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> y =c or t
<400> 2
agagagagag agagagyc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> y =c or t
<400> 3
gagagagaga gagagayt 18

Claims (5)

1.一种获得梁山慈竹的突变体植株的方法，包括如下步骤：利用甲基磺酸乙酯对来源于梁山慈竹的愈伤组织进行诱变，将诱变后的愈伤组织培养为再生植株；
“利用甲基磺酸乙酯对来源于梁山慈竹的愈伤组织进行诱变”的方法为：将竹节愈伤组织置于甲基磺酸乙酯溶液30min；甲基磺酸乙酯溶液为甲基磺酸乙酯的体积百分含量为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液；
“将诱变后的愈伤组织培养为再生植株”的方法依次包括如下步骤：
(1)取诱变后的愈伤组织，接种至丛生芽分化培养基培养至丛生芽长出；
(2)切取丛生芽，转移至生根培养基中，培养至根长为1-2cm；
所述丛生芽分化培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，KT 2.5mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；所述丛生芽分化培养基的pH为5.8；
所述生根培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO30.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，余量为水；所述生根培养基的pH为5.6-5.8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：从再生植株中筛选突变体植株；
从再生植株中筛选突变体植株的方法包括如下步骤：
①分别以待测再生植株和对照植株的基因组DNA为模板，分别采用引物ISSR-C、引物ISSR-D和引物ISSR-E进行PCR扩增，然后进行电泳；所述对照植株为将未进行甲基磺酸乙酯诱变的梁山慈竹的愈伤组织进行培养得到的再生植株；引物ISSR-C如序列表的序列1所示；引物ISSR-D如序列表的序列2所示；引物ISSR-E如序列表的序列3所示；
②如果满足标准甲、标准乙和标准丙中的至少一条，待测再生植株为突变体植株；
标准甲：采用引物ISSR-C，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致；
标准乙：采用引物ISSR-D，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致；
标准丙：采用引物ISSR-E，待测再生植株和对照植株电泳显示的带型不一致。
3.权利要求1或2所述方法在梁山慈竹育种中的应用。
4.一种用于获得梁山慈竹的突变体植株的培养基，包括：愈伤组织诱导培养基、丛生芽分化培养基和生根培养基；
所述愈伤组织诱导培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，2,4-D 2mg/L、KT 0.2mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；所述愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；
所述丛生芽分化培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO3 0.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，KT 2.5mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；所述丛生芽分化培养基的pH为5.8；
所述生根培养基的组成为：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、CaCl2 0.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO30.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H20 0.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，余量为水；所述生根培养基的pH为5.6-5.8。
5.权利要求4所述培养基在梁山慈竹育种中的应用。
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