CN102696478A

CN102696478A - 毛竹理化复合诱变育种方法

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Publication number: CN102696478A
Application number: CN2012102154626A
Authority: CN
Inventors: 桂仁意; 刘亚迪; 方伟; 汤定钦
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-06-19
Also published as: CN102696478B

Abstract

一种毛竹理化复合诱变育种方法，按如下五个步骤进行：—是毛竹种子的采集，种子净度≥90％，千粒重≥28g，含水率10％-14％，密封后4℃中保存备用。二是辐照射线选定为原子量137的铯γ射线作照射源，与两种诱变剂处理液。三是两种诱变剂处理液的配制。四是理化复合诱变处理，辐射剂量率1Gy/min，辐射剂量为30Gy，再用温水浸种十几小时吸水纸吸干表面水后，用浓度为0.04mmol/L的叠氮化钠(NaN₃)溶液或甲基磺酸乙酯(EMS)溶液进行浸种诱变处理8h后取出用清水反复冲洗2h即成复合诱变处理的毛竹种子，再用该种子进行发芽试验，验证诱变效果和确定诱变剂量。本方法诱变的突变体多、性状变异多样，育种所需的优良性状选择余地大。

Description

毛竹理化复合诱变育种方法

技术领域

本发明涉及一种植物种子的物理与化学复合诱变育种方法，具体是对毛竹种子进行铯的γ射线辐照与叠氮化钠(NaN₃)或甲基磺酸乙酯(EMS)诱变剂处理液浸渍的复合诱变育种方法。

背景技术

毛竹(Phyllostachys heterocycla cv.Pubescens)是一种生长极快、成材早、产量高、收益期长的优良竹种。毛竹很少开花结籽，一旦开花随即走向衰败，因而无法进行杂交育种，毛竹的遗传改良工作相对冷落。《安徽农业科学》37卷17期刊登了蔡新玲等学者的“毛竹辐射诱变育种苗的研究初报”一文，介绍了用⁶⁰Co-γ为辐射源，剂量率为1.86Gy/min、最佳辐照剂量为25Gy，对毛竹种子进行辐射诱变处理的情况，用单一的γ辐照这一物理方法对毛竹种子进行诱变处理，比自然变异扩大了变异谱，增加了突变体数量，作出了有益的贡献。物理诱变与化学诱变的机理不同，诱导的突变类型不尽相同，将两种诱变方式结合即复合诱变对毛竹种子进行处理，以期获得更广的变异谱、更多的突变体量，有其一定的现实意义和科研价值，经检索，尚未见有一套完整的方法公诸于世。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种毛竹理化复合诱变育种方法。

解决上述技术问题采用如下技术方案：

本毛竹理化复合诱变育种方法，是按如下步骤进行：

(1)毛竹种子的采集：每年9月择地采集，要求种子净度≥90％，千粒重≥28g，含水率10％-14％，在密封袋中存放，4℃环境中保存备用。

(2)辐照射线与化学诱变剂的选定：采用¹³⁷Cs-γ射线辐照与叠氮化钠即NaN₃诱变剂处理液浸泡的复合诱变，或用¹³⁷Cs-γ射线辐照与甲基磺酸乙酯即EMS诱变剂处理液浸泡的复合诱变。

(3)诱变剂处理液的配制：①NaN₃诱变剂处理液的配制：用4.11ml、浓度为0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液与15.89ml、浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液混匀，分别加入0、6.5、13、26、52、65和130mg的NaN₃，用蒸馏水定容至1升，即成浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0和2.0mmol/L，pH为3.0的NaN₃诱变剂处理液；②EMS诱变剂处理液的配制：用3.05ml、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.65ml、浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混匀，分别加入0、1、2、4、8、1和2ml的EMS，用蒸馏水定容至1升，即成体积比浓度为0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1％和2％，pH为3.0的EMS诱变剂处理液。

(4)理化复合诱变处理：先对毛竹种子用¹³⁷Cs-γ射线辐照处理，将毛竹种子剥去颖包后装入塑料封口袋内进行辐照处理，辐射剂量率为lGy/min，辐射剂量为30Gy，再用38-42℃温水浸种12-16h，用吸水纸吸干种子表面的水分后分别用浓度为0.04mmol/L、pH为3.0的NaN₃溶液或体积比浓度为0.05％、pH为7.0的EMS溶液进行浸种诱变处理8h，边浸种边搅拌，然后取出种子，用清水反复冲洗2h，即成为经理化复合诱变处理后的毛竹种子。

(5)种子的发芽试验、幼苗早期及幼苗成株后的各相关形态参数的测定。

本发明的有益效果是对难以进行杂交改良的毛竹提供一种复合诱变育种的新方法，在短时期内获得突变率高、性状变异多样、优良性状选择余地大的突变体，推进毛竹新品种改良的进程。

具体实施方式

本发明下面结合实施例予以详述：

本毛竹理化复合诱变育种方法，是按如下步骤进行：

(1)毛竹种子的采集：每年9月择地采集，要求种子净度≥90％，千粒重≥28g，含水率10％-14％，在密封袋中存放，4℃环境中保存备用；

(2)辐照射线与化学诱变剂的选定：采用¹³⁷Cs-γ射线辐照与NaN₃诱变剂处理液浸泡的复合诱变，或用¹³⁷Cs-γ射线辐照与EMS诱变剂处理液浸泡的复合诱变；

(4)理化复合诱变处理：先对毛竹种子用¹³⁷Cs-γ射线辐照处理，将毛竹种子剥去颖包后装入塑料封口袋内进行辐照处理，辐射剂量率为1Gy/min，辐射剂量为30Gy，再用38-42℃温水浸种12-16h，用吸水纸吸干种子表面的水分后分别用浓度为0.04mmol/L、pH为3.0的NaN₃溶液或体积比浓度为0.05％的EMS溶液进行浸种诱变处理8h，边浸种边搅拌，然后取出种子，用清水反复冲洗2h，即成为经理化复合诱变处理后的毛竹种子；

下面将与本发明有关的试验与测定情况介绍如下：

一、预处理设计

1、¹³⁷Cs-γ射线预处理

将种子剥去外面颖苞后装入塑料封口袋内在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所辐照中心进行¹³⁷Cs-γ射线辐照处理，辐射剂量率为1Gy/min。辐射剂量分别为：0、50、100、150、200、250、350和450Gy，每个处理3个重复，每个重复种子数量为100粒。

2、NaN₃预处理

将种子剥去外面颖苞后，先用温水(40℃左右)浸种12-16h，用吸水纸吸干表面水分后，分别用0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0mmol/L的NaN₃诱变剂处理液进行浸种诱变处理8h，处理期间不断搅动处理液，使浓度均匀。经不同浓度NaN3处理后的种子分别再用清水反复冲洗2h。每个处理3个重复，每个重复100粒种子，保持1粒种子至少1mL的处理液。

3、EMS预处理

将种子剥去外面颖苞后，先用40℃左右温水浸种12-16h，用吸水纸吸干表面水分后，分别用0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1％、2％(V/V)的EMS诱变剂处理液进行浸种诱变处理8h，处理期间不断搅动处理液，使浓度均匀。经不同浓度EMS处理后的种子分别再用清水反复冲洗2h。每种处理3个重复，每个重复100粒种子，保持1粒种子至少1mL的处理液。

对各个诱变处理后的种子进行发芽试验，根据种子发芽率的情况，进一步选出进行复合诱变效应研究的处理剂量。

二、种子萌发期指标参数的测定

1、发芽试验

将上述复合诱变处理的种子置于铺有润湿的2层滤纸或纱布的发芽盒(13×19×10cm)中进行发芽试验，每种处理设3次重复，每个重复100粒种子，于温度设为25±2℃的人工气候箱(宁波莱福科技有限公司)中萌发，种子萌发后，以胚根长不短于种子长度，胚芽长不短于种子长度的一半时记为发芽，每天记载发芽种子数，并计算发芽终期的发芽率：

发芽率(％)＝(全部正常发芽数/供试种子数)×100％。

2、幼苗苗高增长量、分蘖数、展叶数的测定

在室内人工培养箱的发芽盒中培养30d后的幼苗，其中γ射线选择经0、30、60、90、120、150Gy6个剂量辐照(180Gy辐照种子后没有一粒长成完整植株)后的幼苗，其他诱变处理浓度参照发芽试验，将幼苗以盆栽的形式移至浙江林学院智能温室中。塑料盆的规格为上口径10cm，下口径7cm，高8cm，盆栽所用基质为以体积1∶1∶1的比例混合的蛭石、泥炭、珍珠岩混合物。幼苗培育期间水分供给—致，进行正常的栽培管理。移载后每隔8d测量一次苗高和展叶数，此时苗高以盆内基质水平面至第一片完全展开叶的长度为准；自第一株幼苗分蘖开始，每隔8d测定其分蘖数。每个处理选择10株长势—致的幼苗进行测定。

3、畸变率和畸变类型调查

经复合诱变处理后的毛竹种子，在室内人工培养箱中进行培养，30d后对幼苗的形态指标进行观察，调查统计发生矮小型、条纹或斑点叶、畸形叶等畸变类型的株数进行畸变率的计算；仔细观察各畸变类型随着幼苗的生长特别是成株后的变化。

三、幼苗成株后指标参数的测定

由于高剂量或高浓度的诱变剂处理后的种子无法长成一个完整的植株或完整植株的数量太少不能满足试验条件，所以在进行光色素含量和叶绿素荧光参数等指标测定时，对处理剂量或浓度进行了筛选，¹³⁷Cs-γ射线辐照的剂量为0、30、60、90、120Gy；NaN₃处理浓度为0、0.04、0.08、0.16mmol/L；EMS处理浓度为0、0.1％、0.2％、0.4％；复合诱变处理浓度分别为30Gy+0.04mmol/L、30Gy+0.08mmol/L、30Gy+0.1mmol/L和30Gy+0.05％、30Gy+0.1％、30Gy+0.2％、30Gy+0.4％。

1、光合色素含量的测定

分别于2008年8月6日选取经¹³⁷Cs-γ射线、化学诱变剂NaN₃和EMS处理后一年生实生苗，于2008年10月8日选取经复合诱变处理后4个月大的实生苗进行测定。每个剂量或浓度处理任选5盆植株，每盆摘取顶部新长出的完全展开叶1-2片，将其剪成1-2mm的细丝或小块，混匀后，采用丙酮：乙醇：水＝4.5∶4.5∶1(V/V)混合液浸提法至叶片无色时测定，每个处理剂量3次重复。采用UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)检测波长在663、645nm等处的吸光度值，按Lichtenthaler和Wellburn对Arnon法的修正公式，计算叶片光合色素的含量。

经不同诱变处理方式处理后的毛竹种子，在室内人工培养箱进行培养，一个月后对其形态指标进行观察，发现一些特殊性状，表现在植株矮小、叶片畸形，包括叶片卷曲，叶片皱缩，叶分叉等、叶有斑点或条纹等等。其统计结果见下表。

不同诱变处理对幼苗畸变率的影响

经¹³⁷Cs-γ射线辐照后，矮小型在30Gy、40Gy剂量时，条纹或斑点叶在20Gy、30Gy、40Gy时，畸形叶在20Gy、30Gy、90Gy时产生的几率高。矮小型、畸形叶类型在0Gy对照处理时也存在，这有可能是种子自身内部发生变异的原因。而在120Gy处理时，各畸变类型发生畸变的频率最高，因为高剂量使大量种子发生生理伤害，成活率降低，存活下来的种子受伤害的程度也加大，因此发生植株矮小、畸形叶的可能性加大，由此导致畸变率显著升高，但此时大多产生不利突变。从总畸变率来看，在20Gy、30Gy、40Gy剂量时的畸变率较高，而120Gy时的畸变率也较高，但这极有可能是高剂量产生的损伤效应所致。

经不同浓度的NaN₃处理后，各畸变类型发生的几率各不相同，其中矮小型在0.04mmol/L时，畸形叶在0.08mmol/L时产生的几率最高，没有出现条纹或斑点叶。从总畸变率来看，在0.04mmol/L时产生的畸变率最高，其他各处理浓度对畸变率影响并不大；经不同浓度的EMS处理后，条纹或斑点叶发生的几率最小，仅在0.05％的浓度时有0.88％的畸变率，矮小型、畸形叶也在0.05％的浓度时产生的几率最高，在高于0.2％的浓度时几乎不产生畸变。

经¹³⁷Cs-γ射线和NaN₃复合处理后，种子受伤害的程度加大，与单一诱变剂相比，各畸变类型的畸变率增大。各处理浓度下，在30Gy+0.04mmol/L时的畸变率最大，而畸形叶仅在该处理浓度下出现。

经γ射线和EMS复合处理后，种子受伤害的程度同样加大，与单—诱变剂相比，出现条纹或斑点叶畸变类型的几率增大。各处理浓度下，在30Gy+0.05％时产生畸变的几率最大。

2、植株畸变类型观察

随着幼苗的生长，有些在早期形态特征上产生不利突变的幼苗单株会因养分不足、光合能力弱、根系不发达等各种原因生长不良而大量死亡，也有些畸变单株会存活下来逐渐长成正常的单株，同时还会在形态特征上产生一些新的变异类型，如植株单分蘖和嵌合体等。嵌合体为在同一植株中，在叶色、叶形或其他形态特征上存在正常和异常两种变异。经调查统计，产生的嵌合体主要表现为卷曲叶型、条纹叶型、白化型、皱缩叶型等。

Claims

1.一种毛竹理化复合诱变育种方法，其特征是按如下步骤进行：

(2)辐照射线与化学诱变剂的选定：采用¹³⁷Cs-γ射线辐照与NaN₃诱变剂处理液浸泡的复合诱变，或用¹³⁷Cs-γ射线辐照与EMS诱变剂处理液浸泡的复合诱变。

(3)诱变剂处理液的配制：①NaN₃诱变剂处理液的配制：用4.11ml、浓度为0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液与15.89ml、浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液混匀，分别加入0、6.5、13、26、52、65和130mg的NaN₃，用蒸馏水定容至1升，即成浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0和2.0mmol/L，pH为3.0的NaN₃诱变剂处理液；②EMS诱变剂处理液的配制：用3.05m1、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.65ml、浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混匀，分别加入0、1、2、4、8、1和2ml的EMS，用蒸馏水定容至1升，即成体积比浓度为0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1％和2％，pH为3.0的EMS诱变剂处理液。

(4)理化复合诱变处理：先对毛竹种子用¹³⁷Cs-γ射线辐照处理：将毛竹种子剥去颖包后装入塑料封口袋内进行辐照处理，辐射剂量率为1Gy/min，辐射剂量为30Gy，再用38-42℃温水浸种12-16h，用吸水纸吸干种子表面的水分后分别用浓度为0.04mmol/L的NaN₃诱变剂处理液或体积比为0.05％的EMS诱变剂处理液进行浸种诱变处理8h，边浸种边搅拌，然后取出种子，用清水反复冲洗2h，即成为经理化复合诱变处理后的毛竹种子。

(5)诱变处理后种子的发芽试验、幼苗早期及幼苗成株后的各相关形态参数的测定。