CN114885835A - 一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法 - Google Patents
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- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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Abstract
本发明公开了一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，包括以下步骤：S1：种子与基质准备；S2：药品配置；S3：种子处理与播种；S4：数据统计分析。本发明采用的甲基磺酸乙酯诱变剂不仅诱变效率高、成本低，而且使用后的溶液可通过5％硫代硫酸钠溶液终止其毒性，不会对环境造成污染。
Description
【技术领域】
本发明属于植物诱变技术领域，具体涉及一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法。
【背景技术】
桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hassk.)，别名岗念、菍果、豆稔、稔子树、乌肚等，属于桃金娘科(Myrtaceae)桃金娘属 (Rhodomyrtus)。灌木，高1-2米；叶对生，革质，叶片椭圆形或倒卵形，长3-8厘米，宽1-4厘米，上面初时有毛，以后变无毛，发亮；花常单生，紫红色，直径2-4厘米；花瓣5，倒卵，形，长1.3-2厘米；浆果卵状壶形，长1.5-2厘米，宽1-1.5厘米，熟时紫黑色；种子每室 2列。花期4-5月。产我国台湾、福建、广东、广西、云南、贵州及湖南最南部。生于丘陵坡地，为酸性土指示植物。分布于中南半岛、菲律宾、日本、印度、斯里兰卡、马来西亚及印度尼西亚等地。桃金娘是重要的药用和食用植物，根含酚类、鞣质等，有治慢性痢疾、风湿、肝炎及降血脂等功效，果实可以酿酒；此外，花量大，易栽培，耐贫瘠，是重要的园林绿化植物，常用于水土保持和山坡复绿。
国内桃金娘仅有一个种，很难通过杂交获得桃金娘新种质，因此急需通过其他方式丰富桃金娘种质资源，纵观国内外参考文献，关于桃金娘的研究多集中在药理药性和繁殖方面，还未见有关桃金娘诱变育种方面的研究报道。因此，本发明采用不同浓度的甲基磺酸乙酯 (0ml/L、1ml/L、3ml/L、5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、 18ml/L和30ml/L)和不同浸泡时间(6h、12h、24h、48h、72h和96h) 桃金娘种子进行诱变处理，探索不同浓度甲基磺酸乙酯和不同浸泡时间对桃金娘种子的诱变效应，为桃金娘育种研究提供新的方法和理论。
【发明内容】
本发明提供一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，以解决如何利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘的诱变效应影响的实际技术问题。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，包括以下步骤：
S1：种子与基质准备；
S2：药品配置；
S3：种子处理与播种；
S4：数据统计分析。
进一步地，步骤S1中种子与基质准备的方法，包括以下步骤：
将采收的种子用手将果肉碾碎，然后用沙与果肉反复摩擦，直到果肉与种子完全分离，最后用清水反复冲洗种子，直到种子清洗干净为止，常温条件下，用浓度为5000mg/L的KNO3溶液在遮光的条件下浸泡种子12h；
使用长宽高为60cm×30cm×10cm的无孔穴盘将河沙分装，基质分装厚为5cm，预留2cm，用500倍的多菌灵水溶液消毒。
进一步地，步骤S2中药品配置包括0.1mol/L磷酸缓冲液 (pH＝7.0)配制、甲基磺酸乙酯溶液配制、5％硫代硫酸钠溶液配制。
进一步地，所述0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)配制方法，包括以下步骤：
加入35.814g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为0.1mol/L的Na2HPO4；往烧杯中加入15.601g 的NaH2PO4·2H2O，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为 0.1mol/L的NaH2PO4溶液；取390mLNaH2PO4溶液于1L锥形瓶中，加入610mLNa2HPO4溶液，配成1L的磷酸缓冲液。
进一步地，所述甲基磺酸乙酯溶液配制是用配置好的磷酸缓冲液将甲基磺酸乙酯原液稀释成不同浓度的甲基磺酸乙酯溶液。
进一步地，所述5％硫代硫酸钠溶液配制方法，包括以下步骤：向50g硫代硫酸钠加入950g水中溶解。
进一步地，步骤S3中种子处理与播种包括内容：
将种子放入配制好的甲基磺酸乙酯溶液中浸泡，用带有盖子的 15mL试管盛放甲基磺酸乙酯和种子；
用不同浓度甲基磺酸乙酯处理种子，设置10个浓度梯度：0ml/L、 1ml/L、3ml/L、5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、18ml/L、30ml/L，设6个处理时间：6h、12h、24h、48h、72h和96h，每个处理200粒种子，设置3个重复；
共需种子数量：60处理×200粒/处理×3重复＝36000粒；
根据每个处理时间，在摇床上设置相应的振荡时间，摇床温度设置为26℃，转速为230转/秒；
将浸泡后每个处理的种子放入30mL 5％硫代硫酸钠溶液中半小时终止甲基磺酸乙酯诱变，后用水冲洗3小时，即可播种；
使用后的甲基磺酸乙酯溶液加入2L 5％硫代硫酸钠溶液半小时，可以终止反应和解毒；
将各个处理的种子与河沙混合，均匀将种子播种于河沙，再覆盖 2.0cm河沙，用手轻轻压紧，直至河沙与种子紧密结合，最后用1000 倍多菌灵水溶液淋透，播种后，播种基质湿度保持为60-70％，环境温度为25-30℃。
进一步地，步骤S4中数据统计分析的方法，包括以下步骤：
播种后，连续90天每天观测记录种子的发芽情况，因桃金娘种子发芽势不整齐，直到连续1周没有种子发芽才结束观测，分别统计 6h、12h、24h、48h、72h和96h不同浓度处理下的发芽率，分析不同处理对桃金娘种子发芽率的影响；
待幼苗长至2-3cm，含有4-6个叶片时进行移栽，统计移栽数及移栽半年后的幼苗成活率；
移栽一年后统计变异率，测定表型变异株的株高、地径、叶形、株型、叶色相关指标，株高、地径和叶色的测定分别采用卷尺、数显游标卡尺和皇家园艺出版的比色卡；
试验数据采用Excell 2010进行统计，采用DPS软件分别对同一浸泡时间内不同浓度下的发芽率、成活率、变异率进行多重比较。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明采用甲基磺酸乙酯诱变桃金娘种子，部分浓度处理可促进桃金娘种子发芽。
(2)本发明获得了多种表型突变体，为桃金娘育种提供了新方法。
(3)本发明采用的甲基磺酸乙酯诱变剂不仅诱变效率高、成本低，而且使用后的溶液可通过5％硫代硫酸钠溶液终止其毒性，不会对环境造成污染。
【附图说明】
图1为桃金娘种子浸泡6h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图2为桃金娘种子浸泡12h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图3为桃金娘种子浸泡24h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图4为桃金娘种子浸泡48h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图5为桃金娘种子浸泡24h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图6为桃金娘种子浸泡48h不同浓度下发芽率和移栽成活率的影响图；
图7为桃金娘株型散，叶片反卷，狭长图；
图8为桃金娘株型紧奏，叶片小且近椭圆形图；
图9为桃金娘分枝多图；
图10为桃金娘株型直立、分枝少的对照图。
其中，图1-6横坐标数字1-10分别表示0ml/L、1ml/L、3ml/L、 5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、18ml/L、30ml/L。
【具体实施方式】
1.材料与方法
1.1材料
供试材料采自广西防城港市上思县，种植于广西壮族自治区林业科学研究院园林花卉所，2020年9月2日开始采收种子。
化学诱变剂采用甲基磺酸乙酯。
1.2方法
1.2.1种子与基质准备
将采收的种子用手将果肉碾碎，然后用沙与果肉反复摩擦，直到果肉与种子完全分离，最后用清水反复冲洗种子，直到种子清洗干净为止，常温条件下，用浓度为5000mg/L的KNO3溶液在遮光的条件下浸泡种子12h；
使用长宽高为60cm×30cm×10cm的无孔穴盘将河沙分装，基质分装厚度为5cm，预留2cm，用500倍的多菌灵水溶液消毒。
1.2.2药品配置
0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)配制方法：加入35.814g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为0.1mol/L的Na2HPO4；往烧杯中加入15.601g的NaH2PO4·2H2O，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为0.1mol/L的NaH2PO4溶液；取390mLNaH2PO4溶液于1L锥形瓶中，加入610mLNa2HPO4溶液，配成1L的磷酸缓冲液。
甲基磺酸乙酯溶液：用配置好的磷酸缓冲液将甲基磺酸乙酯原液稀释成不同浓度的甲基磺酸乙酯溶液。
5％硫代硫酸钠溶液(1L)：50g硫代硫酸钠加入950g水中溶解。
1.2.3种子处理与播种
将种子放入配制好的甲基磺酸乙酯溶液中浸泡，用带有盖子的 15mL试管盛放甲基磺酸乙酯和种子。甲基磺酸乙酯浓度和浸泡时间见表1。
表1甲基磺酸乙酯不同浓度、浸泡时间和处理编号
用不同浓度甲基磺酸乙酯处理种子，设置10个浓度梯度：0ml/L、 1ml/L、3ml/L、5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、18ml/L、30ml/L，设6个处理时间：6h、12h、24h、48h、72h和96h。每个处理200粒种子。设置3个重复。
共需种子数量：60处理×200粒/处理×3重复＝36000粒
根据每个处理时间，在摇床上设置相应的振荡时间，摇床温度设置为26℃，转速为230转/秒。
将浸泡后每个处理的种子放入30mL 5％硫代硫酸钠溶液中半小时终止甲基磺酸乙酯诱变，后用水冲洗3小时，即可播种。
使用后的甲基磺酸乙酯溶液加入2L 5％硫代硫酸钠溶液半小时，可以终止反应和解毒。
将各个处理的种子与河沙混合，均匀将种子播种于河沙，再覆盖 2.0cm河沙，用手轻轻压紧，直至河沙与种子紧密结合，最后用1000 倍多菌灵水溶液淋透，播种后，播种基质湿度保持为60-70％，环境温度为25-30℃。
1.2.4数据统计分析
播种后，每天观测记录种子的发芽情况，因桃金娘种子发芽势不整齐，直到连续1周没有种子发芽才结束观测。分别统计6h、12h、 24h、48h、72h和96h不同浓度处理下的发芽率，分析不同处理对桃金娘种子发芽率的影响。
待幼苗长至2-3cm，含有4-6个叶片时进行移栽，统计移栽数及移栽半年后的幼苗成活率。
移栽一年后统计变异率，测定表型变异株的株高、地径、叶形、株型、叶色等相关指标。株高、地径和叶色的测定分别采用卷尺(精度为0.01cm)、数显游标卡尺(精度为0.01mm)和皇家园艺出版的比色卡。
试验数据采用Excell 2010进行统计，采用DPS软件分别对同一浸泡时间内不同浓度下的发芽率、成活率、变异率进行多重比较。
2.结果与分析
2.1甲基磺酸乙酯不同浓度和处理时间对桃金娘种子发芽的影响
统计播种90天时的种子发芽率，对同一浸泡时间不同浓度进行多重比较。由图1-6及表2可知，浸泡6h，浓度为0ml/L时发芽率最低，为58.67％，其他浓度处理均与该浓度处理存在差异显著性；浸泡12h，浓度为12ml/L时发芽率最高，为66.67％，浓度为18ml/L 时发芽率最低，为27.83％，所有浓度处理均与18ml/L时存在差异显著性；浸泡24h，发芽率随着浓度的升高逐渐升高，在3ml/L时达最高值(64.17％)，然后随浓度升高逐渐降低，在浓度为18ml/L时发芽率最低(0.83％)，然后在30ml/L时又升高(21.00％)，浓度≧12ml/L 的处理与其他处理均存在差异显著性；浸泡48h，发芽率随着浓度的升高逐渐升高，在3ml/L时达最高值(81.33％)，然后随浓度升高逐渐降低，浓度为12ml/L时发芽率最低(0.67％)，浓度为1ml/L和 3ml/L处理与其他处理的差异均显著；浸泡72h，浓度为3ml/L时发芽率最高(68.5％)，其次为1ml/L(65.33％)，然后随浓度升高逐渐降低，浓度为12ml/L时发芽率最低(0.17％)，最后在3ml/L时又升高(50.83％)，浓度为1ml/L和3ml/L与其他处理均存在差异显著性；浸泡96h，发芽率随着浓度的升高逐渐下降，浓度为0ml/L时发芽率最高(44.17％)，浓度≧12ml/L的处理发芽率均为0.00％，0ml/L 处理与其他处理均存在差异显著性。
表2不同浓度甲基磺酸乙酯和浸泡时间对桃金娘种子发芽率、移栽成活率及变异率的影响
注：同一列数据上标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2甲基磺酸乙酯不同浓度和处理时间对桃金娘幼苗移栽成活率的影响
幼苗移栽半年后统计移栽成活率，研究甲基磺酸乙酯溶液不同浓度和不同浸泡时间对桃金娘幼苗移栽成活率的影响。由图1-6及表2 可知，浸泡6h，浓度为12ml/L时幼苗移栽成活率最高(82.37％)，浓度为18ml/L时成活率最低(8.16％)，该浓度下的移栽成活率与其他处理的差异均显著；浸泡12h，浓度为0ml/L时成活率最高 (77.58％)，该浓度与其他处理均存在差异显著性，浓度18ml/L时成活率最低(0.00％)；浸泡24h，浓度为1ml/L时成活率最高(87.29％)，该浓度与其他处理均存在差异显著性，浓度为15ml/L 和18ml/L时成活率最低，均为0.00％；浸泡48h，浓度为18ml/L时成活率最高(96.56％)，浓度为12ml/L时成活率最低(0.00％)，浓度为18ml/L、15ml/L和9ml/L时的成活率与其他处理差异均显著；浸泡72h，浓度为12ml/L时成活率最高(100％)，浓度为1ml/L时成活率最低(16.55％)，浓度为12ml/L、5ml/L、3ml/L和12ml/L时的成活率与其他处理均存在差异显著性；浸泡90h，浓度为7ml/L时成活率最高(100％)，浓度大于等于12ml/L时成活率均为0.00％， 0-7ml/L浓度时的成活率与其他处理差异性均显著。
2.3甲基磺酸乙酯不同浓度和处理时间对桃金娘幼苗变异的影响
移栽1年后，统计幼苗变异率。由表2可知，浸泡6h，浓度为 12ml/L和15ml/L时变异率最高，均为0.67％，浓度为0ml/L、1ml/L、 5ml/L时变异率均为0.00％，出现变异的处理与未出现变异的差异均显著；浸泡12h，浓度为3ml/L时变异率最高(1.33％)，其次为浓度为1ml/L，变异率为1.17％，这两个浓度下的变异率与其他处理差异均显著；浸泡24h，浓度为30ml/L时变异率最高(0.33％)，其次为浓度为7ml/L(0.17％)，其余浓度变异率均为0.00％，出现变异的处理与未出现变异的处理存在差异显著性；浸泡48h，浓度为1ml/L 时变异率最高(0.67％)，其次为浓度3ml/L和7ml/L(均为0.17％)，此三种浓度下的变异率与其他处理差异均显著；浸泡72h，浓度为 3ml/L时变异率最高(0.33％)，其次为浓度为1ml/L和9ml/L(均为 0.17％)，此三种浓度下的变异率与其他处理差异均显著；浸泡96h，浓度为3ml/L时变异率最高(0.33％)，其次为浓度为1ml/L，变异率为0.17％，这两个浓度下的变异率与其他处理差异均显著。
甲基磺酸乙酯诱变桃金娘种子，获得50株表型突变体，突变体变异类型主要表现为株型紧凑、节间缩短、叶片近圆形或椭圆形、株型松散、枝条柔软、叶片反卷、分枝多等，部分变异类型见表3。
表3部分表型突变体变异特征
3.小结
本研究通过设置不同浓度甲基磺酸乙酯溶液(0ml/L、1ml/L、 3ml/L、5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、18ml/L、30ml/L) 和不同浸泡时间(6h、12h、24h、48h、72h和96h)，研究各处理对桃金娘种子发芽率、成活率及变异率的影响，获得以下结果：
(1)采用3ml/L浓度浸泡48h，种子发芽率最高(81.33％)，浸泡96h，浓度大于等于12ml/L时的发芽率为0.00％；在相同浸泡时间6h处理下，0ml/L时的发芽率(58.67％)最低；12h、24h、48h 和72h浸泡时均有个别浓度处理下的发芽率高于相同时间下的对照发芽率；浸泡96h，发芽率随着浓度的升高逐渐降低；浓度为0时，浸泡12小时发芽率最高，为66.17％；同一浸泡时间不同浓度下的发芽率存在显著差异。
(2)浸泡72h浓度为12ml/L和浸泡96h浓度为7ml/L时的移栽成活率最高，均为100％；浸泡12h时，0ml/L移栽成活率最高 (77.58％)，其余浸泡时间下，均有移栽成活率高于0ml/L的浓度处理；同一浸泡时间下不同浓度之间的移栽成活率存在显著差异。
(3)共获得50株表型突变体，与对照存在显著差异；其中浸泡 12h、浓度为3ml/L时变异率最高(1.33％)。
以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (8)
1.一种利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：种子与基质准备；
S2：药品配置；
S3：种子处理与播种；
S4：数据统计分析。
2.根据权利要求1所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，步骤S1中种子与基质准备的方法，包括以下步骤：
将采收的种子用手将果肉碾碎，然后用沙与果肉反复摩擦，直到果肉与种子完全分离，最后用清水反复冲洗种子，直到种子清洗干净为止，常温条件下，用浓度为5000mg/L的KNO3溶液在遮光的条件下浸泡种子12h；
使用长宽高为60cm×30cm×10cm的无孔穴盘将河沙分装，基质分装厚度为5cm，预留2cm，用500倍的多菌灵水溶液消毒。
3.根据权利要求1所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，步骤S2中药品配置包括0.1mol/L磷酸缓冲液配制、甲基磺酸乙酯溶液配制、5％硫代硫酸钠溶液配制。
4.根据权利要求3所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，所述0.1mol/L磷酸缓冲液配制方法，包括以下步骤：
加入35.814g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为0.1mol/L的Na2HPO4；往烧杯中加入15.601g的NaH2PO4·2H2O，再加入蒸馏水，定容至1L，即配制成浓度为0.1mol/L的NaH2PO4溶液；取390mLNaH2PO4溶液于1L锥形瓶中，加入610mLNa2HPO4溶液，配成1L的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求3所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，所述甲基磺酸乙酯溶液配制是用配置好的磷酸缓冲液将甲基磺酸乙酯原液稀释成不同浓度的甲基磺酸乙酯溶液。
6.根据权利要求3所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，所述5％硫代硫酸钠溶液配制方法，包括以下步骤：向50g硫代硫酸钠加入950g水中溶解。
7.根据权利要求1所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，步骤S3中种子处理与播种包括内容：
将种子放入配制好的甲基磺酸乙酯溶液中浸泡，用带有盖子的15mL试管盛放甲基磺酸乙酯和种子，甲基磺酸乙酯浓度和浸泡时间见下表；
用不同浓度甲基磺酸乙酯处理种子，设置10个浓度梯度：0ml/L、1ml/L、3ml/L、5ml/L、7ml/L、9ml/L、12ml/L、15ml/L、18ml/L、30ml/L，设6个处理时间：6h、12h、24h、48h、72h和96h，每个处理200粒种子，设置3个重复；
共需种子数量：60处理×200粒/处理×3重复＝36000粒；
根据每个处理时间，在摇床上设置相应的振荡时间，摇床温度设置为26℃，转速为230转/秒；
将浸泡后每个处理的种子放入30mL5％硫代硫酸钠溶液中半小时终止甲基磺酸乙酯诱变，后用水冲洗3小时，即可播种；
使用后的甲基磺酸乙酯溶液加入2L5％硫代硫酸钠溶液半小时，可以终止反应和解毒；
将各个处理的种子与河沙混合，均匀将种子播种于河沙，再覆盖2.0cm河沙，用手轻轻压紧，直至河沙与种子紧密结合，最后用1000倍多菌灵水溶液淋透，播种后，播种基质湿度保持为60-70％，环境温度为25-30℃。
8.根据权利要求1所述的利用甲基磺酸乙酯探究桃金娘种子诱变效应的方法，其特征在于，步骤S4中数据统计分析的方法，包括以下步骤：
播种后，每天观测记录种子的发芽情况，因桃金娘种子发芽势不整齐，直到连续1周没有种子发芽才结束观测，分别统计6h、12h、24h、48h、72h和96h不同浓度处理下的发芽率，分析不同处理对桃金娘种子发芽率的影响；
待幼苗长至2-3cm，含有4-6个叶片时进行移栽，统计移栽数及移栽半年后的幼苗成活率；
移栽一年后统计变异率，测定表型变异株的株高、地径、叶形、株型、叶色相关指标，株高、地径和叶色的测定分别采用卷尺、数显游标卡尺和皇家园艺出版的比色卡；
试验数据采用Excell2010进行统计，采用DPS软件分别对同一浸泡时间内不同浓度下的发芽率、成活率、变异率进行多重比较。
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