CN112602591A - 一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种澳洲坚果的铯‑137诱变育种方法，澳洲坚果种子先经过杀菌处理，可以杀灭澳洲坚果种子上表面的病害菌，减少病害传播、预防田间病害发生；将杀菌处理的种子放入前处理液中浸泡处理，可以起到强化化学诱变效果的作用，促进澳洲坚果种子化学诱变；化学诱变剂采用甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯的混合物，可加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；还限定了化学诱变的处理工艺，分为两次诱变处理，使得诱变的效果更好；采用化学诱变处理与137Cs‑γ射线辐照处理相结合，进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；辐照处理的种子再进行震荡处理，可进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率。
Description
技术领域
本发明涉及农业种植技术领域，具体涉及一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法。
背景技术
澳洲坚果别名:昆士兰栗、澳洲胡桃、夏威夷果、昆士兰果，是一种原产于澳洲的树生坚果。澳洲坚果属常绿乔木，双子叶植物。树冠高大，叶3～4片轮生，披针形、革质，光滑，边缘有刺状锯齿。总状花序腋生，花米黄色，果圆球形，果皮革质，内果皮坚硬，种仁米黄色至浅棕色。适合生长在温和、湿润、风力小的地区。在世界上众多的干果之中，澳洲坚果的经济价值最高，素来享有“干果之王”的誉称。澳洲坚果果仁营养丰富(呈奶白色)，其外果皮青绿色，内果皮坚硬，呈褐色，单果重15-16克，含油量70%左右，蛋白质9%，含有包括人体必需的8种氨基酸在内的17种氨基酸，还富含矿物质和维生素。夏威夷果(澳洲坚果)果仁香酥滑嫩可口，有独特的奶油香味，是世界上品质最佳的食用用果，有“干果皇后”，“世界坚果之王”之美称，风味和口感都远比腰果好。澳洲坚果除了制作干果外，还可制作糕点、巧克力、食用油、化妆品等。此外澳洲坚果还具有很高的营养价值和药用价值。
目前澳洲坚果通常采用杂交育种的方法进行育种，方法单一，找寻除杂交育种之外的育种方法具有很高的研究价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种成活率高、重现性好的澳洲坚果的铯-137诱变育种方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理，滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4h～6h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为50～100g/kg的乙醇、浓度为20～25g/kg的柠檬酸和浓度为50～70g/kg的氯化钠；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为30～35℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡15～20h；再于温度为25～30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡8～12h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为200～300g/kg的乙醇、浓度为250～350mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为100～150mg/kg的硫酸二乙酯；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为40～60Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为25～30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2～3h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
进一步地，所述步骤（2）中的前处理液以水为溶剂，含有浓度为80g/kg的乙醇、浓度为23mg/kg的柠檬酸和浓度为60mg/kg的氯化钠。
进一步地，所述步骤（2）中的杀菌液以水为溶剂，含有浓度为100～200g/kg的乙醇、浓度为100～120g/kg的甲基托布津和浓度为30～50g/kg的氯化钠。
进一步地，所述步骤（2）中杀菌液以水为溶剂，含有浓度为150g/kg的乙醇、浓度为110g/kg的甲基托布津和浓度为40g/kg的氯化钠。
进一步地，所述步骤（3）中将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为32℃，250rmp的摇床内恒温震荡18h；再于温度为27℃，170rmp的摇床内恒温震荡10h，用蒸馏水冲洗4遍，得到化学诱变处理的种子。
进一步地，所述步骤（3）中所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为250g/kg的乙醇、浓度为300mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯。
进一步地，所述步骤（4）中用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为50Gy，得到辐照处理的种子。
进一步地，所述步骤（5）中将辐照处理的种子置于温度为28℃，180rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子。
本发明的有益效果是：本发明一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，澳洲坚果种子先经过杀菌处理，可以杀灭澳洲坚果种子上表面的病害菌，减少病害传播、预防田间病害发生；将杀菌处理的种子直接放入化学诱变剂溶液中进行化学诱变的效果不佳，因此本申请先对杀菌处理的种子进行前处理，将杀菌处理的种子放入前处理液中浸泡处理，可以起到强化化学诱变效果的作用，促进澳洲坚果种子化学诱变；甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯都是烷化剂，作用机制是烷化作用，作用重点是核酸，会导致DNA断裂、缺失或修补，单一的甲基磺酸乙酯，或是单一的硫酸二乙酯的化学诱变效果较差，化学诱变剂采用甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯的混合物，可加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；化学诱变剂不仅优化了甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯的配比，还限定了化学诱变的处理工艺，分为两次诱变处理，且改善两次诱变的温度及摇床的震荡频率使得诱变的效果更好；采用化学诱变处理与137Cs-γ射线辐照处理相结合，进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；辐照处理的种子再进行震荡处理，可进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率。
具体实施方式
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理3h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为50g/kg的乙醇、浓度为20g/kg的柠檬酸和浓度为50g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为100g/kg的乙醇、浓度为100g/kg的甲基托布津和浓度为30g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为30℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡15h；再于温度为25℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡8h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为200g/kg的乙醇、浓度为250mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为100mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为40Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为25℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
实施例2
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡6h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为100g/kg的乙醇、浓度为25g/kg的柠檬酸和浓度为70g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为200g/kg的乙醇、浓度为120g/kg的甲基托布津和浓度为50g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为35℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡20h；再于温度为30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡12h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为300g/kg的乙醇、浓度为350mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为150mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为60Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡3h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
实施例3
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理4h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为80g/kg的乙醇、浓度为23g/kg的柠檬酸和浓度为60g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为150g/kg的乙醇、浓度为110g/kg的甲基托布津和浓度为40g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为32℃，250rmp的摇床内恒温震荡18h；再于温度为27℃，170rmp的摇床内恒温震荡10h，用蒸馏水冲洗4遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为250g/kg的乙醇、浓度为300mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为50Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为28℃，180rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
实施例4
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例1
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；
（3）化学诱变处理：将杀菌的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例2
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例3
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例4
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例5
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）震荡处理：将化学诱变处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（5）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例6
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理经前处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（4）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（5）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例7
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对比例8
一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；种子可以是当年采摘的，也可以是上一年采摘的种子，不宜使用放置两年以上的种子；本实施使用的是当年采摘的种子，共计100颗；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理5h，用滤网滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4.5h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为85g/kg的乙醇、浓度为22g/kg的柠檬酸和浓度为65g/kg的氯化钠；
所述杀菌液以水为溶剂，含有浓度为160g/kg的乙醇、浓度为115g/kg的甲基托布津和浓度为45g/kg的氯化钠；
具体地，每颗种子至少需要30毫升的杀菌液；每颗种子至少需要35毫升的前处理液；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为33℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡17.5h；再于温度为27℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡9h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为265g/kg的乙醇、浓度为270mg/kg的甲基磺酸乙酯；
具体地，每颗种子至少需要20毫升的化学诱变剂溶液；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为45Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为26℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
对实施例1-4及对比例1-8处理得到的种子进行选品实验：
一、发芽试验：
1）将种子放到催芽床上，覆盖薄土，每日淋水，等待种子发芽，计算发芽率，发芽率（%）=（正常发芽数/实验种子数）x100%；
2）5周左右，种子出芽齐整之后，选择阴天进行幼苗的移植，将幼苗移植到18cm*18cm的育苗杯中，在移植苗的上方覆盖遮阳网；育苗杯中的营养土的配方为按体积比为5:1:2:1的比例混合的土、有机肥、腐熟猪粪、河沙；
3）对幼苗的形态进行观察，观察时间为2月至12月的实生苗，观察特殊性状，特殊性状具体为植株矮小、叶片畸形、根系盘旋生长不下扎等，统计特殊性状的数据，计算畸变率；
下表1给出实施例1-4及对比例1-8中的种子的发芽率的结果统计表；
表1
| 项数 | 初始种子数量（颗） | 发芽数量（颗） | 发芽率（%） |
| 实施例1 | 100 | 93 | 93 |
| 实施例2 | 100 | 92 | 92 |
| 实施例3 | 100 | 94 | 94 |
| 实施例4 | 100 | 95 | 95 |
| 对比例1 | 100 | 94 | 94 |
| 对比例2 | 100 | 93 | 93 |
| 对比例3 | 100 | 92 | 92 |
| 对比例4 | 100 | 93 | 93 |
| 对比例5 | 100 | 95 | 95 |
| 对比例6 | 100 | 94 | 94 |
| 对比例7 | 100 | 96 | 96 |
| 对比例8 | 100 | 98 | 98 |
下表2给出实施例1-4及对比例1-8中的种子的畸变率的结果统计表；
表2
| 项数 | 初始种子数量（颗） | 叶片畸形（棵） | 植株矮小（棵） | 浮根（棵） | 畸变率（%） |
| 实施例1 | 100 | 7 | 12 | 4 | 23 |
| 实施例2 | 100 | 6 | 11 | 5 | 22 |
| 实施例3 | 100 | 8 | 13 | 4 | 25 |
| 实施例4 | 100 | 9 | 13 | 5 | 27 |
| 对比例1 | 100 | 5 | 6 | 4 | 15 |
| 对比例2 | 100 | 6 | 8 | 2 | 16 |
| 对比例3 | 100 | 5 | 7 | 4 | 16 |
| 对比例4 | 100 | 5 | 9 | 4 | 18 |
| 对比例5 | 100 | 3 | 4 | 1 | 8 |
| 对比例6 | 100 | 5 | 3 | 2 | 10 |
| 对比例7 | 100 | 6 | 3 | 3 | 12 |
| 对比例8 | 100 | 4 | 5 | 2 | 11 |
由上述实验结果可知，本发明一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，将杀菌处理的种子直接放入化学诱变剂溶液中进行化学诱变的效果不佳，因此本申请先对杀菌处理的种子进行前处理，将杀菌处理的种子放入前处理液中浸泡处理，可以起到强化化学诱变效果的作用，促进澳洲坚果种子化学诱变；甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯都是烷化剂，作用机制是烷化作用，作用重点是核酸，会导致DNA断裂、缺失或修补，单一的甲基磺酸乙酯，或是单一的硫酸二乙酯的化学诱变效果较差，化学诱变剂采用甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯的混合物，可加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；化学诱变剂不仅优化了甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯的配比，还限定了化学诱变的处理工艺，分为两次诱变处理，且改善两次诱变的温度及摇床的震荡频率使得诱变的效果更好；采用化学诱变处理与137Cs-γ射线辐照处理相结合，进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率，且能得到特殊性状的种子；辐照处理的种子再进行震荡处理，可进一步加快澳洲坚果种子突变速度，提高突变率。
本发明一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，培育出的矮化植株的产量提高20%左右，抗倒伏、抗病能力强，整体性能优良。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选种：选择直径为25㎜～30㎜、果仁含水量为15.5％～20.0％且果壳表面光滑、无破损的成熟带壳澳洲坚果作为种子；
（2）种子前处理：将种子放入杀菌液中杀菌处理，滤干水分，得到杀菌的种子；将杀菌的种子放入前处理液中浸泡4h～6h, 阴干，得到经前处理的种子；所述前处理液以水为溶剂，含有浓度为50～100g/kg的乙醇、浓度为20～25g/kg的柠檬酸和浓度为50～70g/kg的氯化钠；
（3）化学诱变处理：将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为30～35℃，200～300rmp的摇床内恒温震荡15～20h；再于温度为25～30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡8～12h，用蒸馏水冲洗3～5遍，得到化学诱变处理的种子；所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为200～300g/kg的乙醇、浓度为250～350mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为100～150mg/kg的硫酸二乙酯；
（4）铯-137诱变处理：用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为40～60Gy，得到辐照处理的种子；
（5）震荡处理：将辐照处理的种子置于温度为25～30℃，150～200rmp的摇床内恒温震荡2～3h，得到震荡处理的种子；
（6）选品实验：育苗繁殖，通过幼苗早期及幼苗成株后的相关形态参数的测定，获得优良目标性状的澳洲坚果新品种。
2.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（2）中的前处理液以水为溶剂，含有浓度为80g/kg的乙醇、浓度为23mg/kg的柠檬酸和浓度为60mg/kg的氯化钠。
3.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（2）中的杀菌液以水为溶剂，含有浓度为100～200g/kg的乙醇、浓度为100～120g/kg的甲基托布津和浓度为30～50g/kg的氯化钠。
4.根据权利要求3所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（2）中杀菌液以水为溶剂，含有浓度为150g/kg的乙醇、浓度为110g/kg的甲基托布津和浓度为40g/kg的氯化钠。
5.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中将经前处理的种子放入化学诱变剂溶液中，并于温度为32℃，250rmp的摇床内恒温震荡18h；再于温度为27℃，170rmp的摇床内恒温震荡10h，用蒸馏水冲洗4遍，得到化学诱变处理的种子。
6.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述化学诱变剂溶液以水为溶剂，含有浓度为250g/kg的乙醇、浓度为300mg/kg的甲基磺酸乙酯和浓度为120mg/kg的硫酸二乙酯。
7.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（4）中用137Cs-γ射线辐照处理化学诱变处理的种子，辐照剂量率为0.75Gy/min，辐照剂量强度为50Gy，得到辐照处理的种子。
8.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果的铯-137诱变育种方法，其特征在于，所述步骤（5）中将辐照处理的种子置于温度为28℃，180rmp的摇床内恒温震荡2.5h，得到震荡处理的种子。
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