CN111011210A - 一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法 - Google Patents

一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法 Download PDF

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曹颖
黄艳
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Abstract

本发明公开了一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，选取竹分枝茎芽诱导的愈伤组织，将乙烯亚胺和核酸碱基类似物马来酰肼混合配制诱变溶液，通过注射诱变溶液进行内照射，再经诱变溶液震荡处理，接种在分化培养基上培养后，经生根培养基培养，15～30天后获得完整的再生植株，用EST‑SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，筛选具有优良性状的纤维用竹新种质。本发明具有操作简单，选育材料广泛，后代性状稳定快，选育时间短的特点。

Description

一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法
技术领域
本发明属于植物辐射诱变育种技术领域，具体涉及一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法。
背景技术
制浆造纸工业是中国乃至世界经济的重要支柱产业之一，在我国经济飞速发展的同时，对纸的需求量会迅速不断的增加。由于在我国森林资源比较短缺和森林保护系列相关的法律政策的不断完善，以及造纸产业链中的废纸回收利用率比较低，木材资源的缺口很大程度上只能依靠进口来弥补，国家不得不花费大量的资金进口木材和木浆。然而，竹作为一种在我国分布广泛的植物自然资源，具有分布广、适应性强、生长快、成才早、经济价值高等特点，一次造林成功后，经过3-5年就可以年年砍伐，且持续几十年以致上百年。竹材的纤维素含量在40％-60％，其优良的制浆性能可与部分木材纤维比美，并且竹浆的纤维形态质量介于草浆和木浆之间，更接近于木浆，这些都促使其成为一种优良的非木材类造纸原材料。因此，培育生物量大、纤维素高的浆用竹品种对提高竹浆造纸的可持续发展有重要意义。
中国是利用竹材造纸最早的国家，已有1700多年的历史。全球约有1200余种竹，中国约有39属600余种。常用制浆竹材仅是30多种原生乡土丛生混合竹种。中国的竹子研究历史和现状相对领先于世界其它国家，但由于竹子遗传背景的复杂性和生物学的特殊性，即竹类植物开花具有不确定性，且开花后即死亡等特点，很难通过传统的育种方法对其进行品种改良。现有纤维用竹良种选育主要是从自然突变选育或从异地引种驯化进行无性繁殖，而且品种类型比较单一。此外，竹类遗传转化体系尚不成熟，很难通过基因工程的手段对其进行遗传改良。迄今为止，还没有建立一套纤维用竹新种质资源创制和筛选的现代生物技术体系。随着竹材工业化利用的快速发展以及人们生活水平的不断提高，对定向培育适合不同用途的纤维用竹新品种的创制和选育提出了更新更高的要求。
竹秆上在某些节处可以长出分枝，分枝的茎节处可以萌发出芽，易于取材，易于离体诱导愈伤组织并获得再生植株的良好外植体材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，以定向培育出不同用途的优质速生竹材并加工出优质竹纤维原料的纤维用竹新种质。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，包括以下步骤：
1)选取纤维素含量40％～60％、木质素含量20％～30％的竹子，取其分枝茎芽诱导的愈伤组织；
2)将乙烯亚胺和核酸碱基类似物马来酰肼混合配制诱变溶液；
3)将得到诱变溶液注射入愈伤组织；
4)将注有诱变溶液的愈伤组织置于诱变溶液中震荡处理；
5)震荡诱变的愈伤组织接种在分化培养基上培养后，经生根培养基培养，15～30天后获得完整的再生植株；
6)用EST-SSR分子标记筛选得到突变体植株，筛选具有优良性状的纤维用竹新种质。
进一步的，步骤(1)中所述的竹子选自慈竹、梁山慈竹、绿竹、硬头黄竹、孝顺竹、佯黄竹、牡竹、青皮竹或粉单竹中之一种。
进一步的，步骤(1)中所述的分枝茎芽采用MS2培养基诱导培养。
进一步的，步骤(2)中所述的乙烯亚胺与马来酰肼按照不同的质量比(0.5～2:1～3)配置成诱变溶液，使其最终百分含量为0.1％～1.0％。
进一步的，步骤(3)中所述的震荡条件为：震荡30～180min，震荡速度90rpm。
进一步的，所述的分化培养基为MS4培养基；所述的生根培养基为MS5培养基。
进一步的，所述的EST-SSR分子标记的引物选自SEQ ID NO.1～6。
本发明的有益效果为：
本技术发明方法提供一种纤维用竹愈伤组织烷化剂和核酸碱基类似物混合诱变创制新种质的方法。烷化剂的作用机制是烷化作用，其可以导致DNA断裂、缺失或修补。烷化剂乙烯亚胺离体诱变，因诱变剂中含有1个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的DNA分子中去，置换DNA分子中氢原子而使一些碱基烷基化。核酸碱基类似物马来酰肼可以作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异，二者结合诱变，扩大变异范围，实现了纤维用竹的遗传改良，获得纤维用竹新种质，操作简单，选育材料广泛，后代性状稳定快，选育时间短，突变植株筛选得到具有优良性状的纤维用竹新种质，可为定向培育不同用途的优质速生纤维用竹材并加工出优质竹纤维原料提供了新种质。
附图说明
图1本发明实施例中序列1～2的EST-SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳图结果；
图2本发明实施例中序列5～6的EST-SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳图结果。
具体实施方式
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
慈竹、梁山慈竹、绿竹、硬头黄竹、孝顺竹、佯黄竹、牡竹、青皮竹、粉单竹来源于四川成都望江楼公园(四川成都)，获取时间为2016年04月。直接来源的提供者为王道云；联系方式：四川成都；E-Mail：656096032@qq.com；邮编：610000。
实施例中培养基：
愈伤组织诱导培养基(又称MS2培养基)：KNO31.9g/L、NH4NO31.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO40.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO30.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H200.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，2,4-D 2mg/L、KT 0.2mg/L、IBA0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；pH5.8。
分化培养基(又称MS4培养基)：KNO31.9g/L、NH4NO31.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO40.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO30.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H200.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，KT 2.5mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，余量为水；pH5.8。
生根培养基(又称MS5培养基)：KNO31.9g/L、NH4NO31.65g/L、CaCl20.33224g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO40.17g/L，MnSO4·4H2O 0.0223g/L、ZnSO4·7H2O 0.008g/L、H3BO30.0062g/L、KI 0.00083g/L、Na2MoO4·2H2O 0.00025g/L、CuSO4·5H2O 0.000025g/L、CoCl2·6H2O 0.000025g/L，氨基乙酸0.002g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆辛0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、肌醇0.1g/L，FeSO4·7H200.0279g/L、EDTA-2Na·2H2O0.0373g/L，NAA 0.25mg/L、IBA 0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，余量为水；pH5.6-5.8。
实施例1
选取纤维素含量54％、木质素含量23％的纤维用慈竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照1:1组合配制成0.6％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将50μL的0.6％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的1:1组合的0.6％的诱变剂溶液中，震荡60min,震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，23天后长出芽，经过根的离体诱导，19天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用慈竹新种质。
实施例2
选取纤维素含量52％、木质素含量22％的纤维用梁山慈竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照2:1组合配制成0.1％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将30μL的0.1％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的2:1组合的0.1％的诱变剂溶液中，震荡120min,震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，28天后长出芽，经过根的离体诱导，15天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用梁山慈竹新种质。
实施例3
选取纤维素含量42％、木质素含量27％的纤维用绿竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照1:1.5组合配制成0.8％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将20μL的0.8％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的1:1.5组合的0.8％的诱变剂溶液中，震荡30min,震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，30天后长出芽，经过根的离体诱导，20天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用绿竹新种质。
实施例4
选取纤维素含量45％、木质素含量25％的纤维用硬头黄竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照0.5:2组合配制成1.0％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将40μL的1.0％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的0.5:2组合的1.0％的诱变剂溶液中，震荡80min，震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，28天后长出芽，经过根的离体诱导，25天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用硬头黄竹新种质。
实施例5
选取纤维素含量43％、木质素含量26％的纤维用孝顺竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照2:3组合配制成0.7％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将10μL的0.70％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的2:3组合的0.7％的诱变剂溶液中，震荡180min，震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，20天后长出芽，经过根的离体诱导，15天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用孝顺竹新种质。
实施例6
选取纤维素含量50％、木质素含量24％的纤维用佯黄竹的分枝茎芽诱导的愈伤组织。选取烷化化学诱变剂乙烯亚胺(EI)和核酸碱基类似物马来酰肼(MH)，按照1.5:1组合配制成0.5％的诱变剂溶液。用不锈钢连续注射器将20μL的0.5％的诱变剂溶液注入大小约为0.05～1.0cm的愈伤组织。将注有诱变剂的愈伤组织再置于EI和MH的1.5:1组合的0.5％的诱变剂溶液中，震荡50min，震荡速度90rpm。将诱变后的愈伤组织接种在芽诱导培养基上，20天后长出芽，经过根的离体诱导，30天后获得完整的再生植株。用EST-SSR分子标记技术筛选得到突变体植株，移栽360天后，筛选具有优良性状的纤维用佯黄竹新种质。
实施例7
对诱变后得到的慈竹再生植株和对照株进行EST-SSR分子标记技术分析。
1)取叶片，提取基因组DNA。
2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用EST-SSR引物扩增。通过对45对EST-SSR引物进行筛选，我们得到3对具有多态性条带的EST-SSR引物(表1)。
表1
Figure BDA0002361735210000091
反应体系(20μL)：2μL 10×PCR Buffer I、2μL dNTP混合溶液(2.5mM each)、0.5μL基因组DNA、0.6μL引物溶液(10μM)、0.15μL rTaq DNA聚合酶溶液(5U/μL)，余量为ddH2O。10×PCR Buffer I：Takala公司。
反应条件：94℃5min；94℃30s、50℃45s、72℃30s，36个循环；72℃2min；4℃保存。
3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
引物具有如下性能：不管采用哪条引物，电泳带型与对照株有差异的再生植株即为突变株；对每个样本进行多次重复试验，每次电泳条带的均带型清晰，多次重复试验的带型显示均一致。
图1和图2分别为SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.5～6引物对部分不同突变体扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中，M代表DNA marker，不同泳道数字编号代表不同慈竹突变体。圆圈内条带表示与对照株相比突变株有特异条带的缺失，箭头代表有新条带的出现。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 西南科技大学
<120> 一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcccacagga attatgtagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cactactccc cctttttctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacgatgatt tatctgtcga g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cattagcaga attttcagag c 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggacgtcgta ctcttaca 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattaatttc ttgccacttg 20

Claims (8)

1.一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选取纤维素含量40％～60％、木质素含量20％～30％的竹子，取其分枝茎芽诱导的愈伤组织；
2)将乙烯亚胺和核酸碱基类似物马来酰肼混合配制诱变溶液；
3)将得到诱变溶液注射入愈伤组织；
4)将将注有诱变溶液的愈伤组织置于诱变溶液中震荡处理；
5)震荡诱变的愈伤组织接种在分化培养基上培养后，经生根培养基培养，15～30天后获得完整的再生植株；
6)用EST-SSR分子标记筛选得到突变体植株，筛选具有优良性状的纤维用竹新种质。
2.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的竹子选自慈竹、梁山慈竹、绿竹、硬头黄竹、孝顺竹、佯黄竹、牡竹、青皮竹或粉单竹中之一种。
3.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的分枝茎芽采用MS2培养基诱导培养。
4.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的诱变溶液中乙烯亚胺与马来酰肼的质量比为0.5～2:1～3。
5.根据权利要求4所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的诱变溶液百分含量为0.1％～1.0％。
6.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的震荡条件为：震荡30～180min，震荡速度90rpm。
7.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的分化培养基为MS4培养基；所述的生根培养基为MS5培养基。
8.根据权利要求1所述的一种烷化剂和核酸碱基诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法，其特征在于，所述的EST-SSR分子标记的引物选自SEQ ID NO.1～6。
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CN111213583A (zh) * 2020-01-09 2020-06-02 西南科技大学 一种内照射与化学诱变纤维用竹愈伤组织的制种方法
CN111213581A (zh) * 2020-01-09 2020-06-02 西南科技大学 一种内外照射诱变纤维用竹愈伤组织的育苗方法

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