CN104982335B - 用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基 - Google Patents
用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基，其特征在于：它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基。本发明还提供了这种联合用培养基的制备方法。本发明的联合用培养基配制方便，能够应用于黄瓜子房离体再生，得到大量的黄瓜二倍体再生植株，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于植物离体再生技术领域，具体涉及用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界上的主要蔬菜之一，栽培历史悠久，黄瓜富含纤维素、多种维生素和矿质元素，有很高的营养及药用价值，深受广大消费者喜爱。由于种内资源有限，很难通过常规育种方法研制出黄瓜新品种，利用基因工程技术将是今后黄瓜品种改良的有效手段。因此建立高效的黄瓜离体再生体系，对于进一步的转基因等研究十分必要。
自1979年佐滕正孝获得首例黄瓜再生植株以来，黄瓜组织培养开始逐渐发展，至今国内外对黄瓜再生培养的研究已有一些成功的报道。黄瓜再生分化的主流方法是通过子叶、子叶节培养，以器官直接发生途径得到再生植株。在器官发生途径中，伴随有少量或没有愈伤组织，但这些愈伤组织不分化。这种发生途径存在很多问题：①基因型制约大，部分基因型不能通过该途径分化得到植株；②工作量大：种子灭菌-无菌苗培养-子叶/子叶节切取-接种子叶/子叶节-诱导分化-再生苗伸长培养-再生苗生根培养，每个步骤缺一不可；③通过该途径得到的分化苗少，单个子叶节/子叶仅能分化1-2棵完整植株，再生频率低；④需要耗费大量的种子，如果需要1000个外植体，需要使用500-1000颗饱满、新鲜的种子。而且受到制种周期和制种成本的制约，成本昂贵。
通常，在黄瓜的组织培养中，影响组织培养成功率的因素主要有外植体、培养基、激素等，高效的离体再生需要多种因素的配合。有一些利用黄瓜子叶、下胚轴、叶片、叶柄等外植体通过愈伤组织方式再生植株的报道，但普遍存在基因型制约大、再生率低、重复性差等问题。
另外也有利用子房作为外植体的，如：杜胜利等(黄瓜雌核发育及染色体倍性鉴定与加倍研究，天津:南开大学,2002)利用黄瓜未授粉子房建立离体再生体系，但该方法得到再生植株不仅再生频率低，而且是单倍体、二倍体及多倍体的混合，需要对再生植株进行染色体倍性鉴定来区分，大大增加了工作量。
一直以来，研究者都试图利用组织培养的方法方便而高效地得到黄瓜再生植株，以便满足育种和品种改良的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供用于黄瓜子房高效离体再生的联合用培养基。
本发明提供了用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基，它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、4～7g/L的凝胶剂、1.2～2.0mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、4～7g/L的凝胶剂、1.5～3.0mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、5～7g/L的凝胶剂、0.1～0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
TDZ：噻苯隆，是一种细胞分裂素；
NAA：萘乙酸，是一种生长素；
6-BA：6-苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素；
IBA：吲哚乙酸，是一种生长素；
ABA：脱落酸；
NB培养基组分：KNO3 2830mg/L、(NH4)2SO4 463mg/L、CaCl2 125.33mg/L、KH2PO4400mg/L、MgSO4 90.37mg/L、H3BO3 3mg/L、MnSO4·H2O10mg/L、ZnSO4·7H2O 2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、KI 0.75mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2EDTA·2H2O 37.26mg/L、肌醇100mg/L、烟酸VB5 1mg/L、维生素B1 10mg/L、维生素B6 1mg/L；
MS培养基组分：KNO3 1900mg/L、NH4NO3 1650mg/L、KH2PO4 170mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、CaCl2 332.2mg/L、Na2EDTA·2H2O 37.26mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、MgSO4 180.7mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、KI 0.83mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、烟酸VB5 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、维生素B6 0.5mg/L。
NB培养基、MS培养基是植物组织培养常用的基本培养基，在实际应用中根据不同培养阶段和不同材料来源，通常需要在基本培养基中加入植物激素，例如不同种类和含量的生长素、细胞分裂素等，合适的植物组织培养基组成是植物组织培养成功的基础。
进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、1.2～2.0mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、2.0～3.0mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.1～0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
更进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、1.5mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、2.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
其中，所述碳源为蔗糖；所述凝胶剂为琼脂。
本发明提供了上述联合用培养基的制备方法，步骤如下：
称取愈伤组织诱导培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织诱导培养基；
称取愈伤组织增殖及分化培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织增殖及分化培养基；
称取不定苗伸长培养基的各组分，混匀溶解后，得不定苗伸长培养基；
称取生根培养基的各组分，混匀溶解后，得生根培养基。
本发明还提供了上述联合用培养基在黄瓜子房离体再生中的用途。
本发明的联合用培养基，可以用于黄瓜子房离体再生，使黄瓜子房通过愈伤组织再生分化途径得到形态正常的普通二倍体再生植株。
本发明的有益效果如下：
(1)基因型制约较小：对中国黄瓜主要栽培类型华北型和华南型黄瓜均适用；
(2)可以实现黄瓜的高效离体再生：首先愈伤组织诱导率高，10粒种子可得到200个子房，可诱导初始愈伤组织60个以上，大大节约种子使用量；其次愈伤组织增殖能力强，在离体再生过程中再生的愈伤组织可以大量增殖，无限扩繁；而且愈伤组织分化能力强，单个直径约3cm的愈伤组织可分化再生苗4-6苗，可达到黄瓜再生苗的持续不断的、规模化生产；
(3)工作量小：与主流的子叶/子叶节诱导得到再生植株方法相比，减少了从种子得到无菌苗的培养步骤。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1开花前4h的黄瓜未授粉子房。
图2黄瓜未授粉子房诱导后获得的愈伤组织。
图3黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养30天，愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点。
图4黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养到90天左右，见到叶、芽分化。
图5黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养得到丛生芽。
图6黄瓜丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养。
图7黄瓜不定苗转移到生根培养基中，培养得到离体再生植株。
图8黄瓜‘白丝条’再生植株倍性鉴定图，8a为流式细胞仪检测正常植株PI染料直方图，8b为流式细胞仪检测再生植株PI染料直方图，8c为正常植株流式细胞仪统计数据，8d为再生植株流式细胞仪统计数据。
图9黄瓜‘川绿1号’再生植株基因型鉴定的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，M代表Marker 250bp DNA Ladder，P1、P2、1、2、3、4、5泳道分别代表‘川绿1号’黄瓜父本、母本、再生植株1-5的ssr16005分子标记电泳结果，P1’、P2’、1’、2’、3’、4’、5’泳道分别代表‘川绿1号’黄瓜父本、母本、再生植株1-5的ssr19165分子标记电泳结果。
图10子叶外植体在本发明愈伤组织诱导培养基上接种培养，11a为接种后7天，11b为接种于20天，11c为接种后35天。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、仪器均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1 本发明联合用培养基的制备
联合用培养基包括包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、1.5mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA；
愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、2.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA；
不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.05mg/L的IBA。
制备方法如下：
一、准备工作
1、待用液a：
NB培养基购自PhytoTechnology Laboratories公司，为白黄色粉末。
称取4.1g NB培养基，加入蔗糖30g、琼脂7g，放入量杯中，再加入600mL水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。用1mol/L的NaOH溶液调节pH为5.8，最后加蒸馏水定容至900mL，搅拌均匀，灭菌(在1.06kg/cm2的压力下121℃灭菌20min)待用。
2、待用液b：
配制MS培养基母液，见表1：
表1 MS培养基母液
量取母液Ⅰ50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL，加入蔗糖30g、琼脂7g，放入量杯中，再加入600mL水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。用1mol/L的NaOH溶液调节pH为5.8，最后加蒸馏水定容至900mL，搅拌均匀，灭菌(在1.06kg/cm2的压力下121℃灭菌20min)待用。
3、激素
1)TDZ母液(1.0mg/mL)：
取0.1g TDZ，用4mL的0.1mol/L NaOH溶液预溶，用水定容至100mL，然后用0.22μm滤器过滤除菌，冻存于-20℃待用。
2)6-BA母液(1.0mg/mL)：
取0.1g 6-BA，用4mL的0.1mol/L NaOH溶液预溶，用水定容至100mL，然后用0.22μm滤器过滤除菌，冻存于-20℃待用。
3)NAA母液(1.0mg/mL)：
取0.1g NAA，用1mL无水乙醇预溶，用水定容至100mL，然后用0.22μm滤器过滤除菌，冻存于-20℃待用。
4)IBA母液(1.0mg/mL)：
取0.1g IBA，用1mL无水乙醇预溶，用水定容至100mL，然后用0.22μm滤器过滤除菌，冻存于-20℃待用。
二、制备联合用培养基
1、愈伤组织诱导培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液a，冷却至50℃时加入1.5mL TDZ母液和0.2mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
2.愈伤组织增殖及分化培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入2.5mL 6-BA母液和0.01mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
3、不定苗伸长培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.5mL 6-BA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
4、生根培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.05mL IBA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
实施例2 本发明联合用培养基的制备
联合用培养基包括包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、5g/L的琼脂、1.2mg/L的TDZ、0.5mg/L的NAA；
愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、5g/L的琼脂、1.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA；
不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、5g/L的琼脂、0.3mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.05mg/L的IBA。
制备方法如下：
一、准备工作
1、待用液a：除了琼脂加入的是5g，其它同实施例1中的待用液a。
2、待用液b：同实施例1中的待用液b。
3、待用液c：除了琼脂加入的是5g，其它同实施例1中的待用液b。
4、激素：同实施例1中的激素。
二、制备联合用培养基
1、愈伤组织诱导培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液a，冷却至50℃时加入1.2mL TDZ母液和0.5mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
2.愈伤组织增殖及分化培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液c，冷却至50℃时加入1.5mL 6-BA母液和0.01mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
3、不定苗伸长培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液c，冷却至50℃时加入0.3mL 6-BA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
4、生根培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.05mL IBA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
实施例3 本发明联合用培养基的制备
联合用培养基包括包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为40g/L的蔗糖、4g/L的琼脂、2.0mg/L的TDZ、0.5mg/L的NAA；
愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、4g/L的琼脂、3.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA；
不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、5g/L的琼脂、0.1mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.05mg/L的IBA。
制备方法如下：
一、准备工作
1、待用液a：除了蔗糖加入的是40g、琼脂加入的是4g，其它同实施例1中的待用液a。
2、待用液b：同实施例1中的待用液b。
3、待用液c：除了琼脂加入的是5g，其它同实施例1中的待用液b。
4、待用液d：除了琼脂加入的是4g，其它同实施例1中的待用液b。
5、激素：同实施例1中的激素。
二、制备联合用培养基
1、愈伤组织诱导培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液a，冷却至50℃时加入2.0mL TDZ母液和0.5mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
2.愈伤组织增殖及分化培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液d，冷却至50℃时加入3.0mL 6-BA母液和0.1mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
3、不定苗伸长培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液c，冷却至50℃时加入0.1mL 6-BA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
4、生根培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.05mL IBA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
实施例4 本发明联合用培养基的制备
联合用培养基包括包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为35g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、1.2mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA；
愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、2.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA；
不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、0.05mg/L的IBA。
制备方法如下：
一、准备工作
1、待用液a：除了蔗糖加入的是35g，其它同实施例1中的待用液a。
2、待用液b：同实施例1中的待用液b。
3、激素：同实施例1中的激素。
二、制备联合用培养基
1、愈伤组织诱导培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液a，冷却至50℃时加入1.2mL TDZ母液和0.2mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
2.愈伤组织增殖及分化培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入2.5mL 6-BA母液和0.1mL NAA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
3、不定苗伸长培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.5mL 6-BA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
4、生根培养基：以配制1升试剂为例：
取900mL待用液b，冷却至50℃时加入0.05mL IBA母液，定容至1L，混匀后分装即可，4℃保存。
以下用试验例的方式说明本发明联合用培养基的有益效果：
试验例1 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
华南型杂交品种黄瓜品种‘白丝条’；
种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内，株行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
2、实验用培养基
依照本发明实施例1方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
于黄瓜开花前4h取未授粉子房(开花前4h未授粉子房见图1)，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75％乙醇表面消毒30s，用10％的NaClO溶液灭菌10min，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度35℃，黑暗下72h；然后转至光下培养：培养温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx，30天继代1次。
在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大，培养30天后子房腔内壁出现很多松脆的淡黄色愈伤组织(见图2)。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。30天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点(见图3)，到90天左右见到叶、芽分化(见图4)，继续培养得到丛生芽(见图5)。
培养条件：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养(见图6)，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株(见图7)。
试验例2 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
同试验例1。
2、实验用培养基
依照本发明实施例2方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
同试验例1。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度35℃，黑暗下72h；然后转至光下培养：培养温度为24℃，光照16h/d，光强2300lx，30天继代1次。
在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大，培养30天后子房腔内壁出现很多松脆的淡黄色愈伤组织。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。30后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到90天左右见到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
培养条件：温度为24℃，光照16h/d，光强2300lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为24℃，光照16h/d，光强2300lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
试验例3 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
华南型地方品种黄瓜品种‘川绿1号’；
种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内，株行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
2、实验用培养基
依照本发明实施例1方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
同试验例1。
(2)愈伤组织的诱导
同试验例1。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。60天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到90天左右见到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
培养条件：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
试验例4 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
同试验例3。
2、实验用培养基
依照本发明实施例3方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
于黄瓜开花前5h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75％乙醇表面消毒30s，用10％的NaClO溶液灭菌10min，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度35℃，黑暗下48h；然后转至光下培养：培养温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx，30天继代1次。
在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大,培养30天后子房腔内壁出现很多松脆的淡黄色愈伤组织。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。40天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到90天左右见到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
培养条件：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为25℃，光照16h/d，光强2500lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
试验例5 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
华北型黄瓜品种‘川翠3号’，种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内，株行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
2、实验用培养基
依照本发明实施例4方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
于黄瓜开花前8h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75％乙醇表面消毒30s，用10％的NaClO溶液灭菌10min，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度34℃，黑暗下48h；然后转至光下培养：培养温度为24℃，光照16h/d，光强2000lx，30天继代1次。
在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大,培养60天后子房腔内壁出现很多松脆的淡黄色愈伤组织。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。60天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到120天左右见到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
培养条件：温度为24℃，光照16h/d，光强2000lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为24℃，光照16h/d，光强2000lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
试验例6 本发明联合用培养基用于制备黄瓜子房离体再生植株
1、实验材料
华北型黄瓜品种‘津优35’，种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内，株行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
2、实验用培养基
依照本发明实施例1方法制备的联合用培养基。
3、实验方法
(1)材料处理
于黄瓜开花前6h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75％乙醇表面消毒30s，用10％的NaClO溶液灭菌10min，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度36℃，黑暗下72h；然后转至光下培养：培养温度为26℃，光照16h/d，光强2000lx，30天继代1次。
在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大,培养60天后子房腔内壁出现很多松脆的淡黄色愈伤组织。
(3)愈伤组织的增殖及分化
将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大，由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm2的愈伤组织再切割为大小为0.5cm2的小愈伤团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈伤组织。60天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到120天左右见到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
培养条件：温度为26℃，光照16h/d，光强2000lx。
(4)不定苗的再生及生根培养
将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生根培养基中进行培养。
培养条件均为：温度为26℃，光照16h/d，光强2000lx。
4、实验结果
本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
试验例7 本发明得到的再生植株倍性鉴定
1、实验材料
取试验例1得到的‘白丝条’再生植株20株，以‘白丝条’正常二倍体植株叶片为对照，利用流式细胞仪对20棵再生植株进行倍性鉴定。
2、实验方法
配制LB01解离液：15mM Tris，2mM Na2EDTA，0.5mM四盐酸精胺，80mM KCl，20mMNaCl，0.1％(v/v)TritonX-100，15mM β巯基乙醇，pH 7.0～8.0。
1)取黄瓜再生植株幼嫩叶片1g，蒸馏水洗净，滤纸吸干后放入预冷的培养皿里，加入预冷的LB01解离液1～2mL，用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程，材料须浸没在解离液里，以便更好的游离细胞核；
2)吸取培养皿内的解离液，用400目的滤膜过滤到1.5mL离心管中，然后置于4℃冰箱中孵育5min；
3)离心，转速：1000r/min，温度：4℃，时间：5min；
4)弃上清后，再加入100μl预冷的解离液，同时加入150μL预冷的染料，每个样共约250μl细胞核悬浮液，然后置4℃冰箱避光染色10min；
5)移至上样管，上机检测，收集5000-10000个颗粒。
3、实验结果
见图8，流式细胞仪测定‘白丝条’正常二倍体植株G1、S、G2期平均PE-A值(图8a，8c)，再生植株G1、S、G2期平均PE-A值(图8b,8d)，表明再生植株与正常植株各时期DNA的含量基本一致。
8c和8d表明，‘白丝条’正常植株、再生植株处于G1、G2、S等不同细胞周期的细胞含量及对应阶段的DNA含量水平相当，表明20棵再生植株均为二倍体。由于‘白丝条’为基因型纯合的地方品种(基因型aa或者AA)，其再生植株不论是否由雌核细胞或者是由体细胞发育而来，基因型均与‘白丝条’相同(aa或者AA)，无需进行基因型鉴定。
试验例8 本发明得到的再生植株基因型鉴定
1、实验材料
华南型地方品种黄瓜品种‘川绿1号’的父本、母本和5株再生植株。
2、实验方法
取幼嫩叶片用CTAB法小量提取DNA。DNA在1％琼脂糖凝胶上检测DNA质量，并稀释到适当浓度的工作液，-20℃保存备用。进行分子标记ssr16005、ssr19165的基因型鉴定。PCR反应体系如下：总共25μL，包括：20ng模板DNA，正向、反向引物各1.0μM(各自引物序列见表2),1×PCR buffer，1.0U Taq酶，0.2mM dNTPs。PCR扩增体系为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环；最后72℃延伸10min。
采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，180V电泳2.5h后检测PCR扩增产物，获得‘川绿1号’的父本、母本和5株再生植株的扩增条带，银染显色后记录结果。
表2 ssr16005、ssr19165基因的引物
3、实验结果
见图9，‘川绿1号’为杂交品种，基因型为Aa，再生植株1-5的分子标记带型为父本、母本杂合条带，表明再生植株分子标记基因型是Aa，与‘川绿1号’正常植株相同。因此，再生植株是杂合二倍体植株。结果表明再生植株是由体细胞发育形成的普通二倍体植株，非雌核发育形成的双单倍体植株(如果是双单倍体植株，基因型与母本相同)。
试验例10本发明培养基的筛选实验
一、愈伤组织诱导阶段
1、实验材料
同试验例1。
2、实验方法
(1)材料处理
同试验例1。
(2)愈伤组织的诱导
将步骤(1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于不同配方的愈伤组织诱导培养基中；
首先热激处理：温度34℃，黑暗下72h；然后转至光下培养：培养温度为26℃，光照16h/d，光强2000lx，30天后统计愈伤诱导率。
3、实验结果：见表3
表3 不同配方培养基及愈伤组织诱导率
由表3可知，培养基4对愈伤组织的诱导率最高；通过观察可见，得到松脆的淡黄色愈伤组织。
二、愈伤组织增殖及分化阶段
分为愈伤组织增殖及芽点形成、愈伤组织分化两个阶段：
1、愈伤组织增殖及芽点形成阶段：
将上述愈伤组织诱导阶段由培养基4诱导得到的松脆的淡黄色愈伤组织转入培养基(培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、2.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA)培养，培养温度26℃，光照16h/d，光强2000lx。
培养60天，愈伤组织体积增大，颜色由淡黄色变为黄绿色，质地有松脆变坚实，开始出现绿色突起的芽点。将体积较大的愈伤组织分割，继续在该培养基上培养，愈伤可持续生长，实现增殖。
2、愈伤组织分化阶段
将愈伤组织增殖及芽点形成阶段得到的的有芽点的愈伤组织转移到不同配方的愈伤组织分化培养基上，30天后观察，结果见表4：
表4 不同配方愈伤组织分化培养基及分化结果
由表4可知，培养基1对愈伤组织的分化效果最好。因此，愈伤组织的增殖、分化可用相同的培养基，即培养基1。
试验例11 本发明培养基对其它外植体离体再生的筛选
1、外植体：黄瓜‘白丝条’无菌苗尚未展开的子叶。
2、实验方法：
选籽粒饱满、大小一致的种子，用自来水浸泡30s，待种皮变软后剥去种皮。种胚经75％乙醇处理30s，2％的NaClO表面消毒10min，无菌水洗涤3～4次，胚根端朝下插入1/2 MS添加终浓度为30g/L蔗糖、6g/L琼脂的固体培养基上。30℃暗处理1天后置于25℃光照培养室内培育，得到无菌苗。
取培养4～5天的供试黄瓜无菌苗子叶，切除柄端和上半部，仅保留下半部子叶，基部接触培养基，叶面朝上平接于本发明愈伤组织诱导培养基(以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、1.5mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA)，30天后观察。
3、实验结果：
子叶外植体在本发明愈伤组织诱导培养基上接种30天后，子叶基部发生大量白色疏松愈伤，并伴随白色须根。继续继代，愈伤组织逐渐黄化，无芽点分化，见图10。
综上，本发明联合用培养基，可以用于黄瓜子房组织培养，实现黄瓜的高效离体再生，得到大量的黄瓜二倍体再生植株，并可有效的应用于黄瓜品种改良，应用前景良好。
Claims (6)
1.用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基，其特征在于：它由愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基组成：
所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、4～7g/L的凝胶剂、1.2～2.0mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、4～7g/L的凝胶剂、1.5～3.0mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、5～7g/L的凝胶剂、0.1～0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30～40g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
2.根据权利要求1所述的联合用培养基，其特征在于：
所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、1.2～2.0mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、2.0～3.0mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.1～0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
3.根据权利要求2所述的联合用培养基，其特征在于：
所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、1.5mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA；
所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、2.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA；
所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.5mg/L的6-BA；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、0.05mg/L的IBA。
4.根据权利要求3所述的联合用培养基，其特征在于：所述碳源为蔗糖；所述凝胶剂为琼脂。
5.权利要求1-4任意一项所述联合用培养基的制备方法，其特征在于：步骤如下：
称取愈伤组织诱导培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织诱导培养基；
称取愈伤组织增殖及分化培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织增殖及分化培养基；
称取不定苗伸长培养基的各组分，混匀溶解后，得不定苗伸长培养基；
称取生根培养基的各组分，混匀溶解后，得生根培养基。
6.权利要求1-4任意一项所述联合用培养基在黄瓜子房离体再生中的用途。
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