CN108739385A - 一种砂梨叶片高效再生体系的建立方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种砂梨叶片高效再生体系的建立方法及其应用，包括以下步骤：（1）取砂梨的带芽枝条进行消毒，将带叶芽的茎尖接种于继代培养基上生长，再将未感染苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）的离体植株叶片切成小块叶片；（2）将外植体叶片接种于再生培养基中暗处理后再转至光下培养，产生不定芽，所述的再生培养基以NN69营养液为基础，再添加3‑5mg/L 6‑BA+0.1‑0.2mg/L NAA +2.5g/L植物凝胶；（3）待不定芽长至0.5~1.2cm，将其侧芽切下，置于继代培养基上培养获得再生苗。上述方法获得的组培苗离体叶片为无菌叶片，可用于病菌致病性测定，不受季节限制，保障了试验结果成功率和准确性。

Description

一种砂梨叶片高效再生体系的建立方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术及植物病害领域，具体涉及砂梨叶片高效再生体系的建立方法，还涉及组培苗离体叶片在病菌致病性评价方面的应用。

背景技术

砂梨(Pyrus pyrifolia)是我国南方广泛种植的重要落叶果树，梨生长不同周期均会受到的不同病害危害，如近年来发生普遍且严重的梨炭疽、梨黑斑叶部病害、梨轮纹枝干病害，不但影响梨品质和产量，还可导致梨树死亡、甚至毁园，给果农及梨产业带来严重的经济损失【田世平和范青，控制果蔬采后病害的生物学技术，植物学通报，2000，17(3)：211-217】。梨轮纹病在我国梨产区分布广泛，是我国梨树的重要病害之一。该病主要为害梨树枝干、果实和叶片，枝干受害可促使树枝早衰，叶片受害会引起叶片早落，果实受害能造成大量烂果，严重影响产量和品质【田路明,周宗山,董星光,曹玉芬,张莹.梨轮纹病研究进展[J].中国果树,2013(04):74-77】。梨黑斑病和梨炭疽病是危害梨树叶片的主要病害，病原菌可侵染幼嫩叶片、新梢以及幼果，发病严重时会导致梨树落叶，严重影响果品产量【王宏，常有宏，陈志谊.梨黑斑病病原菌生物学特性研究.果树学报，2006，23(2):247-25；沈静霆.砀山酥梨炭疽病菌生物学特性及有效药剂筛选[D].安徽农业大学,2012】。另外，梨树通常复合感染多种病毒，主要是苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)，不仅削弱树势,导致产量和果实品质下降，严重限制我国梨的生产【邓晓云,王国平.梨病毒病研究新进展[J].果树学报,2002(05):321-325】。为了防治梨树病毒病并获得高品质的梨，常采用梨树无毒化栽培模式，通过茎尖及热处理等不同方式获得无毒材料【洪霓,王国平,张尊平,董雅凤,薛光荣.梨病毒脱除技术研究[J].中国果树,1995(04):5-7】。除以上梨感染病害因素外，梨树品种退化问题也是阻碍梨产业快速发展的一个重要因素。

筛选抗病、抗逆基因，将药物高效用于植物病害防控实践应用中，是防治梨病害的根本途径，可提高果品产量和品质【王苏珂,李秀根,杨健,王龙,薛华柏,苏艳丽,王磊.我国梨品种选育研究近20年来的回顾与展望[J].果树学报,2016,33(S1):10-23】。梨树生长周期长，通过转基因技术转入目的基因，获得转基因植株，植株的抗逆性、抗病性以及生长长势、果品质量将会有效提升。开展梨组培遗传转化研究是筛选并探究梨基因在抗病育种中的功能作用的主要途径。建立不同品种梨树叶片离体高效再生体系是梨遗传转化的关键环节，同时也是进行离体植株快速繁殖的有效途径。建立梨叶片再生培养为工厂化育苗，建立无性快繁提供依据和材料，是进一步实现梨的无毒化栽培和提高梨的果品质量的有效途径。因此，高效不同品种梨离体叶片再生体系的建立旨在为解决梨品种退化以及病害干扰，建立梨品种的种质创新的绿色产业健康发展均提供有效的解决途径。

影响梨遗传转化以及用于转基因抗病育种研究的重要的因素之一就是获得该品种的高再生率。目前梨普遍存在再生困难，转化效率低等问题。已有研究来看，关于梨离体培养的研究大多数是西洋梨品种，如康弗伦斯【Leblay C.,Adventitious shootregeneration from in vitro leaves of several pear cultivars(Pyrus communisL).Plant Cell Tissue and Organ Culture,1991,25:99-105】；少量白梨品种如大鸭梨、雪花梨的叶片再生成功也有报道【孙清荣，樊圣华，刘庆忠.大鸭梨叶片高频率不定梢再生诱导研究[J].山东农业科学，2003，2:10-12；闫允青，姜桦韬，谷超，吴俊.雪花梨扩繁和叶片再生体系的建立[J].南京农业大学学报，2017，40(1):68－75】。在我国南方种植广泛、深受老百姓喜爱的的砂梨品种的再生研究报道较少，已有的报道均表明，砂梨再生率存在困难且获得的少数品种均显示再生率极低【刘翠琼，汤浩茹.梨叶片培养与转基因研究进展[J].果树学报，2003，20(5)374-378；李海，乔玉山，李志强，伶兆国，章镇.明水梨叶片不定芽再生体系的建立[J].江西农业学报，2009，21(4):42-44；孙清荣.金花梨叶片不定梢诱导研究[J].落叶果树，2000，3:8-10】。因此，根据产业需求，对砂梨‘金水二号’等传统品种的种质进行改良势在必行。前期本研究团队对感染苹果茎沟病毒(ASGV)的砂梨‘金水二号’叶片再生进行了初步探究，发现该品种再生率低，为0.06％，初步明确了病毒对砂梨叶片再生有一定的影响。本发明以无毒砂梨品种‘金水二号’为研究材料，系统研究不同培养因素结合生长激素组合及配比对其叶片再生扩繁体系的影响，明确和优化影响其叶片再生因子，获得了较高的不定芽再生率，建立了砂梨组培苗的高效扩繁体系，还可适用于其它砂梨品种，如黄花、翠冠、圆黄、丰水等。梨树是落叶果树，受季节性影响明显，建立室内快速致病力测定对病害防治至关重要；探究了以砂梨再生叶片作为材料，建立了快速、简便、灵敏的高通量的室内鉴定病原致病性测定方法，为梨病害防治提供重要理论依据和技术支撑。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种砂梨叶片再生体系建立的方法，以无毒离体叶片为材料，建立了砂梨组培苗的高效扩繁体系，获得了较高的不定芽再生率。

本发明的另一个目的是在于提供了砂梨组培苗离体叶片在病菌致病性评价方面的应用，利用组培苗离体叶片进行室内病菌致病性测定不受季节限制，获取材料简易、高效、成本低，组培苗为无菌叶片，接种前无需消毒处理等繁琐步骤且不易污染，保障了试验结果成功率和准确性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

砂梨叶片高效再生体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)外植体材料的获得：取砂梨的带芽枝条进行消毒，无菌条件下切取带叶芽的茎尖接种于继代培养基上生长，暗培养7-10d后光照培养获得无菌的离体植株；再选取培养20-30d的未感染苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus)的离体植株(无污染、无玻璃化、长势好且强壮)中、上部已伸展开的叶片，无菌条件下切成小块叶片作为诱导生芽的外植体材料；

(2)分化及再生培养：将外植体叶片接种于再生培养基中暗处理14d～30d后再转至光下培养，产生不定芽；所述的再生培养基以NN69营养液为基础，再添加3-5mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA+2.5g/L植物凝胶；

(3)不定芽继代培养扩繁：待不定芽长至0.5～1.2cm，将其侧芽切下，置于继代培养基上培养获得再生苗；

所述的继代培养基为MS培养基+0.2mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂。

所述的砂梨叶片高效再生体系的建立方法，适用于砂梨的不同品种，比如金水二号、黄花，翠冠，圆黄，丰水等。

进一步地，步骤(1)中带芽枝条的消毒方法为：在超净工作台中用无菌水冲洗芽2-3遍，70％酒精消毒30s-1min，无菌水冲洗3-4次；0.1％HgC1₂浸泡5-10min，无菌水冲洗3-4次，置无菌滤纸吸干。

进一步地，步骤(2)中再生培养基为NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+2.5g/L植物凝胶，pH为5.8-6.0。

进一步地，步骤(2)中外植体叶片的培养装置为三角瓶。

进一步地，上述方法中的砂梨品种优选金水二号。

砂梨组培苗离体叶片在检测植物病菌致病力测定中的应用，其方法为：将活化的致病菌菌丝块接种于组培苗离体叶片的伤口部位(针刺形成)，于MS继代培养基中暗培养，观察叶片的发病情况并测定病斑扩展长度，以评价其致病力。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1.梨茎尖组织培养产生侧芽的方式进行增殖扩繁获得再生材料存在周期长、扩繁速度慢等缺陷，经过几代室内繁殖，存在增殖率降低等瓶颈问题。本发明选择使用砂梨‘金水二号’品种作为研究对象，首次获得砂梨‘金水二号’叶片的高效、简便的再生体系，有效的克服了梨增殖培养方式扩繁材料滞后的缺陷，同样适用于其它砂梨品种，比如黄花，翠冠，圆黄，丰水等，足以满足品种种质资源保存以及建立快速、高效的砂梨遗传转化体系所需材料对叶片再生率的要求。

2.砂梨叶片再生研究较少，且存在再生困难及再生率低等问题。最适基本培养基的选择与基因型和外植体类型相关，本研究发现基本培养基为NN69，细胞分裂素和生长素不同组合，以及植物凝胶(Phytagel)对砂梨‘金水二号’品种叶片再生具有显著的影响；明确了无毒砂梨再生诱导最适培养基为NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.5g/L植物凝胶(Phytagel)，pH为5.8-6.0，叶片再生率可达到66％，再生芽数3个左右；取得的研究结果为提高其他砂梨不同品种的再生率提供重要的参考依据和技术支撑。

3.梨叶片再生主要用于生根及其稳定遗传转化，而无作为常规的候选材料用于病原菌致病性测定方面研究的报道；本发明以梨组培苗再生叶片为接种材料，通过对引起梨主要病害的炭疽菌、黑斑菌、轮纹菌等进行致病性测定，操作简单，成本较低，获取材料不受季节影响，高效、快速、简易且不受叶片品种和叶龄要求。

附图说明

图1砂梨‘金水二号’离体叶片产生过程及其再生植株长势情况。

A-选取上部舒展叶片，垂直叶脉横切作为诱导生芽的外植体材料；B-暗处理21d后的叶块，伤口部分产生愈伤组织，叶块膨大；C-光下培养12d产生最早不定芽；D-不定芽继代于MS扩繁培养基生长30d。

图2不同基本培养基下砂梨‘金水二号’再生植株光下诱导分化培养60d生长情况；A1、A、B、C、D和E分别对应表1中培养基类型编号为2、6、7、8、9和10。

图3NN6基本培养基与不同激素组合下砂梨‘金水二号’再生植株光下初代培养50d生长情况；A、B、C、D、E和F分别对应表2中培养基类型编号为1、2、3、4、5和6。

图4含植物凝胶(Phytagel)再生培养基的三角瓶(I)和培养皿(II)装置培养条件下‘金水二号’离体叶片再生不定芽生长情况。

A1和A2分别为三角瓶和培养皿中暗培养21d；B1和B2分别为三角瓶和培养皿中转至光下12d产生最早不定芽；C1和C2分别为三角瓶和培养皿中转至光下40d产生不定芽；D1为C1植株从三角瓶移出放置培养皿中所拍图片。

图5梨炭疽(Colletotrichum gloeosporioides)菌株接种砂梨‘金水二号’组培苗再生叶片不同叶龄(嫩叶和老叶)于25℃，装有灭菌的MS培养基三角瓶里分别培养1d、2d和3d的发病情况及其病斑扩展长度测定。

A和C分别为FJ-85和FJ-11-2分离株接种‘金水二号’组培苗嫩叶1d和2d病斑扩展情况及其测定的病斑长度；B和D分别为FJ-85和FJ-11-2接种‘金水二号’组培苗老叶2d和3d病斑扩展情况及其测定的病斑长度，CK-均表示PDA菌丝块接种叶片，作为阴性对照。

图6梨黑斑病菌株(Alternaria alternate)接种砂梨‘金水二号’和‘康弗伦斯’(命名为kf)组培苗叶片于25℃不同时间发病情况及其病斑扩展长度测定。

A和B分别为CQCZ、SCFS菌株接种‘金水二号’组培苗嫩叶1d、2d病斑扩展情况及其病斑长度；C和D分别为CQCZ、SCFS菌株接种‘康弗伦斯’组培苗生根叶片2d、3d病斑扩展情况及其测定的病斑长度；CK-表示PDA菌丝块接种，作为阴性对照。

图7梨轮纹(Botryospheria dothidea)HBWH-13分离株接种‘黄花’组培苗叶片于25℃、2d发病症状观察结果。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1高效、快速的砂梨叶片再生体系的建立

砂梨叶片再生体系建立的方法，包括获取无毒组培苗叶片、诱导产生不定芽、不定芽的初代培养和继代培养扩繁等步骤，本实施例以砂梨‘金水二号’品种为例，具体操作过程如下：

1)外植体材料的获得

选取湖北省农科院果树茶叶研究所国家砂梨种质资源圃采集的砂梨‘金水二号’带芽枝条样品，先参照刘文斌报道的方法[刘文斌.梨病毒超低温脱除技术的改进及带病毒与脱毒梨离体植株生长特性比较[D].华中农业大学,2014]进行消毒，再采用分子RT-PCR(参见[刘娟.热处理对沙梨离体植株体内microRNAs和来源于ASGV的vsiRNAs的影响[D].华中农业大学,2015])检测获得不感染苹果茎沟病毒(Apple stemm grooving virus,ASGV)的无毒植株，培养无菌无毒的茎尖获得离体试管苗，保存多次继代培养组培苗叶片作为外植体材料来源。具体方法如下：

带芽枝条样品经自来水冲洗，取下休眠芽，在超净工作台中用无菌水冲洗芽2-3遍，70％酒精消毒30s-1min，无菌水冲洗3-4次；0.1％HgC1₂浸泡5-10min，无菌水冲洗3-4次，置无菌滤纸吸干，剥离鳞片，于解剖镜下切取带1-2片带叶芽的5mm左右的茎尖，接种于MS继代培养基上；暗培养7-10d，光照培养室(25±1℃)培养观察记录污染及生长情况，成活植株继代获得无菌的离体植株。

所述的MS继代培养基为MS培养基+0.2mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.8-6.0。

将上述无菌的离体植株经RT-PCR鉴定获得不感染ASGV的无毒植株作为材料，对其进行扩繁、保存待用。鉴定方法如下：采用CTAB法提取叶片总RNA作为模板，随机引物进行反转录，获得cDNA；以ASGV cp引物进行PCR，电泳检测样品是否感染ASGV。

选取20-30d的无菌且不感染ASGV的离体植株(无污染、无玻璃化、长势好且强壮)上部已伸展开的叶片，于超净工作台内在灭菌滤纸上垂直于叶片主脉横切1-2刀，切成约0.3～0.8cm²大小的2-3小块(切掉叶尖端和叶柄部分)作为诱导生芽的外植体材料。

2)适用于叶片再生基本培养基的筛选

以MS和NN69为基本培养基进行筛选，分别设置6-BA/NAA与TDZ/IBA 2种组合各自细胞分裂素和生长素的浓度比例，共10个处理，每个处理接种6～8瓶，每瓶接种‘金水二号’5块叶片作为外植体。将叶片正面朝上接种于不定芽再生培养基，于25±1℃条件下，暗处理21d左右，暗培养结束后转至光周期(16h/8h)，光照强度2000-40001x、温度(25±1℃)下培养20d、40d、60d，分别统计褐化、污染情况，观察叶片产生外植体愈伤组织、不定芽的产生情况，具体记录叶片生芽率数据。

结果表明，以MS为基本培养基，添加6-BA/NAA与TDZ/IBA不同浓度组合中，只有添加1mg/L TDZ和0.5mg/L IBA组合类型在光下培养20d、40d和60d均只长出1个再生芽，发芽率为2.9％(1/35)；其他以MS为基本培养基添加不同激素的4种组合，叶片均无再生芽产生(表1)。以NN69为基本培养基，6-BA/NAA与TDZ/IBA组合，共设置的5种浓度比例，叶片均有再生芽产生；随光下培养时间加长，叶片再生不定芽频率和产生不定芽数量均随之上升。其中NN69+(5mg/L)6-BA+(0.5mg/L)NAA组合，叶片生芽率最高，在光下培养40d时，生芽率为50％，增加至60d时，生芽率达到最大为92.5％。培养基为NN69+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L IBA+5.5g/L琼脂，pH为5.8-6.0，在光下培养40d和60d，再生率分别为62.9％和82.9％(表1和图2)。由此结果可知，NN69较MS组合不同浓度和种类的激素配制的培养基更适合作为砂梨‘金水二号’叶片高频率再生芽的诱导。

表1不同基本培养基对‘金水二号’叶片再生的影响

注：生芽率＝再生芽总数/接种叶片数

上述步骤中的MS和NN69培养基所需营养液组分及配比如下：

配制1L NN69营养液：大量元素母液(20×，50mL)，微量元素母液(100×，10mL)，极微量元素(2000×，500μl)，维生素(1000×，1mL)，肌醇(100×，10mL)，甘氨酸(100×，10mL)，Fe盐(100×，10mL)，叶酸(5mg)，蔗糖(20g)。

配制1L MS营养液：大量元素母液(20×，50mL)，微量元素母液(100×，10mL)，Vc(100×，10mL),Vb(100×，10mL)，肌醇(100×，10mL)，甘氨酸(100×，10mL)，Fe盐(100×，10mL)。

A.NN69各母液配方如下：

配制1L 20×大量元素需KN0₃(19g)，NH₄N0₃(14.4g)，MgS0₄·7H₂O(3.7g)，CaCl₂(2.57g)；配制1L 100X微量元素需KH₂PO₄(6.8g)，MnSO₄·4H₂O(2.5g)，H₃BO₃(1g)，ZnSO₄·7H₂O(1g)；配制100ml 2000×极微量元素需CuSO₄·5H₂O(0.005g)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.05g)；配制100ml 1000×维生素需D-生物素(0.005g)，维生素B₁(0.05g)，烟酸(0.5g)，维生素B₆(0.05g)；配制1L 100×甘氨酸需甘氨酸(0.2g)；配制1L的100×肌醇需肌醇(10g)；配制1L的100×Fe盐需EDTA(3.73g)，FeSO₄(2.78g)。

B.MS各母液配方如下：

配制1L 20×大量元素需KN0₃(38g)，NH₄N0₃(33g)，MgS0₄·7H₂0(7.4g)，CaCl₂(6.8g)；配制1L 100×的微量元素需KI(0.83g)，ZnS0₄·7H₂O(0.86g)，KH₂P0₄(0.62g)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.025g)，CuSO₄·5H₂O(0.0025g)，CoCl₂·6H₂O(0.0025g)，MnSO·4H₂0(1.69g)；配制1L 100×的维生素B需维生素B₁(0.01g)，维生素B₆(0.05g)，维生素B₅(0.05g)；配制1L 100×的维生素C需抗坏血酸(1g)；另外，甘氨酸、铁盐、肌醇母液所需成分配方同NN69；以上溶液配制均需依次称量所需样品，将其分别溶解至所需体积。

3)生长激素浓度配比的筛选

以NN69为基本培养基，添加设置不同植物生长调节剂配比及其浓度(6-BA/NAA和TDZ/NAA)，共10个不同处理；将‘金水二号’离体叶片在暗培养结束后转至光周期(16h/8h)下培养，分别观察外植体愈伤组织和不定芽产生情况，选取了记录培养45d时叶片再生植株生芽率数据；明确‘金水二号’叶片再生诱导的最适生长调节剂配比。综合以上数据，将不定芽产生速度快、再生芽数量多、长势好的外植体对应培养基及生长方式作为‘金水二号’砂梨再生不定芽培养体系(表2和图3)。

添加生长激素6-BA/NAA组合，6个处理单块叶片再生芽数无显著差异，约为2个左右，显著高于添加TDZ/NAA的单块叶片再生芽数约为1个。在添加6-BA/NAA的6个处理内，2号(NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)培养基再生频率最高，达到60％，平均每叶再生芽数为2个左右，褐化率为0；其次是4号组合NN69+4mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养基再生频率约为50％，平均每叶再生芽数为2.1个，褐化率为0(表2)。

由此结果可知，诱导其分化出较高频率不定芽的‘金水二号’叶片再生培养基优选6-BA/NAA的生长激素组合，最适培养基为NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+5.5g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。

表2不同生长调节剂配比对‘金水二号’叶片再生的影响

注：叶片再生频率＝可再生叶片数/接种叶片总数；单块叶片再生芽数＝再生芽数/可再生叶片数。

4)影响叶片再生不定芽的其他因素

根据以上明确的叶片再生方法，将培养叶龄为20～30d‘金水二号’离体叶片按上述方式处理后分别于放置于装有10ml再生培养基的培养皿(直径约9cm)和40ml三角瓶中进行暗培养，21d后移至光下培养进行不定芽生长观察；除琼脂更换为植物凝胶(Phytagel)外，所用再生培养基成份同上。结果表明，三角瓶中光下培养叶片至40d，再生频率提升为65％(21/32)，再生叶片芽数也提高到3个左右；培养皿中培养，叶片再生频率为69％(29/42)，再生叶片芽数为2个左右。随培养时间延长，三角瓶中培养的叶片再生芽数增长速度快于培养皿(表3和图4)。

结合以上结果，诱导‘金水二号’叶片分化出较高频率不定芽的最优培养基配方为NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.5g/L植物凝胶(Phytagel)，pH为5.8-6.0；培养装置为三角瓶。

表3‘金水二号’叶片再生率和再生芽数统计

5)离体叶片分化及再生培养

将叶块正面朝上接种于含有不定芽再生培养基(NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+2.5g/L植物凝胶)的100ml的带有封口膜的三角瓶中，于25±1℃条件下，暗处理21d左右再转至光周期为16h/8h，光照强度2000-40001x，25±1℃下培养。如图1所示，接种叶片暗培养10d左右，叶块开始膨大、变黄，伤口处产生少量愈伤，随着暗培养时间增加，叶片开始有些许膨大、褶皱，愈伤组织逐渐增多；暗培养至21d转至光下培养，愈伤组织逐渐变成黄绿色，愈伤组织继续分化，会出现黄绿色芽点，且形成的不定芽大多是从近中脉、中脉的伤口处有愈伤组织的地方产生，也有少数不定芽直接从叶片组织和叶片基部产生；置于光下培养12d后，产生最早再生芽，随培养时间加长，叶片再生频率和不定芽数量会随之不断增加。

6)不定芽继代培养扩繁

待不定芽长至0.5-1.2cm左右，将其侧芽切下，置于继代培养基上培养，结果表明，不定芽继代培养过程中，再生苗易成活，成活率为100％。所述的继代培养基为之前课题组常规用作不同梨品种的增殖继代培养基，配方为MS+0.2mg/LIBA+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.8-6.0；高压蒸汽灭菌15min备用。

砂梨不同品种(翠冠、黄金、桂冠、雪青等)再生研究结果显示【曹霞，柴明良.砂梨叶片再生不定梢的研究[J].果树学报，2005，22(5)557-560；尹婷.砂梨离体再生体系的建立及转chit42基因的研究[D]，湖南农业大学，2008】，再生频率均低于25％，发现叶片再生所用基本培养基均为MS，推测可能是影响砂梨再生率低的主要因素。本研究初次发现以NN69为基本培养基，6-BA和NAA组合对砂梨品种‘金水二号’叶片再生率达到60％，可为提高其他砂梨品种的再生体系探索提供参考，如黄花，翠冠，圆黄，丰水等品种，由此解决砂梨再生率普遍较低的问题。

实施例2砂梨再生叶片用于检测炭疽菌致病力

1)最适组培苗叶片的选取：选择生长一致的砂梨‘金水二号’再生试管苗继代培养20d左右的幼嫩且完全展开、长势好且一致的叶片作接种材料；同时也设置了老叶(60d)作为接种材料。

2)接种方法的确定：每个叶片分别针刺接种PDA上培养、活化的新鲜待测病菌小菌丝块(约1mm左右)，以空白PDA作为阴性对照；将以上接种叶片放置于装有MS培养基的无菌三角瓶中，每个菌株至少6个以上重复，接种材料为本实验室已从福建省翠冠品种上分离、保存获得的菌株FJ-85和FJ-11-2，鉴定为果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)，测定其致病力；记录污染情况，观察并测量其每个菌株分别在嫩叶(25d)和老叶(2个月)在再生叶片上的病斑扩展长度。

3)致病力的计算方法：叶片病斑扩展长度(mm)＝记录当天病斑直径/2。数据分析用SPSS(19)Duncan法作显著性检验，后用Excel 2003作图，明确其菌株的致病力。

结果表明，炭疽菌株FJ-85和FJ-11-2在接种叶片培养过程中均无杂菌的污染，分离株FJ-85和FJ-11-2接种‘金水二号’嫩叶1d时，叶片均发病，分别产生约为4cm和7cm大小的病斑；接种2d时，病斑大小分别扩展到约8cm和10cm(图5A和C)。对比接种离体老叶片，FJ-85和FJ-11-2接种2d才开始产生病斑，其大小均比接种嫩叶产生的病斑小；接种3d，FJ-85呈轮纹状病斑，大小约为9cm；FJ-11-2病斑大小为10cm(图5B和D)。以上结果揭示，FJ-85和FJ-11-2均为强致病力菌株，致病力存在差异，接种老叶和嫩叶FJ-11-2致病性均强于FJ-85菌株；接种嫩叶易被病菌侵染，炭疽病菌分离株易发病，发病速度快。

因此，无菌组培苗离体再生叶片的室内接种可以评价并区分炭疽菌菌株致病力差异，其发病情况与寄主叶龄有一定的相关性。

实施例3砂梨再生叶片用于检测梨轮纹菌、黑斑病菌的致病力

参照上述建立的室内病菌接种离体叶片测定致病力的方法：

1)黑斑病菌接种梨不同品种离体叶片

操作同实施例2，分别将实验室保存的2个黑斑病菌CQCZ(采集自重庆茨竹，从新高梨品种上分离获得)和SCFS(采集自四川省，从丰水梨上分离获得)分离株进行活化，取其在PDA上活化好的新鲜菌丝块分别针刺接种试管苗继代培养‘金水二号’约30d左右的幼嫩叶片及‘康弗伦斯’生根叶片(选取继代培养30d的生长健壮的离体植株，切1.5cm茎尖继代于‘康弗伦斯’生根培养基，待60d后生根叶片备用)。一个叶片接种一个菌丝块，放置于装有MS培养基的无菌三角瓶中，每个菌株至少3个以上重复，在25℃条件下培养，观察并测定其病斑扩展长度。结果表明：CQCZ和SCFS菌株接种不同品种‘金水二号’和‘康弗伦斯’叶片的致病性存在差异；SCFS菌株致病力较弱，CQCZ菌株致病性较强。不同品种离体叶片接种同一菌株，致病性也存在一定差异，接种‘康弗伦斯’生根老叶片2d才开始发病，3d病斑扩展长度与接种‘金水二号’1d发病程度相当(图6)。

‘康弗伦斯’生根培养基的配方为：1/2MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂。培养基配方参照报道【Chen J.,et al.Effects of virus infection onplant growth,root development and phytohormone levels in in vitro-culturedpear plants[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2017,131(2):359-368】。

1/2MS配方：仅大量元素减半，其他成分和用量同MS基本培养基。

2)轮纹病菌接种‘黄花’离体叶片

操作同实施例2；将梨轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)HBWH-13分离株接种‘黄花’叶龄约为30d左右，接种2d，病斑症状观察结果表明，HBWH-13在叶片上均为轮纹状病斑，表明砂梨其他品种也可有效用于梨病原菌室内致病力测定(图6)。

砂梨的再生叶片作为检测病菌致病力的材料具有无菌、来源简单且高效的优点；致病性测定显示出再生叶片叶龄、品种等不同，接种病菌致病力存在相关差异，灵敏的反映出病菌与寄主的互作关系，因此，再生叶片也是研究病菌与梨寄主互作关系的优先试验材料；另外，再生叶片还可用于梨感染的其他不同病菌，如梨黑星、褐斑病菌等。

Claims (6)

1.砂梨叶片高效再生体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体材料的获得：取砂梨的带芽枝条进行消毒，无菌条件下切取带叶芽的茎尖接种于继代培养基上生长，暗培养7-10d后光照培养获得无菌的离体植株；再选取培养20-30d的未感染苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus）的离体植株中、上部已伸展开的叶片，无菌条件下切成小块叶片作为诱导生芽的外植体材料；

（2）分化及再生培养：将外植体叶片接种于再生培养基中暗处理14d~30d后再转至光下培养，产生不定芽；所述的再生培养基以NN69营养液为基础，再添加3-5mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA +2.5g/L植物凝胶；

（3）不定芽继代培养扩繁：待不定芽长至0.5~1.2cm，将其侧芽切下，置于继代培养基上培养获得再生苗；

所述的继代培养基为MS培养基+0.2mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的砂梨叶片高效再生体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中带芽枝条的消毒方法为：在超净工作台中用无菌水冲洗芽2-3遍，70%酒精消毒30s-1min，无菌水冲洗3-4次；0.1% HgC1₂浸泡5-10min，无菌水冲洗3-4次，置无菌滤纸吸干。

3.根据权利要求1所述的砂梨叶片高效再生体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中再生培养基为：NN69+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.5g/L植物凝胶，pH为5.8-6.0。

4.根据权利要求1所述的砂梨叶片高效再生体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中外植体叶片的培养装置为三角瓶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的砂梨叶片高效再生体系的建立方法，其特征在于，所述的砂梨品种为金水二号。

6.砂梨组培苗离体叶片在测定植物病菌致病力中的应用。