CN111727882B

CN111727882B - 一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法

Info

Publication number: CN111727882B
Application number: CN202010575884.9A
Authority: CN
Inventors: 石雷; 王頔; 杜雪
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111727882A

Abstract

本发明提供一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，包括如下步骤：1)以茎尖为外植体，进行初代培养以获得无菌苗；2)切取无菌苗的带芽茎段接种于愈伤组织诱导培养基，所述愈伤诱导培养基含有50～250mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。本发明提供的方法可以提高椒样薄荷愈伤组织诱导率，缩短诱导周期，同时得到的愈伤组织质量好，无褐化现象，能够快速分化出不定芽。促进愈伤组织发生和生长的MWCNTs浓度范围应控制在50～250mg/L，优选浓度为100mg/L，在该浓度下椒样薄荷愈伤组织诱导率可达100％，愈伤组织鲜重可比对照提高93％。

Description

一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种促进椒样薄荷(Mentha×piperitaL.)愈伤组织诱导的方法。

背景技术

椒样薄荷(Mentha×piperita L.)是唇形科薄荷属的多年生草本植物，椒样薄荷精油清香凉爽，具有刺激大脑、振奋精神和提升注意力、缓解刺激和瘙痒和改善消化系统等功能，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，因此具有较高的经济价值。椒样薄荷由绿薄荷(Mentha spicata)与水薄荷(Mentha aquatica)杂交而成的一个不育性中间类型。长期以来主要以扦插、分株等方式进行繁殖，这种传统的繁殖方式容易使植物感染病毒，从而引起品种的退化和产量、质量的下降。近年来，薄荷油市场的需求不断扩大，而栽培面积却逐年递减，使得薄荷油价格正逐步上升。

组织培养因具有不受环境、时间等外界因素的影响和高效等特点，被广泛的运用于植物的规模化生产和科学研究中，在组织培养体系中诱导愈伤组织是实现快速繁殖的重要手段，愈伤组织也可以作为细胞悬浮培养生产次生代谢产物的原材料，此外愈伤组织还是诱变育种的常用材料。通过组培快繁的方式进行脱毒复壮，是在短期内获得大量的无菌苗、满足日益增长的椒样薄荷精油市场的有效方法。目前椒样薄荷的组织培养方法已有一些报道，《椒样薄荷的组织培养研究》(王小敏等，2007)以茎尖作为外植体通过诱导不定芽建立了椒样薄荷的组织培养体系，《椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变》(胡燕梅等，2018)报道了基本培养基、植物生长调节剂组合及抗褐变剂对椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变的影响。CN102630564A《一种耐盐薄荷的组培快繁方法》公布了一种以耐盐椒样薄荷的茎段为外植体诱导愈伤组织、不定芽增殖、生根，最后驯化移栽的组培快繁方法。

近年来，碳纳米管在植物生物学上的应用是目前纳米生物学研究的前沿课题之一。已有一些研究表明，碳纳米管可以促进植物愈伤组织的诱导，认为纳米材料穿透细胞壁，带动植物生长调节剂，加速脱分化和愈伤的形成。碳纳米管在植物组织培养领域的应用近年来已有一些报道，如专利《一种早梨愈伤组织诱导和分化的方法》、《一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法》、《一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基及其应用》等，均为在组织培养体系的某个或某些环节中加入一定浓度的碳纳米材料，进而提高组培效率。

愈伤诱导是椒样薄荷能在短期内获得大量无菌苗的关键环节，但由于薄荷组织中存在大量的酚类物质，容易使诱导出的愈伤产生褐变，诱导得到的愈伤组织体积较小，诱导周期较长，不同激素配比下的诱导效果差异大。《椒样薄荷的组织培养研究》(王小敏等，2007)建立的组织培养体系为通过诱导不定芽途径，该体系仅产生少量愈伤组织或产生的愈伤组织不能分化形成不定芽，且该研究发现以叶片为外植体建立再生体系比较困难。《椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变》(胡燕梅等，2018)报道了基本培养基、植物生长调节剂组合及抗褐变剂对椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变的影响，然而该文献得到的愈伤组织可能适用于细胞悬浮培养生产次生代谢产物，但不合适应用于脱毒复壮和诱变育种。CN102630564A《一种耐盐薄荷的组培快繁方法》公布的方法并没有公开能从愈伤组织分化出不定芽。根据该专利所公开的内容，薄荷植株去叶留茎和芽点，截取3cm的茎段，所述的不定芽是茎段中芽点萌发增殖而成，并非愈伤组织分化出的不定芽。而芽点萌发与愈伤组织分化的不定芽形态建成完全不同。

纳米材料在植物组织培养中的作用已有一些研究，其应用于外植体的消毒灭菌、初代培养、愈伤诱导与增殖、生根炼苗等环节均已有报道，然而，纳米材料在植物生物学上的应用仍处于探索阶段，纳米材料的作用效果因其种类、形状以及作用浓度和时间各有差异，加之我们对其潜在影响的了解并不深入，导致应用纳米材料促进植物愈伤组织增殖的方法报道较少。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法。

本发明提供的一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法包括如下步骤：

1)以茎尖为外植体，进行初代培养以获得无菌苗；

2)切取无菌苗的带芽茎段接种于愈伤组织诱导培养基，所述愈伤诱导培养基含有50～250mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。

其中，所述的初代培养的培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。

其中，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L TDZ。

其中，外植体表面灭菌的方法为：取椒样薄荷0.5～1cm茎尖为外植体，用洗涤剂漂洗5～10分钟，自来水冲洗30分钟，滤干后转至超净工作台。然后用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞浸泡8～10分钟，无菌水冲洗3～5次。

其中，培养室条件为：温度25±1℃，光照强度为50～60μmoL/(m²·s)，光周期为16/8h，湿度为30％。

本发明提供的方法可以提高椒样薄荷愈伤组织诱导率，缩短诱导周期，同时得到的愈伤组织质量好，能够快速分化出不定芽。促进愈伤组织发生和生长的MWCNTs浓度范围应控制在50～250mg/L，优选浓度为100mg/L，在该浓度下椒样薄荷愈伤组织诱导率可达100％，愈伤组织鲜重可比对照提高93％。本发明可应用于椒样薄荷种苗的脱毒复壮和规模化生产，还可用于通过诱变育种对椒样薄荷进行品种改良及其它相关科学研究。同时，本发明可为多壁碳纳米管在生产实践中的应用提供技术支持。

附图说明

图1所示为椒样薄荷茎段在MS+1.0TDZ中25天的愈伤组织褐化情况。

图2所示为椒样薄荷茎段在MS+1.0TDZ+100MWCNTs中25天的正常绿色愈伤组织。

图3所示不同浓度MWCNTs对椒样薄荷愈伤组织的诱导效果。

图4所示为MS+1.5TDZ+100MWCNTs中椒样薄荷愈伤组织分化的不定芽。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取椒样薄荷0.5～1cm茎尖为外植体，用洗涤剂漂洗5～10分钟，自来水冲洗30分钟，滤干后转至超净工作台。然后用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞浸泡8～10分钟，无菌水冲洗3～5次。然后接种于MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA培养基，进行初代培养以获得无菌苗，培养周期为15天。培养基基本成分：以MS作为基本培养基，添加3％蔗糖和0.7％琼脂，高压灭菌前调pH值为5.8～5.9。

椒样薄荷无菌苗茎段接种至MS+TDZ 1.0mg/L、MS+TDZ 1.5mg/L培养基中，诱导愈伤组织，20天后，愈伤组织诱导率分别为70％、80％，MS+TDZ 1.5mg/L愈伤诱导效果优于MS+TDZ 1.0mg/L，培养基MS+TDZ 1.0mg/L的愈伤组织25天即已褐化至死亡，不能诱导出不定芽(图1)。

在MS+TDZ 1.0mg/L中添加100mg/L MWCNTs，愈伤组织诱导率虽未明显增加，但是愈伤组织体积增大，愈伤褐化现象明显改善(图2)，并且愈伤组织能正常诱导出不定芽。结果表明，添加MWCNTs可以显著抑制椒样薄荷愈伤组织的褐化。

实施例2

将MWCNTs匀浆在40kHz的超声波清洗仪中超声30分钟，得到MWCNTs悬浮液在超净工作台下进行无菌过滤，将得到的无菌悬浮液母液用无菌水稀释，配制成一定浓度的悬浮液。

愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L TDZ，将MWCNTs悬浮液加入高温高压灭菌后但尚未凝固的诱导培养基中混匀，待充分凝固冷却，使培养基中所含的MWCNTs分别为0、50、100、150、200、250、500、1000mg/L。然后切取无菌苗的带芽茎段接种于该培养基中进行愈伤组织诱导，每个培养瓶中接种4个茎段，设置4个重复。培养室温度为25±1℃，光照强度为50～60μmoL/(m²·s)，光周期为16/8h，湿度为30％。

定期观察愈伤组织长势，记录产生愈伤组织的外植体个数，计算愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)×100％；培养25天后，将茎段连同愈伤组织取出，用无菌水洗去粘附的培养基，用滤纸吸干水分后，使用分析天平秤量每个培养瓶中产生的愈伤组织的鲜重。

不同浓度的MWCNTs对椒样薄荷愈伤组织诱导的影响如表1和图3所示。

表1不同浓度MWCNTs对椒样薄荷愈伤组织诱导的影响

经SPSS分析，50-250mg/L MWCNTs处理后椒样薄荷愈伤组织诱导率与对照相比无显著差异，但愈伤鲜重显著提高。而500mg/LMWCNTs处理后椒样薄荷愈伤组织诱导率与对照相比无显著差异，但愈伤鲜重显著降低。1000mg/L MWCNTs处理后椒样薄荷愈伤组织诱导率和愈伤鲜重均显著降低。

添加了100mg/L MWCNTs的培养基中，愈伤组织可逐渐分化出芽(图4)，500mg/LMWCNTs以下的培养基都能分化出芽。图3是接种后第25天的状态，图4是第33天时的状态，不定芽陆续形成的，在第45－50天后可以进行切分，和CN102630564A公开的方法相比，无需中间的转接步骤，出芽速度更快。不同MWCNTs浓度下不定芽状态无显著差异，不定芽数量和愈伤体积大小有直接关系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以茎尖为外植体，进行初代培养以获得无菌苗；2)切取无菌苗的带芽茎段接种于愈伤组织诱导培养基，所述的初代培养的培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L TDZ+ 50～250mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。

2.如权利要求1所述的促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基为MS+1.5mg/L TDZ+ 100mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。

3.如权利要求1所述的促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，其特征在于，外植体表面灭菌的方法为：取椒样薄荷0.5～1cm茎尖为外植体，用洗涤剂漂洗5～10分钟，自来水冲洗30分钟，滤干后转至超净工作台，然后用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞浸泡8～10分钟，无菌水冲洗3～5次。

4.如权利要求1-3任一项所述的促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，其特征在于，培养室条件为：温度25±1℃，光照强度为50～60μmoL/(m²·s)，光周期为16/8h，湿度为30％。