CN108157183B - 一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法 - Google Patents

一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法。所述的愈伤组织诱导的方法包括以下步骤：1、种子表面消毒；2、种子萌发和愈伤组织的诱导；3、愈伤组织的继代培养。此外，本发明还提出了一种马齿苋细胞的悬浮培养方法，包括：将所述的愈伤组织转入液体培养基中，在摇床转速为100rpm，25℃避光下培养，获得马齿苋悬浮细胞。本发明选用了毒秀定(picloram)作为马齿苋愈伤组织诱导、继代及悬浮培养的诱导剂，同时外植体选用表面消毒的种子直接在诱导培养上进行萌发和愈伤组织的诱导，诱导效率为100％。从愈伤组织的诱导、继代和悬浮细胞培养都选用同一个浓度的毒秀定来进行诱导，方法简单，不需要对外植体进行多次操作，同时避免了褐化现象的发生。

Description

一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，特别涉及一种马齿苋愈伤组织诱导及悬浮培养的方法。本发明属于植物组织培养技术领域。
背景技术
马齿苋，别名马齿菜、瓜子菜、马蛇子菜、五行草、长寿草、长命苋等，主要分布于温带及热带地区。在我国马齿苋有6个品种：马齿苋、毛马齿苋、大花马齿苋、四瓣马齿苋、沙生马齿苋和小琉球马齿苋。马齿苋主要作为野生蔬菜使用，以野生为主，很少有人工栽培。
马齿苋营养价值很高，富含钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、尼克酸、抗坏血酸、苹果酸、柠檬酸、香豆素和黄酮等。马齿苋中富含ω-3脂肪酸可增加血管中前列腺素的合成，减少血栓素A2，降低血液粘度，还能抑制胆固醇和甘油三酯的合成，防止动脉粥样硬化，预防心血管疾病的发生。马齿苋含有高浓度的L-去甲肾上腺素，能促进胰岛素的分泌，具有降低和稳定血糖的作用。马齿苋多糖POP可增加T淋巴细胞数量，抑制肝癌细胞的增殖，同时富含天然抗氧化剂具有很强的清除自由基的能力，可降低其他致癌物质诱发癌变的概率，还能延缓皮肤和机体的衰老。马齿苋提取物对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、黄曲霉、赤霉菌等具有很好的抑制作用。
马齿苋种类繁多，资源丰富具有很高的利用价值和广阔的开发价值。但是目前对它的利用开发还不够深入和全面，同时其生长环境被工业污水所污染，单靠野生资源供给马齿苋将会面临大多数中草药所处的现状（如甘草等中草药野生资源满足不了人们对其的需求，而人工品种品质不高）。植物细胞工程培养技术具有可延续、可控制悬浮细胞的生长周期，可放大进行工业化生产等优势，是解决马齿苋将来出现野生资源供给满足不了人们对它需求的解决途径之一，也是研究开发利用马齿苋的一种方法和工具。
目前对马齿苋在组织培养进行了一些研究和报道，主要通过将无菌苗或者野生马齿苋的茎和叶等，经不同配比的植物激素6-BA、2,4-D或NAA诱导产生愈伤组织。虽然，通过不同激素浓度的组合可成功诱导马齿苋愈伤组织，但是在诱导过程中需要摸索和调整激素的比例，其次在进行愈伤组织继代过程中还需要再次对植物激素比例进行摸索和调整。在进行马齿苋愈伤组织诱导、继代和悬浮培养中，需要对植物激素种类和浓度比例进行多次变换，易导致添加激素错误的问题，而且多次添加易导致操作环节出现污染的问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种简单诱导马齿苋愈伤组织的方法。
本发明的目的之二是提供了一种马齿苋细胞的悬浮培养方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种马齿苋愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：
步骤一：将马齿苋种子用84消毒液进行表面消毒10~15 min，期间放置于旋转摇床进行充分混合，在超净工作台中用无菌水对消毒后的种子进行洗涤5次以上，作为外植体备用；
步骤二：表面消毒后的马齿苋种子转移到愈伤组织诱导培养基上进行种子萌发和愈伤组织的诱导，培养条件为长日照，温度为25℃；经过7~10天，马齿苋种子萌发，并且茎叶部位的组织开始被诱导产生愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为含有30 g/L蔗糖，4 g/L结冷胶，20~40 mg/L毒莠定的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8~6.0；
步骤三、将步骤二中诱导产生的愈伤组织切割分离，接种到愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，继代周期为15~20天/次，培养条件为长日照，温度为25℃，得到疏松的愈伤组织。
其中，优选的，步骤一中所述的84消毒液的有效含氯量8000~10500 mg/L。
其中，优选的，步骤二中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。
其中，优选的，所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65 g/L NH4NO3、1.90 g/L KNO3、0.17 g/L KH2PO4、0.1807 g/L MgSO4·7H2O、0.332 g/L CaCl2、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、6.20 mg/L H3BO3、0.83 mg/L KI、8.60 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/LNa2-EDTA·2H2O、100 mg/L肌醇、0.50 mg/L烟酸、0.50 mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0 mg/L甘氨酸。
其中，优选的，步骤三中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。
采用本发明方法获得愈伤组织可用于马齿苋的再生培养，或是用于马齿苋的悬浮细胞培养。马齿苋的再生培养及悬浮细胞培养均可按照现有方法进行。
为了提高悬浮培养的效果，进一步的，本发明还提出了一种马齿苋细胞的悬浮培养方法，包括以下步骤：
按照以上所述的方法获得的疏松的马齿苋愈伤组织，将该愈伤组织转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100 rpm，获得马齿苋悬浮细胞；
所述的液体培养基为含有30 g/L蔗糖，20~40 mg/L毒莠定的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8-6.0。
其中，优选的，所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65 g/L NH4NO3、1.90 g/L KNO3、0.17 g/L KH2PO4、0.1807 g/L MgSO4·7H2O、0.332 g/L CaCl2、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、6.20 mg/L H3BO3、0.83 mg/L KI、8.60 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/LNa2-EDTA·2H2O、100 mg/L肌醇、0.50 mg/L烟酸、0.50 mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0 mg/L甘氨酸。
其中，优选的，每100 ml液体诱导培养基中接种1 g愈伤组织。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明选用了毒莠定（picloram）作为马齿苋愈伤组织诱导、继代及悬浮培养的诱导剂，从愈伤组织诱导、继代和悬浮细胞培养都选用同一个浓度的毒莠定来进行诱导，方法简单，不需要进行繁杂的调整，同时避免了褐化现象的发生。
2、马齿苋的种子经表面消毒后，直接在愈伤组织诱导培养基上进行萌发诱导，不需要对无菌苗再次进行操作。马齿苋种子萌发的无菌苗在诱导培养基上生长7~10天后，茎叶部分会诱导产生愈伤组织（淡黄或者浅红色颗粒），诱导率100 %。将诱导的愈伤组织切割分离，可在诱导培养基上进行继代培养，一般15~20天进行一次继代。在继代培养基中，每次继代周期，每克马齿苋愈伤组织的生物量可增加5~6 g，没有现褐化现象发生。
3、将1 g结构疏松的马齿苋愈伤组织接种100 ml的液体诱导培养基中，黑暗条件下培养，20天后悬浮细胞湿重的生物量可以达到12~15 g，悬浮细胞的生物量增加了10倍以上。马齿苋愈伤组织诱导到悬浮细胞的培养，过程操作简单，培养基成分简单，诱导效率高，三个阶段的培养条件兼容性好。
4、收集马齿苋悬浮细胞，真空冻干后，采用75 %乙醇按照料液比1:10（m:v）在室温条件下提取30 min，采用12000×g进行离心分离，保留上清液。悬浮细胞提取物对DPPH自由基的抗氧化能力为79.44%，原药材提取物的抗氧化能力为56.51 %，悬浮细胞提取物的抗氧化能力比原药材提取物高40.58 %；悬浮细胞提取物对羟自由基的抗氧化能力为83.51 %，原药材提取物对羟自由基的抗氧化能力为40.64% , 悬浮细胞提取物对羟自由基的抗氧化能力比原药材提取物高105.49 %。说明马齿苋悬浮细胞提取物的抗氧化能力比原药材提取物高。
附图说明
图1为诱导的马齿苋愈伤组织和悬浮细胞；
图2为提取物对DPPH自由基的清除能力；
图3提取物对羟自由基的清除能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 马齿苋愈伤组织的诱导
1、方法
步骤一：将马齿苋种子用适量的84消毒液（有效含氯量8000~10500 mg/L）进行表面消毒10~15 min，期间放置于旋转摇床进行充分混合，在超净工作台中用无菌水对消毒后的种子进行洗涤5次以上，作为外植体备用。
步骤二：表面消毒后的马齿苋种子转移到愈伤组织诱导培养基上进行种子萌发和愈伤组织的诱导，培养条件为长日照（16小时光照/8小时黑暗），温度为25℃；经过7~10天左右，马齿苋种子萌发，并且茎叶部位的组织开始被诱导产生愈伤组织，产生的愈伤组织颜色淡黄或者浅红色颗粒。
所述的愈伤组织诱导培养基为含有蔗糖30 g/L，结冷胶 4g/L的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8-6.0后，高压灭菌除菌，待冷却至50℃后，加入40mg/L的毒莠定，再进行平板倒置。
所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65 g/L NH4NO3、1.90 g/L KNO3、0.17g/L KH2PO4、0.1807 g/L MgSO4·7H2O、0.332 g/L CaCl2、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、6.20mg/L H3BO3、0.83 mg/L KI、8.60 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O、100 mg/L肌醇、0.50 mg/L烟酸、0.50 mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0mg/L甘氨酸。
步骤三、将步骤二中诱导产生的愈伤组织切割分离，接种到愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，继代周期为15~20天/次，培养条件为长日照（16小时光照/8小时黑暗），温度为25℃，得到疏松的愈伤组织。
2、结果
马齿苋种子经消毒后，直接在愈伤组织诱导培养基中进行萌发和愈伤组织诱导，继代可直接在诱导培养基上进行，图1左为继代4次左右的马齿苋愈伤组织。实验证明，直接接种种子进行愈伤组织诱导，茎叶部分的诱导率为100 %，在愈伤组织继代过程中，不需进行培养基成分的调整，愈伤组织继代过程中没有褐化现象的发生，愈伤组织继代每克每代愈伤组织增重5~6 g。
实施例2 马齿苋细胞的悬浮培养方法
1、方法
1.1 马齿苋悬浮细胞的制备
将实施例1得到的继代培养后的疏松愈伤组织按照固液比1:100（每100 ml液体诱导培养基，接种1 g愈伤组织细胞）转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100 rpm。
所述的液体培养基为含有蔗糖30 g/L的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8-6.0后，高压灭菌除菌，待冷却至50 ℃后，加入40 mg/L的毒莠定，再进行平板倒置。
所述MS培养基包括以下终浓度的各物质：1.65 g/L NH4NO3、1.90 g/L KNO3、0.17g/L KH2PO4、0.1807 g/L MgSO4·7H2O、0.332 g/L CaCl2、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、6.20mg/L H3BO3、0.83 mg/L KI、8.60 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O、100 mg/L肌醇、0.50 mg/L烟酸、0.50 mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0mg/L甘氨酸。
1.2悬浮细胞提取物的抗氧化活性研究
悬浮细胞提取物的制备：收集1.1得到的马齿苋悬浮细胞，真空冻干后，采用75 %乙醇按照料液比1:10（m:v），在室温条件下，置于超声清洗仪中提取30 min后，12000 × g进行离心分离，用0.45μm亲水性滤膜过滤上清液备用。
原药材提取物的制备：马齿苋原药材，采用植物组织研磨仪粉碎后，用400目网筛去除大颗粒物质，采用75 %乙醇按照料液比1:10（m:v），在室温条件下，置于超声清洗仪中提取30 min后，12000 × g进行离心分离，用0.45 μm亲水性滤膜过滤上清液备用。
将上述得到的提取液用于以下实验：
1.2.1 悬浮细胞提取物对DPPH自由基的清除能力：采用75 %的乙醇配制浓度为0.2 mmol/L浓度的DPPH溶液，现配现用。 采用75 %的乙醇配制浓度为100 μg/ml的抗坏血酸（Vc）阳性对照样品。按照表1的实验体系进行添加，充分混合后，室温避光条件下反应30min。各取反应液1 ml，在517 nm处测定溶液的吸光值。
表1 DPPH自由基清除实验反应体系
试剂和样品 A 组 B组 C组
样品溶液 1 ml - 1 ml
75 %乙醇 - 1 ml 1 ml
0.2 mmol/L DPPH 1 ml 1 ml -
上述测得的吸光值按照以下公式进行计算。
清除率（%）= [(B+C)-A]/B×100%。
A：试样溶液与DPPH溶液混合后OD517值；B：75 %乙醇与DPPH溶液混合后OD517值；C：75 %乙醇与试样溶液混合后OD517值。
分别选用Vc、马齿苋悬浮细胞提取液和马齿苋原药材提取液作为样品溶液，测量其反应后的吸光值OD517，分别计算出它们的自由基清除率，并比较其清除率的能力。
1.2.2悬浮细胞提取物对羟自由基的清除能力：用纯水分别配置6 mmol/L的FeSO4、 H2O2和水杨酸。在10 ml离心管中加入1 ml样品溶液和1 ml的FeSO4、 1 ml H2O2（快速加入），静置10 min。然后向反应体系中加入1 ml的水杨酸，充分混匀，再静置反应30min。其中样品溶液分别为：马齿苋悬浮细胞提取液、马齿苋原药材提取液和Vc溶液（阳性对照），空白对照为纯水。测量样品反应液在510 nm处的吸光值，记录为A1，空白对照的吸光值记录为A0。测试样品溶液对羟自由基的清除率按照以下公式进行计算。
清除率（%）=（1-A1/A0）×100 %
2、结果
培养一代20天后，悬浮细胞每克每代增重12~15 g，且没有褐化现象发生。
悬浮细胞提取物对DPPH自由基的清除能力为79.44 %（图2所示），原药材提取物的清除能力为56.51 %（图2所示），悬浮细胞提取物的抗氧化能力比原药材提取物提高了40.58 %（图2所示）；悬浮细胞提取物对羟自由基的清除能力为83.51 %（图3所示），原药材提取物对羟自由基的清除能力为40.64 %（图3所示），阳性对照Vc对羟自由基的清除能力为55.24 %（图3所示），悬浮细胞提取物对羟自由基的清除能力比原药材提取物提高了105.49%，比阳性对照Vc提高了55.18 %。
综合上述实验结果，说明马齿苋悬浮细胞提取物的抗氧化能力比原药材提取物高。

Claims (6)

1.一种马齿苋愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将马齿苋种子用84消毒液进行表面消毒10~15min，期间放置于旋转摇床进行充分混合，在超净工作台中用无菌水对消毒后的种子进行洗涤5次以上，作为外植体备用；
步骤二：表面消毒后的马齿苋种子转移到愈伤组织诱导培养基上进行种子萌发和愈伤组织的诱导，培养条件为长日照，温度为25℃；经过7~10天，马齿苋种子萌发，并且茎叶部位的组织开始被诱导产生愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为添加30g/L蔗糖，4g/L结冷胶，20~40mg/L毒莠定的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8~6.0；
所述MS培养基中，各物质的终浓度如下：1.65g/LNH4NO3、1.90g/LKNO3、0.17g/LKH2PO4、0.1807g/LMgSO4·7H2O、0.332g/LCaCl2、22.3 mg/LMnSO4·4H2O、6.20 mg/LH3BO3、0.83mg/LKI、8.60 mg/LZnSO4·7H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.025mg/LCuSO4·5H2O、0.025mg/LCoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O、100mg/L肌醇、0.50mg/L烟酸、0.50mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0 mg/L甘氨酸；
步骤三、将步骤二中诱导产生的愈伤组织切割分离，接种到愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，继代周期为15~20天/次，培养条件为长日照，温度为25℃，得到疏松的愈伤组织。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述的84消毒液的有效含氯量8000~10500 mg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的培养条件为16小时光照/8小时黑暗。
5.一种马齿苋细胞的悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照权利要求1所述的方法获得的疏松的马齿苋愈伤组织，将该愈伤组织转入液体培养基中，培养条件为避光，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，获得马齿苋悬浮细胞；
所述的液体培养基为添加30g/L蔗糖，20~40mg/L毒莠定的MS（Murashige-Skoog）培养基，用HCl和KOH调整pH为5.8~6.0；
所述MS培养基中，各物质的终浓度如下：1.65g/LNH4NO3、1.90g/LKNO3、0.17g/LKH2PO4、0.1807g/LMgSO4·7H2O、0.332g/LCaCl2、22.3 mg/LMnSO4·4H2O、6.20 mg/LH3BO3、0.83mg/LKI、8.60 mg/LZnSO4·7H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.025mg/LCuSO4·5H2O、0.025mg/LCoCl2·6H2O、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O、100mg/L肌醇、0.50mg/L烟酸、0.50mg/L维生素B6、0.10 mg/L维生素B1以及2.0 mg/L甘氨酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，每100ml液体诱导培养基中接种1g愈伤组织。
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