CN112154919B - 一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及方法 - Google Patents
一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及培养方法，培养基包括改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂；诱导剂为：PIC 0.2～1.0+6‑BA 1.0～2.0 +NAA 0.05～0.2，pH5.8～6.5；壮苗生根剂为：BS 0.01～0.2+IAA 0.2～0.5，pH5.8～6.5；配制培养基，将改良MS培养基和诱导剂配制成半固体愈伤成苗培养基，并调节pH值为6.0，高压灭菌后备用；将壮苗生根剂使用真空过滤器灭菌后备用，培养后期加入。采用本发明培养基及培养方法，只配制一次培养基，在培养中途加入一次壮苗生根剂，就可以将七叶一枝花愈伤组织到成苗一次性完成，并保持高增殖倍数（12倍以上），丛生小苗生长健壮、根系发达，移栽成活率达78.6%，极大地提高了七叶一枝花种苗获得的效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养，具体是一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及培养方法。
背景技术
植物组织培养技术中的培养基分为固体培养基和液体培养基两种，固体培养基由基本培养基（如MS、B5等）、植物生长调节剂、白糖、琼脂等组成，液体培养基由基本培养基（如MS、B5等）、植物生长调节剂、白糖等组成，液体培养基和固体培养基的区别是有无琼脂等凝结剂。
目前，常用的培养基是MS（Murashige an天 Skoog）培养基，再添加不同植物激素根据植物培养不同阶段，如初代诱导、诱导愈伤、分化培养、增殖培养及生根培养等进行特定培养，这些过程就会转瓶多次，步骤繁琐，增加植物培养周期。
七叶一枝花(Paris polyphylla var. chinensis)是百合科重楼属多年生草本植物，又名重楼、七叶莲等，是一种重要的中药材，作为云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等著名中成药的主要原料。七叶一枝花自然生长非常缓慢，其药用部位根状茎一般需要5-8年才能成药材。面临药材需求大，完全依赖野生资源已无法解决日益需求的矛盾，亟需进行人工优质种苗的快速繁育工作。
目前，也进行了七叶一枝花组织培养技术研究，但由于七叶一枝花植物培养周期长，每个环节的培养时间至少需要20天以上，按照常规培养一批组培苗出苗至少需要120天以上，甚至更长时间，这样组培室的人工、水电、光照都会产生费用，再加上不断地更换培养基转瓶需要的材料费用、洗瓶费用和接种人工费用等，使得培养出的组培苗成本费用居高不低，严重阻碍了七叶一枝花组培苗的推广和应用。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基及培养方法。七叶一枝花组培苗的增殖培养和生根培养阶段均在一种培养基上完成，即配制一次培养基便可诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗，且移栽成活率高。
实现本发明目的的技术方案是：
一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基，包括改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂；
所述改良MS培养基的组成成分为：
硝酸钾1900，硫酸铵1500～5000，七水硫酸镁370，磷酸二氢钾170，无水氯化钙330，四水硫酸锰22.3，硫酸锌8.6，硼酸6.2，碘化钾0.83，钼酸钠0.25，五水硫酸铜0.025，氯化钴0.025，乙二胺钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，烟酸 0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.6～2.4；活性炭50～100，葡萄糖5000～6000 ，蔗糖25000～30000，琼脂 4500～6000，单位为mg/L；
所述诱导剂为：PIC 0.2～1.0+6-BA 1.0～2.0 +NAA 0.05～0.2，pH5.8～6.5，单位为mg/L；
所述壮苗生根剂为：BS 0.01～0.2+IAA 0.2～0.5 ，pH5.8～6.5，单位为mg/L；
配制培养基，将改良MS培养基和诱导剂配制成半固体愈伤成苗培养基，并调节pH值为6.0，高压灭菌后备用；将壮苗生根剂使用真空过滤器灭菌后备用，培养后期加入。
进一步地，所述诱导剂为：PIC 0.5+6-BA 2.0 +NAA 0.1，pH6.0，单位为mg/L。
进一步地，所述壮苗生根剂为：BS 0.1mg/L+IAA 0.3 mg/L，pH6.0，单位为mg/L。
所述诱导剂、壮苗生根剂中，PIC为毒莠定，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，BS为芸苔素内酯，IAA为吲哚-3-乙酸，试剂均为分析纯。配制培养基和溶液的水均为超纯水。
本发明改良MS培养基，在基本MS培养基上做了调整，参照B5培养基和N6培养基，将硝酸铵用硫酸铵替代，并对硫酸铵添加量做了试验，共试验了1000mg/L、1500mg/L、2500mg/L、5000mg/L、10000mg/L 5个浓度，试验出一个适合七叶一枝花组培苗生长的铵盐浓度范围1500～5000mg/L，这也是符合植物组培利用发展所需。
众所周知，随着国家监管部门对硝酸铵（制造炸药所需的原料）这类药品的管控，实验室采购越来越难，必须得尽早寻求其他物质替代植物生长所需的铵态氮。结合本发明是诱导愈伤组织成苗，需要适当减小铵盐的用量和增加有机物含量。因而又结合B5培养基中含量较高的有机物组分盐酸硫胺素，共试验了0.1mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L、1.2mg/L、2.4mg/L 5个浓度，得出适合七叶一枝花愈伤组织成苗的适宜浓度范围为0.6～2 .4mg/L。
采用本发明培养基诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，包括以下步骤：
（1）在超净工作台上，将原来获得的七叶一枝花愈伤组织瓶苗，用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将愈伤组织团切成2～3cm的小块，分别接入灭菌过的愈伤成苗培养基中，每瓶接入1块；
接种好后放入培养室中培养，先暗培养5～7天，愈伤组织组织萌发出小芽时，再进行光照培养，光照培养15～20天，可见2～6cm不等的丛生芽，叶片单张舒展开，心形叶，绿色；培养基底部有部分小芽有细长的白色根长出；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的壮苗生根剂加入培养瓶中，每瓶加入0.5～2ml，盖好盖子，继续将培养瓶放入培养室进行光照培养，培养20～30天，丛生芽上每个小芽的基部都长出粗壮的根，芽与芽之间的愈伤已经分化成幼嫩的根状茎，根数6～15条，叶片舒展，茎高5cm以上，便可炼苗出瓶。
本发明培养方法中，步骤（1）和（2）所述培养室的培养条件为：温度 24～26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000 lx，湿度60～70%。
采用本发明培养方法，只配制一次培养基，在培养中途加入一次壮苗生根剂，就可以将七叶一枝花愈伤组织到成苗一次性完成，并保持高增殖倍数（12倍以上），丛生小苗生长健壮、根系发达，移栽成活率达78.6%。
本发明与申请人在先申请的CN201811631795.0“一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法”相比，七叶一枝花成苗出瓶时间缩短了一半：传统方法培养从无菌苗的获得、增殖培养到壮苗生根成苗至少需要4个月时间，而采用本发明培养基及培养方法从愈伤组织直接诱导成苗出瓶约60天。
采用本发明方法极大地提高了七叶一枝花种苗获得的效率，是一项有效地繁苗方法，能简便快捷地应用到工厂化生产七叶一枝花种苗，为解决七叶一枝花中药材规模化种植提供技术支撑。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，包括以下步骤：
（1）配制培养基
培养基包括改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂；
改良MS培养基的成分为：
硝酸钾1900，硫酸铵1500，七水硫酸镁370，磷酸二氢钾170，无水氯化钙330，四水硫酸锰22.3，硫酸锌8.6，硼酸6.2，碘化钾0.83，钼酸钠0.25，五水硫酸铜0.025，氯化钴0.025，乙二胺钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，烟酸 0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.6；活性炭100，葡萄糖5000 ，蔗糖25000，琼脂 5000，单位为mg/L；
诱导剂为：PIC 0.2+6-BA 1.0 +NAA 0.05，pH6.0，单位为mg/L；
壮苗生根剂为：BS 0.01mg/L+IAA 0.2 mg/L，pH6.0，单位为mg/L；
配制培养基，将改良MS培养基和诱导剂配制成半固体愈伤成苗培养基，并调节pH值为6.0，高压灭菌后备用；
（2）在超净工作台上，将原来获得的七叶一枝花愈伤组织瓶苗，用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将愈伤组织切成2～3cm的小块，分别接入灭菌过的愈伤成苗培养基中，每瓶接入1块；
接种好后放入培养室中培养，先暗培养5～7天，愈伤组织组织开始萌发出小芽时，再进行光照培养，光照培养15～20天，可见3cm左右高的丛生芽，每丛6~8株，叶片单张舒展开，心形叶，绿色；培养基底部有部分小芽有细长的白色根长出；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的壮苗生根剂加入培养瓶中，每瓶加入1ml，盖好盖子，继续将培养瓶放入培养室进行光照培养，培养20～30 天，丛生芽上每个小芽的基部都长出细根，根数5～8条，叶片不大、黄绿色，苗长得慢；
步骤（2）和（3）所述培养室的培养条件为：温度 24～26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000 lx，湿度60～70%。
实施例2
一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，包括以下步骤：
（1）配制培养基
培养基包括改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂；
改良MS培养基的成分与实施例1相同：
硫酸铵2500mg/L，盐酸硫胺素2.4mg/L，活性炭100 mg/L，葡萄糖5000 mg/L ，蔗糖25000 mg/L，琼脂 5000 mg/L，其余成分与实施例1相同；
诱导剂组成为：PIC 0.5+6-BA 2.0 +NAA 0.1，pH 6.0，单位为mg/L；
壮苗生根剂组成为：BS 0.1mg/L+IAA 0.3 mg/L，pH6.0，单位为mg/L；
培养基的配制方法与实施例1相同；
（2）在超净工作台上，将原来获得的七叶一枝花愈伤组织瓶苗，用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将愈伤组织团切成2～3cm大小的小块，分别接入灭菌过的愈伤成苗培养基中，每瓶接入1块。接种好后放入培养室中培养。先暗培养5～7天，愈伤组织组织开始萌发出小芽时，再进行光照培养。光照培养15～20天，可见2～5cm不等高度的丛生芽，每丛10株以上，叶片单张舒展开，心形叶，绿色；培养基底部有部分小芽有细长的白色根长出。
（3）在超净工作台上在超净工作台上，将步骤（2）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的壮苗生根剂加入培养瓶中，每瓶加入1ml，盖好盖子，继续将培养瓶放入培养室进行光照培养。培养20～30 天，丛生芽上每个小芽的基部都长出粗根，根数10条以上，叶片肥绿、宽大，苗长得慢；
所述壮苗生根剂组成为：BS 0.1mg/L+IAA 0.3 mg/L，pH6.0。
步骤（2）和（3）所述培养室的培养条件为：温度 24～26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000 lx，湿度60～70%。
实施例3
一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，包括以下步骤：
（1）配制培养基
培养基包括改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂；
改良MS培养基的成分与实施例2相同；
诱导剂组成为：PIC 1.0+6-BA 2.0 +NAA 0.2，pH 6.0，单位为mg/L；
壮苗生根剂组成为：BS 0.2mg/L+IAA 0.5 mg/L，pH6.0，单位为mg/L；
培养基的配制方法与实施例1相同；
（2）在超净工作台上，将原来获得的七叶一枝花愈伤组织瓶苗，用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将愈伤组织团切成2～3cm的小块，分别接入灭菌过的愈伤成苗培养基中，每瓶接入1块；
接种好后放入培养室中培养，先暗培养5～7天，愈伤组织组织开始萌发出小芽时，再进行光照培养，光照培养15～20天，可见2cm以上不等高度的丛生芽，每丛10株以上，叶片单张舒展开，心形叶，绿色，培养基底部有部分小芽有细长的白色根长出；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的壮苗生根剂加入培养瓶中，每瓶加入1ml，盖好盖子，继续将培养瓶放入培养室进行光照培养，培养20～30 天，丛生芽上每个小芽的基部都长出粗根，根条数条，芽与芽之间部分愈伤已经分化成幼嫩的根状茎，叶片舒展、绿色，苗长势好；
步骤（2）和（3）所述培养室的培养条件为：温度 24～26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000 lx，湿度60～70%。
实施例4（对照组）
培养基采用MS，诱导培养基、增殖培养基、生根培养基以及培养方法均按照CN201811631795.0“一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法”的培养方法操作。
实施例1~3培养基，采用改良MS培养基，通过添加不同植物生长调节剂及不同浓度配比诱导，以期从中筛选出最佳七叶一枝花愈伤成苗组合。
实施例4是传统培养方式，用作对照。数据统计和计算，每个处理设计三次重复，每次重复统计5瓶，求平均值。丛芽株数按照一茎带一叶计做1株，具体对照指标见表1。
表1 各实施例七叶一枝花愈伤成苗生长情况及接种数、培养周期对比：
通过表1中的数据对比表明：采用本发明培养基及培养方法诱导七叶一枝花愈伤组织成苗与传统培养方法相比，各指标呈显著差异。株高、茎粗、根数、根粗及根长都优于传统培养方式（实施例4）。采用本发明方法可节约两次以上培养基的成本，并节省了大量转瓶接种的时间，简化组培程序，可大大降低七叶一枝花组培苗生产成本。本发明方法操作简单，生产成本低，可在短时间内生产出大量优质种苗，为七叶一枝花优质低价的种苗繁育提供技术支持和保障。
Claims (5)
1.一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基，其特征在于：
所述培养基由改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂组成；
所述改良MS培养基的组成成分为：
硝酸钾1900，硫酸铵1500～5000，七水硫酸镁370，磷酸二氢钾170，无水氯化钙330，四水硫酸锰22.3，硫酸锌8.6，硼酸6.2，碘化钾0.83，钼酸钠0.25，五水硫酸铜0.025，氯化钴0.025，乙二胺钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，烟酸 0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.6～2.4，活性炭50～100，葡萄糖5000～6000 ，蔗糖25000～30000，琼脂 4500～6000，单位为mg/L；
所述诱导剂为：PIC 0.2～1.0+6-BA 1.0～2.0 +NAA 0.05～0.2，单位为mg/L，pH5.8～6.5；
所述壮苗生根剂为：BS 0.01～0.2+IAA 0.2～0.5，单位为mg/L，pH5.8～6.5；
配制培养基，将改良MS培养基和诱导剂配制成半固体愈伤成苗培养基，并调节pH值为6.0，高压灭菌后备用；将壮苗生根剂使用真空过滤器灭菌后备用，培养后期加入。
2.根据权利要求1所述的诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基，其特征在于：所述诱导剂为：PIC 0.5+6-BA 2.0 +NAA 0.1，单位为mg/L，pH6.0。
3.根据权利要求1所述的诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养基，其特征在于：所述壮苗生根剂为：BS 0.1mg/L+IAA 0.3 mg/L，pH6.0。
4.一种诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配制培养基
所述培养基由改良MS培养基和诱导剂，以及壮苗生根剂制成；
所述改良MS培养基的成分为：
硝酸钾1900，硫酸铵1500～5000，七水硫酸镁370，磷酸二氢钾170，无水氯化钙330，四水硫酸锰22.3，硫酸锌8.6，硼酸6.2，碘化钾0.83，钼酸钠0.25，五水硫酸铜0.025，氯化钴0.025，乙二胺钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，烟酸 0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.6～2.4，活性炭50～100，葡萄糖5000～6000 ，蔗糖25000～30000，琼脂 4500～6000，单位为mg/L；
所述诱导剂为：PIC 0.2～1.0+6-BA 1.0～2.0 +NAA 0.05～0.2，单位为mg/L，pH5.8～6.5；
所述壮苗生根剂为：BS 0.01～0.2+IAA 0.2～0.5 ，单位为mg/L，pH5.8～6.5；
配制培养基，将改良MS培养基和诱导剂配制成半固体愈伤成苗培养基，并调节pH值为6.0，高压灭菌后备用；
将壮苗生根剂使用真空过滤器灭菌后备用，培养后期加入；
（2）在超净工作台上，将获得的七叶一枝花愈伤组织瓶苗，用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将愈伤组织切成2～3cm的小块，分别接入灭菌过的愈伤成苗培养基中，每瓶接入1块；
接种好后放入培养室中培养，先暗培养5～7天，愈伤组织萌发出小芽时，再进行光照培养，光照培养15～20天，可见丛生芽，培养基底部有部分小芽有细长的白色根长出；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的壮苗生根剂加入培养瓶中，每瓶加入0.5～2ml，盖好盖子，继续将培养瓶放入培养室进行光照培养，培养20～30 天，丛生芽上每个小芽的基部都长出粗壮的根，芽与芽之间的愈伤已经分化成幼嫩的根状茎，炼苗出瓶。
5.根据权利要求4所述的诱导七叶一枝花愈伤组织直接成苗的培养方法，其特征在于：步骤（2）和（3）所述培养室的培养条件为：温度 24～26℃，光照时间为12h/天，光照强度为2000 lx，湿度60～70%。
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