CN105165611B

CN105165611B - 一种草莓果实愈伤组织的培养方法

Info

Publication number: CN105165611B
Application number: CN201510608855.7A
Authority: CN
Inventors: 王媛花; 张立伟; 颜志明; 王全智
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Zhongjiang Seed Industry Co.,Ltd.
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN105165611A

Abstract

本发明公开了一种草莓果实愈伤组织的培养方法，首先将草莓果实无菌化处理，在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养5天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，这时在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤接种于愈伤组织增殖培养基中，培养10~15天以后，愈伤体积变为原来体积的3~4倍大小。本发明提供了一种草莓果实愈伤组织的培养方法，果实愈伤组织诱导率可达到100%，草莓的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为草莓基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为草莓果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。

Description

一种草莓果实愈伤组织的培养方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种愈伤组织的培养方法。

背景技术

目前很多国家都开展了草莓基因组的研究，草莓基因组研究的方向主要涉及植株抗性、果实品质果实生产特性等几个大的方面，其中，草莓重要经济性状尤其是与果实品质形成相关的分子机理研究也成为是草莓基因组研究的热点。在草莓的分子机理研究方面，愈伤组织成为常用的试验材料，也是基因工程研究中进行基因转化所必需的试验材料。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织，而植物愈伤组织因为具有以下特点而被广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。愈伤组织的特点：①无性繁殖，大量扩繁；②为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料；③为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；④为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操对象；⑤为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。

目前对于愈伤组织的研究多集中研究叶片的愈伤组织，然而，随着草莓分子生物学研究的不断深入，仅仅研究单一器官或者组织的愈伤组织培养，显然不能满足研究需要。而对于草莓来说几乎所有器官和组织都可以作为外植体，目前草莓的研究中，对果实品质形成以及果实成熟发育的分子机理研究是一大热点，因此，培养草莓果肉的愈伤组织是研究草莓果实品质形成以及果实成熟发育分子机理的一条非常重要的途径。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种草莓果实愈伤组织的培养方法，建立高效快速的草莓果肉愈伤组织培养体系，果实愈伤组织诱导率达到100％。

技术方案：本发明所述的一种草莓果实愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

(1)草莓果实的无菌化处理

果实表面用流水冲洗干净，在无菌条件下，用75％的乙醇消毒2分钟后用无菌去离子水冲洗3次，然后用10％的次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗4～5次，然后用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去果皮，从果实中间切开，选取果心部分，用打孔器切直径0.5厘米的圆片接种于愈伤诱导培养基上；

(2)草莓果实的圆片培养

在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养5天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，这时在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤接种于愈伤组织增殖培养基中，培养10～15天以后，愈伤体积变为原来体积的3～4倍大小。

进一步，所述培养基为MS培养基，每升MS培养基中包括6-BA0.4mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉6g/L。

6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，可以诱导愈伤组织发生。但是一般在诱导愈伤组织发生时浓度不宜过高，本试验中添加0.4mg/L的6-BA就能够很好的诱导‘红颜’草莓果实愈伤组织的形成。NAA为萘乙酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖。一般的组织培养中，蔗糖都是添加30g/L，在本试验中，因为所选植物材料是果肉，果肉本身含有糖分，因此培养时蔗糖浓度不宜过高，本试验中所用蔗糖为20g/L。琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用，一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。

进一步，每升MS培养基包括：KNO₃硝酸钾1500mg/L、(NH₄)₂SO₄硫酸铵500mg/L、CO(NH₂)₂尿素200mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L、KI碘化钾1.1mg/L、MnSO₄·4H₂O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO₄·7H₂O七水合硫酸锌8mg/L、H₃BO₃硼酸5mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L、CaCl₂·2H₂O二水合氯化钙100mg/L、肌醇100mg/L、烟酸2mg/L、维生素B₁1mg/L、维生素B₆1mg/L、维生素C2mg/L。常规MS培养基的特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，但是本发明中由于草莓果实愈伤组织的特殊性，因此需要对愈伤组织的生长特点细化MS培养基的组成成分。以硫酸铵和尿素代替了原来MS培养基中的硝酸铵，增加了维生素C，在愈伤组织培养中需要较多的氮元素，硫酸铵和尿素的添加，提供足够的氮元素。其次，以上组织培养的过程中容易产生酚类醌类物质导致愈伤组织褐化，因此，添加维生素C，能够抑制酚类醌类物质的产生，防止褐化。

进一步，所述培养基的PH值为5.8，过高或者过低都会造成植株生长不好，或者死亡，因此一定要精准调节PH值到5.8。

进一步，选用生长时期为花后5～8天的草莓作为培养对象。

有益效果：本发明提供了一种草莓果实愈伤组织的培养方法，果实愈伤组织诱导率可达到100％，草莓的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为草莓基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为草莓果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例：

分别选用植物材料为‘红颜’草莓花后5～8天、15-18天、23-25、28-30天的果实，果实愈伤组织的培养方法按照以下步骤操作。

1、外植体处理

首先果实表面用流水冲洗干净，在无菌条件下，用75％的乙醇消毒2分钟后用无菌去离子水冲洗3次，然后用10％的次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗4～5次，然后用无菌滤纸吸干果皮表面水分。消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去果皮，将果心的果肉切成0.5毫米的薄片后用直径0.5厘米的打孔器将果肉打成圆片后接种于已经准备好的愈伤组织诱导培养基中。

2、外植体培养

在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养5天后果实圆片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，这时在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤接种于愈伤组织增殖培养基中，培养10～15天以后，愈伤体积变为原来体积的3～4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于增殖培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。

3、果肉愈伤组织质量评价指标

果肉愈伤组织的质量好坏，有以下几个评价指标：

(1)愈伤组织的颗粒大小

以培养20天的果肉愈伤组织为准，测量不同培养基和不同培养条件下诱导果肉愈伤组织的大小，愈伤组织的直径小于3毫米为不合格愈伤组织，愈伤组织直径大于3毫米为合格。

(2)愈伤组织的颗粒散碎度

步骤(1)筛选完成后，筛选出大小合适的愈伤组织。颗粒散碎表示愈伤组织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不平滑。颗粒致密表示愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。

(3)愈伤组织的色泽

愈伤组织合格颜色应该为黄白色，黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是合格质量好的愈伤组织。

(4)愈伤组织的再分化能力

愈伤组织分化能力好坏取决于前面三点，大小适中、组织颗粒致密、硬度较高、颜色黄白色的愈伤组织具有很强的分化能力，分化出的愈伤组织也有很高的质量。否则愈伤组织分化能力弱，分化出来的愈伤组织质量也不好。

4、培养基配方筛选试验过程

(1)将草莓‘红颜’的花后果肉分别接种于附加不同浓度6-BA、NAA的改良MS培养基上研究不同配比的植物生长调节剂对草莓‘红颜’果肉愈伤组织诱导培养的影响，培养基的PH值为5.8。培养基中附加蔗糖(20g/L)、琼脂粉(6g/L)。具体的，每升MS培养基里含有：KNO₃硝酸钾1500mg/L、(NH₄)₂SO₄硫酸铵500mg/L、CO(NH₂)₂尿素200mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L、KI碘化钾1.1mg/L、MnSO₄·4H₂O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO₄·7H₂O七水合硫酸锌8mg/L、H₃BO₃硼酸5mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L、CaCl₂·2H₂O二水合氯化钙100mg/L、肌醇100mg/L、烟酸2mg/L、维生素B₁1mg/L、维生素B₆1mg/L、维生素C2mg/L。

表1不同的激素配比对‘红颜’果实愈伤组织的诱导的影响

从试验结果可以得知，培养基中添加6-BA和NAA的浓度分别是0.4mg/L和0.2mg/L时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密。颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率达到100％，是最合适的果实愈伤组织诱导激素配比。

(2)将草莓‘红颜’的三个不同生长时期：花后5-8天、15-18天、23-25、28-30的果肉分别接种于MS培养基、6-BA0.4mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉6g/L的培养基上研究不同的果实生长时期对草莓‘红颜’果实愈伤组织诱导的影响。

表2草莓果实的不同生长时期对‘红颜’果实愈伤组织的诱导的影响

果实的不同生长时期对愈伤组织的诱导有很大的影响，从试验结果可以看出，花后5～8天的果实比较容易诱导愈伤组织，诱导率达到100％。草莓在花后5～8天果实发育非常小，但是因为草莓果实整个发育期只有30-35天，因此，只能选择非常幼小的果实来培养愈伤组织，如果果实发育8天以后，愈伤组织都会长得非常疏松，不利于后期实验。

(3)将草莓‘红颜’的果肉接种于MS培养基、6-BA0.4mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉6g/L的培养基上，一部分在光照环境下培养，一部分在完全遮光的黑暗条件下培养，研究光照和暗培养对草莓‘红颜’果实愈伤组织诱导的影响。

表3果实的不同生长时期对‘红颜’果实愈伤组织的诱导的影响

果实的愈伤组织培养不同于叶片或者其他外植体愈伤组织，需要在完全黑暗的条件下培养，在试验中，如果按照我们平时普通外植体愈伤培养的条件培养果实愈伤，得到的愈伤不仅质量差，而且愈伤诱导率非常低。而在完全黑暗条件下培养的愈伤，诱导率可以达到100％，遇上质量也很好，因此，果实愈伤培养不需要光照。

Claims

1.一种草莓果实愈伤组织的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）草莓果实的无菌化处理

果实表面用流水冲洗干净，在无菌条件下，用75%的乙醇消毒2分钟后用无菌去离子水冲洗3次，然后用10%的次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗4~5次，然后用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去果皮，从果实中间切开，选取果心部分，用打孔器切直径0.5厘米的圆片接种于愈伤诱导培养基上；

（2）草莓果实的圆片培养

在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养5天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，这时在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤接种于培养基中进行愈伤组织增殖，培养10~15天以后，愈伤体积变为原来体积的3~4倍大小；

所述培养基为MS培养基，每升MS培养基中包括6-BA0.4mg/L、NAA0.2 mg/L、蔗糖20g/L、琼脂粉6g/L；每升MS培养基包括：KNO₃硝酸钾1500 mg/L、(NH₄)₂SO₄硫酸铵500 mg/L、CO(NH₂)₂ 尿素200 mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400 mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L、KI碘化钾1.1 mg/L、MnSO₄·4H₂O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO₄·7H₂O七水合硫酸锌8 mg/L、H₃BO₃硼酸5 mg/L、Fe-EDDHA 乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl₂·2H₂O二水合氯化钙100 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸2 mg/L、维生素B₁1mg/L、维生素B₆1 mg/L、维生素C2 mg/L。

2.根据权利要求1所述的草莓果实愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述培养基的PH值为5.8。

3.根据权利要求1所述的草莓果实愈伤组织的培养方法，其特征在于：选用生长时期为花后5~8天的草莓作为培养对象。