CN107173225A - 用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，在超净工作台中，用经过灭菌的解剖刀将叶柄剪成长度为1‑2cm的切段，接种到无菌培养基上，25℃下进行暗培养，该无菌培养基的配方为：MS+6‑BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L；在无菌条件下，将培养20天得到的愈伤转接到分化培养基上，光照强度1600lx，每天光照16小时，暗照8小时，该分化培养基的配方为：MS+2，4‑D 0.01mg/L+KT 1.0mg/L，得甘薯组培苗。本发明以叶柄为外植体，可以快速获得甘薯组培苗。实现了利用植物组织培养技术对甘薯进行快速繁殖和高产栽培，也为甘薯遗传转化提供了必要基础。

Description

用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)属于旋花科(Convolvulaceae)，一年生或多年生草质蔓性藤本植物。组织培养不受地点季节制约可连续快速繁殖，且操作简单用时短、成熟种苗根系发达质量高，能有效的降低生产成本和提高人员的生产效率。使其不再受到季节和产地的局限。

张玲等，使用叶片和茎尖做成外植体，叶片和茎尖对诱导结果的作用相差很大。用叶片可以达到95.69％。而茎尖的则为30.56％。两者相差很大。且叶片明显比茎尖有优势。周志林等，使用了茎段、叶片、叶柄作为实验部位进行实验。综合来说，茎段的分化能力最高，其次是叶片，之后是叶柄。朱爱科等，就愈伤诱导这一方面，研究出叶片和叶柄的出愈率是相同的，都为100％。这可能与甘薯的品种有关，研究品种较容易生成愈伤。且马苗鹏等用茎段、叶片、叶柄、茎尖为刺激部位进行比较。检测得到，最后能力强弱的排名是叶柄＞叶片＞茎尖＞茎段。

激素对于体外研究过程来说是一个不可或缺的条件。而且激素量的高低也有不同的效果。只有在激素浓度适宜时才会诱导出愈伤。徐茜等，用6-BA、NAA、2，4-D、KT、IAA适当的进行组合成7种组合的处理组，进行离体培养。在试验的几个诱导培养基中，都能产生出愈伤，而且能够保证可以达到100％的程度。刘春月等，以6-BA、NAA两种激素不同浓度的配比，通过大量试验研究，这样激素的使用更有利于愈伤的诱导，且生长情况良好，不易老化。

一般植物培养中较普通的就是先分化出芽，再在新芽幼茎的基部长出须根，从而慢慢长成完整的植株。而甘薯的分化跟其他植物有所不同，其先分化出根，再由根上慢慢发芽，生长壮大。因为先生根，对芽的分化会有抑制作用，所以，甘薯芽分化所需的时间会较长。张先云等，用枝条为外植体，选择3种激素进行组合的培养基，进行控制整个过程的实验。判断出了最佳搭配。最终，成为作用部位愈伤形成、分化和增殖的最适培养基。

无论在食品营养保健方面还是在纺织、饲料、能源方面，甘薯都具有不可忽视的重要作用。随着其需求量的不断增加，甘薯组织培养技术显得更加实用。组织培养以其适应性广、繁殖力强、栽培简便、成本低等优点，可以实现培养优良甘薯品种、生产无菌苗、建立快速繁殖体系。为优良甘薯的高效供应提供一大助力。如果这项技术可以应用到生活中，将会给我们的经济和生活带来巨大的冲击。它不仅可以获得更高的经济效益，还为环境的改善和城市的改造提供了帮助，为新品种的开发打下基础。现有技术条件下，甘薯愈伤组织的诱导及分化率较低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，显著提高了甘薯愈伤组织的诱导及分化率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，包括如下步骤：

S1、将甘薯幼苗的叶柄用75％的酒精溶液处理30秒，10％的NaClO溶液浸泡处理5分钟后，用0.1％HgCl₂溶液浸泡3分钟，无菌水冲洗；

S2、在超净工作台中，用经过灭菌的解剖刀将叶柄剪成长度为1-2cm的切段，接种到无菌培养基上，25℃下进行暗培养，该无菌培养基的配方为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L；

S3、在无菌条件下，将培养20天得到的愈伤转接到分化培养基上，光照强度1600lx，每天光照16小时，暗照8小时，该分化培养基的配方为：MS+2，4-D0.01mg/L+KT1.0mg/L，得甘薯组培苗。

本发明具有以下有益效果：

以叶柄为外植体，可以快速获得甘薯组培苗。实现了利用植物组织培养技术对甘薯进行快速繁殖和高产栽培，也为甘薯遗传转化提供了必要基础。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，包括如下步骤：

S1、将甘薯幼苗的叶柄用75％的酒精溶液处理30秒，10％的NaClO溶液浸泡处理5分钟后，用0.1％HgCl₂溶液浸泡3分钟，无菌水冲洗；

S2、在超净工作台中，用经过灭菌的解剖刀将叶柄剪成长度为1-2cm的切段，接种到无菌培养基上，25℃下进行暗培养，该无菌培养基的配方为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L；

S3、在无菌条件下，将培养20天得到的愈伤组织转接到分化培养基上，光照强度1600lx，每天光照16小时，暗照8小时，该分化培养基的配方为：MS+2，4-D 0.01mg/L+KT1.0mg/L，得甘薯组培苗；

S4、通过调节培养条件，保证使其与植物体的内部生长机制相协调，获得所需的试管苗；

S5、在适宜的温度、充足的光照、一定的湿度的前提下，将组织培养得到的试管苗炼苗三天后，移栽到花盆中进行培养，合理管理，即可成活。

实验例

培养基的配制：基本培养基为MS，培养基中激素加入量具体见表1。

表1甘薯愈伤诱导培养基激素组合

甘薯外植体消毒处理

甘薯幼苗叶柄用75％的酒精溶液处理30秒，10％的NaClO溶液浸泡处理5分钟后，用0.1％HgCl₂溶液浸泡3分钟，无菌水冲洗；

甘薯外植体接种及愈伤组织诱导

在超净工作台中，用经过灭菌的解剖刀将叶柄剪成长度为1-2cm的切段，接种到不同激素浓度的无菌培养基上。每瓶接种3个外植体，每组设置3个重复实验，25℃下进行暗培养；20天后统计，愈伤组织诱导结果表2。

表2激素对甘薯叶柄愈伤组织诱导影响

由上可知，相同外植体条件下，得到最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。

甘薯愈伤组织分化及芽的再生

在无菌条件下，将培养20天得到的最适诱导培养基生成的愈伤转接到分化培养基上(培养基激素配比见表3)。光照强度1600lx，每天光照16小时，暗照8小时。每种处理分别有5组重复。观察其分化情况，培养60天后统计根和芽的分化率，愈伤组织分化结果见表4。

表3分化培养基激素浓度组合

甘薯芽的分化比根要困难的多，在有根分化后30天，开始有芽的生成。其先分化出根，再由根上慢慢发芽，然后生长壮大。在分化培养基中，就激素组合来说(见表4)，B1、B2、B3、B7、B8、B9处理组都有芽的分化。以2，4-D、KT为组合的两组分化培养基上，芽分化率分别为26.7％、13.3％。芽由愈伤先发出的根上生成，再继续生长之后得到。且得到幼苗生长健康，不断成长壮大。结果显示，最佳的分化培养基为MS+2，4-D 0.01mg/L+KT 1.0mg/L。

表4分化培养基上激素对愈伤芽分化的影响

实施例

采用本申请的技术，以叶柄为外植体，获得甘薯组培苗已经在邯郸市禾下土种业有限公司种植基地大面积栽培，经济效益良好

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将甘薯幼苗的叶柄用75％的酒精溶液处理30秒，10％的NaClO溶液浸泡处理5分钟后，用0.1％HgCl₂溶液浸泡3分钟，无菌水冲洗；

S2、在超净工作台中，用经过灭菌的解剖刀将叶柄剪成长度为1-2cm的切段，接种到无菌培养基上，25℃下进行暗培养，该无菌培养基的配方为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；

S3、在无菌条件下，将培养20天得到的愈伤转接到分化培养基上，光照强度1600lx，每天光照16小时，暗照8小时，该分化培养基的配方为：MS+2，4-D 0.01mg/L+KT 1.0mg/L，得甘薯组培苗。