CN103250643B - 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唐古特白刺叶片再生植株方法，该方法包括以下步骤：选取白刺成年树优良品种的叶片为组织培养材料，表面灭菌后接入愈伤组织诱导培养基，待愈伤组织诱导出来以后建立悬浮培养体系进行愈伤组织的增殖，然后将悬浮培养后的小细胞团转入固体培养基上进行不定芽的诱导；不定芽诱导出来以后转入MS基本培养基上生长，待不定芽长到2～3cm时，转入诱导生根培养基培养，得生根试管苗。与现有技术中的白刺组培方法相比，本发明的白刺成年树叶片再生植株培养方法优势在于：有效解决了白刺优良成年树在组织培养条件下的植株再生问题，实现白刺稳定高效的组培体系，为加快白刺组培苗植株再生提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及唐古特白刺成年树叶片再生植株技术，具体涉及一种唐古特白刺无性系离体植株再生培养方法。
背景技术
白刺属在全世界范围内共有12种，而在我国内蒙、甘肃、青海、新疆、宁夏、辽宁等省区有齿叶白刺（N.roborowskii）、毛瓣白刺（N.praevisa）、泡果白刺（N.sphaerocarpa）、唐古特白刺（N.tangutorum）、西伯利亚白刺（N.sibirica）、盐生白刺（N.schoberi L.）和帕米尔白刺（N.pamirica）等7种。白刺属植物系第三纪孑遗植物，通常高0.5～2m，具有极强的抗干旱和耐盐碱能力，是荒漠戈壁地区植被生态系统的重要建群种之一，具有重要的生态、经济价值。白刺属耐高温干旱或重盐碱胁迫，抗风蚀沙埋、枝茎机械组织发达，近地面匍匐丛生，对多风环境具有良好的适应能力；萌生能力强，被沙土埋覆后能产生大量不定根，从而形成新的植株，形成白刺沙堆，可拦蓄和固定大量流沙。它们还是沙生植物中少有的药食两用的浆果类植物，其果实酸甜可口，富含各种氨基酸、维生素C、多种微量元素等各类生理活性物质，其中氨基酸、黄酮和糖总含量均高于沙棘，有非常好的开发利用前景。从其果实、叶片、幼枝、种子等提取的次生代谢物质（主要为黄酮类化合物）具有重要的药用价值，具有健脾胃、助消化和安神解表之功效，在食用、药用、保健等方面具有很大开发利用潜力。
唐古特白刺是适合在我国西北部沙漠地区干旱、盐碱环境条件下生长的重要树种，并且具有重要的经济价值。近年来随着荒漠化的治理改造的进行，良种种苗得到高度重视。关于白刺属植物的组织培养进行过初步的研究，本专利提供的方法适合唐古特白刺、泡果白刺等白刺属植物成年树的快速高效繁殖。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种唐古特白刺无性系离体植株再生培养方法，以实现提供周期短、效率高、成本低的唐古特白刺苗木的生产技术。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法，包括以下步骤：
（1）选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料，经清洗、消毒后接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为1/2MS＋2,4-D2mg·L-1＋BA0.2mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+水解酪蛋白（CH）1g·L-1+蔗糖3%，培养条件为23℃，暗培养，培养材料每25天继代培养一次；
（2）将愈伤组织接入继代增殖培养基进行继代增殖培养，诱导分化出不定芽，然后将不定芽转入MS培养基上进行伸长培养；其中，继代增殖培养基配方为3/4MS＋6BA0.3mg·L-1＋NAA0.02mg·L-1＋蔗糖3%；
（3）待不定芽长到2-3cm时，转入生根培养基，生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.5～2mg·L-1。
其中，步骤（1）操作完成后，直接进行以下操作，然后直接进行步骤（3）操作
1）当愈伤组织鲜重达到2g时，转入液体培养基中进行悬浮培养，将愈伤组织进行增殖并分散成小细胞团或单细胞；液体悬浮培养基以1/2MS为基本培养基，在其中添加植物生长调节剂和3%蔗糖；植物生长调节剂为2,4-D2mg·L-1、BA0.2mg·L-1；液体悬浮培养基中添加水解酪蛋白1g·L-1，天冬酰胺（ASN）200mg·L-1；液体培养条件为摇床转速90rpm，23℃，暗培养，液体材料每7天继代培养一次；
2）将步骤1）的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基，悬浮培养的单细胞或者小细胞团在不定芽诱导培养基上经过1个月的生长会产生不定芽；不定芽诱导培养基为MS+KT1mg·L-1＋BA1mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+蔗糖3%，培养条件为25℃，16h光培养，培养材料每25天继代培养一次；经过1-2次继代培养后，培养细胞再分化为不定芽；不定芽生长在MS基本培养基上进行，添加30g·L-1蔗糖。
所述新枝条的叶片的清洗、消毒方法为：经流水冲洗2h，70%乙醇处理1min，0.1%HgCl处理10min，即可。
有益效果：与现有技术相比，本发明的唐古特白刺无性系离体植株再生培养方法，有效解决了白刺优良成年树在组织培养条件下的植株再生问题，实现白刺稳定高效的组培体系，提供大量唐古特白刺种植材料，缓解社会对唐古特白刺苗木的紧迫需求，为加快白刺组培苗植株再生提供技术支撑。是一种周期短、效率高、成本低的良种苗木的生产技术，具有很好的实用性。
附图说明
图1由唐古特白刺叶片诱导的愈伤组织图；
图2从愈伤组织上产生不定芽；
图3不定芽的生长；
图4唐古特白刺的生根图。
具体实施方式
下面结合具体实施例最本发明做进一步的说明。
实施例1
一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法，包括以下步骤：
（1）选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料，经流水冲洗2h，70%乙醇处理1min，0.1%HgCl处理10min后接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中，愈伤组织诱导培养基配方为1/2MS＋2,4-D2mg·L-1＋BA0.2mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+水解酪蛋白（CH）1g·L-1+蔗糖3%。培养条件为23℃，暗培养，培养材料每25天继代培养一次，一般培养10天后叶片脱分化形成愈伤组织，如图1所示。
（2）继代增殖培养基进行继代增殖培养，诱导分化出不定芽，然后将不定芽转入MS培养基上进行伸长培养；其中，继代增殖培养基配方为3/4MS＋6BA0.3mg·L-1＋NAA0.02mg·L-1＋蔗糖3%；
（4）不定芽生长在MS基本培养基上进行，添加30g·L-1蔗糖，16h光照/8h暗培养，如图3所示；
（5）待不定芽长到2-3cm时，转入生根培养基，生根培养基为1/2MS，添加植物生长调节剂，为IBA0.5～2mg·L-1。生根培养在光照条件下进行（16h光照/8h暗培养），培养20天后有健康根系长出，唐古特白刺的生根图，如图4所示。
生根后，进行常规培养，即可实现植株的再生和培育成苗。
实施例2
一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法，包括以下步骤：
（1）选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料，经流水冲洗2h，70%乙醇处理1min，0.1%HgCl处理10min后接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中，愈伤组织诱导培养基配方为1/2MS＋2,4-D2mg·L-1＋BA0.2mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+水解酪蛋白（CH）1g·L-1+蔗糖3%。培养条件为23℃，暗培养，培养材料每25天继代培养一次，如图1所示。
（2）步骤（1）的愈伤组织鲜重达到2g时，转入液体培养基中进行悬浮培养，将愈伤组织进行增殖并分散成小细胞团或单细胞；液体悬浮培养基以1/2MS为基本培养基，在其中添加植物生长调节剂和3%蔗糖；植物生长调节剂为2,4-D2mg·L-1、BA0.2mg·L-1；液体悬浮培养基中添加水解酪蛋白1g·L-1，天冬酰胺（ASN）200mg·L-1；液体培养条件为摇床转速90rpm，23℃，暗培养，液体材料每7天继代培养一次。
（3）步骤（2）的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基，悬浮培养的单细胞或者小细胞团在不定芽诱导培养基上经过1个月的生长会产生不定芽；不定芽诱导培养基为MS+KT1mg·L-1＋BA1mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+蔗糖3%，培养条件为25℃，16h光培养，培养材料每25天继代培养一次；经过1-2次继代培养后，培养细胞再分化为不定芽，如图2所示。
（4）不定芽生长在MS基本培养基上进行，添加30g·L-1蔗糖，16h光照/8h暗培养，如图3所示；
（5）待不定芽长到2-3cm时，转入生根培养基，生根培养基为1/2MS，添加植物生长调节剂，为IBA0.5～2mg·L-1。唐古特白刺的生根图，如图4所示。
生根后，进行常规培养，即可实现植株的再生和培育成苗。
Claims (2)
1.一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料，经清洗、消毒后接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为1/2MS＋2,4-D 2mg·L-1＋BA 0.2mg·L-1＋NAA0.2mg·L-1+水解酪蛋白1 g·L-1+蔗糖3%，培养条件为23℃，暗培养，培养材料每25天继代培养一次；
（2）当愈伤组织鲜重达到2g时，转入液体培养基中进行悬浮培养，将愈伤组织进行增殖并分散成小细胞团或单细胞；液体悬浮培养基以1/2MS为基本培养基，在其中添加植物生长调节剂和3%蔗糖；植物生长调节剂为2,4-D 2mg·L-1、BA 0.2mg·L-1；液体悬浮培养基中添加水解酪蛋白1 g·L-1，天冬酰胺200 mg·L-1；液体培养条件为摇床转速90rpm，23℃，暗培养，液体材料每7天继代培养一次；
（3）将步骤（2）的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基，悬浮培养的单细胞或者小细胞团在不定芽诱导培养基上经过1个月的生长会产生不定芽；不定芽诱导培养基为MS+KT 1mg·L-1＋BA 1mg·L-1＋NAA0. 2mg·L-1+蔗糖3%，培养条件为25℃，16h光培养，培养材料每25天继代培养一次；经过1-2次继代培养后，培养细胞再分化为不定芽；不定芽生长在MS基本培养基上进行，添加30 g·L-1蔗糖；
（4）待不定芽长到2-3cm时，转入生根培养基，生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.5~2mg·L-1。
2.根据权利要求1所述的唐古特白刺无性系离体生根培养方法，其特征在于：所述新枝条的叶片的清洗、消毒方法为：经流水冲洗2h，70%乙醇处理1min，0.1% HgCl2处理10min，即可。
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| 范小峰等.唐古特白刺愈伤组织诱导及再生体系的研究.《西北师范大学学报(自然科学版)》.2009,第45卷(第2期), * |
| 郭晔红等.唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究.《草业学报》.2009,第18卷(第6期), |
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| CN103250643A (zh) | 2013-08-21 |
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