CN104737916A

CN104737916A - 一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法

Info

Publication number: CN104737916A
Application number: CN201510185366.5A
Authority: CN
Inventors: 丁之恩; 孙雨薇; 丁昱; 魏芬; 陆小雨; 袁艳
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-04-17
Also published as: CN104737916B

Abstract

本发明公开了一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，并具体公开了西洋参根尖愈伤组织诱导培养、继代培养和悬浮培养相关因素及组合配比；与现有技术相比，本发明所述的方法避免了因培养条件的改变导致皂甙含量的变化，使其能够稳定生产人参皂甙；同时，本发明操作简单、容易控制、方法可靠，通过对培养条件的控制，还能够实现总皂甙与单体皂甙的定向培育，为西洋参皂甙的工业化生产提供了理论依据和技术指导，对资源深度开发利用具有深远的意义。

Description

一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法

技术领域

本发明涉及的是一种天然产物领域，尤其涉及的是一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法。

背景技术

西洋参(Panax quinquefolium)系五加科人参属多年生草本植物。西洋参是生长于北美原始森林中的古老植物，具有“活化石”之称，是一种名贵的中药，药用和经济价值颇高。我国自20世纪80年代成功大面积引种西洋参以来，已发展成为继美国、加拿大后世界第三大西洋参生产国和世界第一大消费国。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，以补益为主，可滋阴降火、益气生津。服用方法分为煮、炖、蒸食、切片含化、研成细粉冲服等。西洋参中含有皂甙、多糖、黄酮类、挥发油、微量元素等丰富的生物活性物质，对人体，在免疫调节、抗癌、抗衰老等方面具有独特效果，因此常用于保健品开发利用。

无论野生或人工栽培西洋参，因自身生理特性，生长缓慢，大多需4至6年才能收获入药。并且，西洋参种子培养时间长，资源稀少，价格昂贵。因此，开展西洋参细胞培养技术研究，利用西洋参细胞悬浮培养的方法生产人参皂甙，即，工厂化生产皂甙，具有十分重要的现实意义和商业价值。

西洋参细胞培养是指在无菌条件下，将离体的西洋参器官(如，根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织、细胞、胚胎、原生质体，等材料，在人工调控的培养基上，给予适宜的条件，诱导此产生愈伤组织或潜伏芽，或生长成完整植株的方法。

西洋参皂甙的生产主要是种植西洋参，需要选择特定的气候、生态和土壤环境条件，并且在保护地条件下生长，一般需要4～5年才可以收获。然后，利用种植的西洋参根直接使用，或将根、叶等器官作为原料，提取分离其中的皂甙类化合物。这种方法周期长，需用土地，对栽培条件，环境条件要求严格。现有技术中，也有利用西洋参果实发酵方法生产或富集西洋参总皂甙，主要是利用酵母菌发酵时产生酶的作用，这种方法，可以增加总皂甙的量，但并不属于真正意义上的“生产”，而且该方法无法“定向”生产皂甙。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，以提供一种能够稳定生产人参皂甙，并能够定向生产总皂甙和单体皂甙的西洋参悬浮细胞。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，包括以下步骤：

(1)无菌条件下，取西洋参根尖组织，将其形态学上的下端接种至诱导培养基上，然后置于暗箱中进行愈伤组织诱导培养，获得致密型愈伤组织，所述诱导培养基的配方为：在MS基础培养基中加入1.5～2.5mg/L的2，4-D和0.5～1.0mg/L的6-BA，灭菌前调节pH至4.5～5.8；

(2)将步骤(1)的致密型愈伤组织转移至继代培养基中，然后置于暗箱中进行继代培养，获得疏松型愈伤组织，所述继代培养基的配方为：在MS基础培养基中加入1.5～2.5mg/L的2，4-D和0.5～1.0mg/L的6-BA，调节蔗糖浓度为20～30g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8；

(3)将步骤(3)的疏松型愈伤组织转移至悬浮培养基中，置于自然光照下振荡悬浮培养，获得悬浮细胞，所述悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.8～1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的激动素KT、0.3～0.5mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA、调节蔗糖浓度为20～30g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，此时，该悬浮细胞中的总皂甙的含量最高，单体皂甙的含量较少；

(4)调节步骤(3)的悬浮培养基的激素配方，将步骤(3)的悬浮细胞进行进一步的定向培养，其中：

总皂甙定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.7～1.2mg/L的2，4-D、0.1～0.3mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.4～0.8mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20～30g/L，获得富含总皂甙的悬浮细胞；

单体皂甙Rg1定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.5～1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的KT、0.5～1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20～30g/L，获得富含单体皂甙Rg1的悬浮细胞；

单体皂甙Rh1定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.8～1.0mg/L的2,4-D、0.1mg/L的KT、0.5～1.0mg/L的6-BA、0.8～1.0mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20～30g/L，获得富含单体皂甙Rh1的悬浮细胞。

所述步骤(1)中，西洋参根尖组织的无菌处理步骤为：

步骤一：将西洋参根尖先用清水清洗，再用质量比为0.1～0.3％洗衣粉漂洗，毛刷刷除表面泥土，流水冲洗1～2h；

步骤二：将西洋参根尖转移至无菌室中，先用体积比为75％的酒精浸泡消毒20～30min，再用体积比为0.1％的升汞浸泡消毒10～20s；

步骤三：重复步骤二的消毒步骤1次以上。

所述步骤(1)中，将西洋参根尖组织切成厚度为0.1～0.2mm的薄片，再接种至诱导培养基上。

所述步骤(2)中，继代培养的周期为15天。

所述步骤(3)中，悬浮培养的周期为20～25天。

所述步骤(4)中，定向培养的周期为20～25天。

所述步骤(1)～(4)中，培养的温度为18～27℃，所述步骤(3)中，振荡的转速为110～140rpm。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，该方法公开了西洋参根尖愈伤组织诱导、继代培养和悬浮培养相关因素及组合配比，避免了因培养条件的改变导致皂甙含量的变化，利用该方法能够稳定生产人参皂甙，生产周期短；通过对培养条件的控制，还能够实现总皂甙与单体皂甙的定向培育，为西洋参皂甙的工业化生产提供了理论依据和技术指导；本发明操作简单、容易控制、方法可靠，为西洋参细胞培养技术的工业化生产提供了理论依据，为西洋参资源有效利用开辟了新途径，其定向培育计数，能够获得定向活性物质，对资源深度开发利用具有深远的意义。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、材料

1.1、诱导培养基的配方：

在MS基础培养基中加入1.5mg/L的2，4-D和0.5mg/L的6-BA，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

1.2、继代培养基的配方：

在MS基础培养基中加入1.5mg/L的2，4-D和0.5mg/L的6-BA，调节蔗糖浓度为20g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

1.3、悬浮培养基的配方：

在MS基础培养基中加入0.8mg/L的2，4-D、0.1mg/L的激动素KT、0.3mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、调节蔗糖浓度为20g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌。

2、方法

(1)消毒：取西洋参植株的主根根尖，清洗后，用质量比为0.1％洗衣粉漂洗，毛刷刷除表面泥土，流水冲洗1h；然后，将主根根尖转移至无菌室中，先用体积比为75％的酒精浸泡消毒20min，再用体积比为0.1％的升汞浸泡消毒10s，交替重复消毒2次；

(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)消毒后的主根根尖切成厚度为0.1～0.2mm的薄片，将其形态学上的下端接种至诱导培养基上，每瓶诱导培养基中接种5个主根根尖片段，在18～27℃下，置于暗箱中进行愈伤组织诱导培养，获得致密型愈伤组织；

(3)愈伤组织继代培养：将步骤(2)的致密型愈伤组织转移至继代培养基中，每瓶几代培养基中接种2～3g致密型愈伤组织，在18～27℃下，置于暗箱中进行继代培养，获得疏松型愈伤组织，其中，继代培养的周期为15天；

(4)悬浮培养：将步骤(3)的疏松型愈伤组织转移至悬浮培养基中，其中，每30mL的悬浮培养基接种0.75g的疏松型愈伤组织，然后，置于自然光照下，在18～27℃，转速为110～140rpm的条件下进行悬浮培养，所述悬浮培养的周期为20天，获得悬浮细胞；

(5)定向培养：调节悬浮培养基的激素配方，将步骤(4)的悬浮细胞做进一步的总皂甙和单体皂甙的定向培养，其中：

总皂甙定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.7mg/L的2，4-D、0.1mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20g/L，培养20天，获得富含西洋参总皂甙的悬浮细胞；

单体皂甙Rg1定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.5mg/L的2，4-D、0.1mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20g/L，培养20天，获得富含西洋参单体皂甙Rg1的悬浮细胞；

单体皂甙Rh1定向培养的悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.8mg/L的2,4-D、0.1mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.8mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为20g/L，培养20天，获得富含西洋参单体皂甙Rh1的悬浮细胞。

利用HPLC技术分别测定定向培养前的悬浮细胞、三种定向培养获得的悬浮细胞中皂甙的含量，结果如下表1所示，表中的百分比均指的是重量百分比：

表1：悬浮细胞中皂甙含量测定结果

从表1中可以看出，利用西洋参的根尖组织，可以稳定生产出西洋参皂甙；定向培养前，悬浮细胞中已经有大量的总皂甙富集；通过调节悬浮培养基中的激素条件，悬浮细胞中的不同种类的皂甙含量发生定向富集，从而实现总皂甙、单体皂甙Rg1或单体皂甙Rh1的定向生产。

实施例2

本实施例中，培养基配方为：

1)诱导培养基的配方：

在MS基础培养基中加入2.5mg/L的2，4-D和1.0mg/L的6-BA，，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

2)继代培养基的配方：

在MS基础培养基中加入2.5mg/L的2，4-D和1.0mg/L的6-BA，调节蔗糖浓度为30g/L，灭菌前调节pH至5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

3)悬浮培养基的配方：

在MS基础培养基中加入1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的激动素KT、0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、调节蔗糖浓度为30g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌。

4)总皂甙定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入1.2mg/L的2，4-D、0.3mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.8mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为30g/L，培养25天，获得富含西洋参总皂甙的悬浮细胞；

5)单体皂甙Rg1定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的KT、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为30g/L，培养25天，获得富含西洋参单体皂甙Rg1的悬浮细胞；

6)单体皂甙Rh1定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入1.0mg/L的2,4-D、0.1mg/L的KT、1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为30g/L，培养25天，获得富含西洋参单体皂甙Rh1的悬浮细胞。

其它步骤同实施例1，获得定向培养前的悬浮细胞和三种定向培养的悬浮细胞，利用HPLC技术分别测定悬浮细胞中皂甙的含量，结果如下表2所示，表中的百分比均指的是重量百分比：

表2：悬浮细胞中皂甙含量测定结果

实施例3

本实施例中，培养基配方为：

1)诱导培养基的配方：

在MS基础培养基中加入2.0mg/L的2，4-D和1.0mg/L的6-BA，，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

2)继代培养基的配方：

在MS基础培养基中加入2.0mg/L的2，4-D和1.0mg/L的6-BA，调节蔗糖浓度为25g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌；

3)悬浮培养基的配方：

在MS基础培养基中加入0.9mg/L的2，4-D、0.1mg/L的激动素KT、0.4mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、调节蔗糖浓度为25g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8，用150mL的三角瓶分装，每瓶分装30mL，灭菌。

4)总皂甙定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入1.0mg/L的2，4-D、0.2mg/L的KT、0.5mg/L的6-BA、0.6mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为25g/L，培养20天，获得富含西洋参总皂甙的悬浮细胞；

5)单体皂甙Rg1定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入0.75mg/L的2，4-D、0.1mg/L的KT、0.75mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为25g/L，培养20天，获得富含西洋参单体皂甙Rg1的悬浮细胞；

6)单体皂甙Rh1定向培养的悬浮培养基的配方为：

在MS基础培养基中加入0.9mg/L的2,4-D、0.1mg/L的KT、0.75mg/L的6-BA、0.9mg/L的NAA，调节蔗糖浓度为25g/L，培养25天，获得富含西洋参单体皂甙Rh1的悬浮细胞。

其它步骤同实施例1，获得定向培养前的悬浮细胞和三种定向培养的悬浮细胞，利用HPLC技术分别测定悬浮细胞中皂甙的含量，结果如下表3所示，表中的百分比均指的是重量百分比：

表3：悬浮细胞中皂甙含量测定结果

Claims

1.一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)将步骤(2)的疏松型愈伤组织转移至悬浮培养基中，置于自然光照下振荡悬浮培养，获得悬浮细胞，所述悬浮培养基的配方为：在MS基础培养基中加入0.8～1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的激动素KT、0.3～0.5mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA、调节蔗糖浓度为20～30g/L，灭菌前调节pH至4.5～5.8；

2.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，西洋参根尖组织的无菌处理步骤为：

步骤三：重复步骤二的消毒步骤1次以上。

3.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将西洋参根尖组织切成厚度为0.1～0.2mm的薄片，再接种至诱导培养基上。

4.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，继代培养的周期为15天。

5.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，悬浮培养的周期为20～25天。

6.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中，定向培养的周期为20～25天。

7.根据权利要求1所述的一种生产西洋参皂甙的悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤(1)～(4)中，培养的温度为18～27℃，所述步骤(3)中，振荡的转速为110～140rpm。