CN109220790B - 一种红果参离体外繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红果参离体外繁方法，首先进行愈伤组织诱导，将消毒灭菌处理后红果参外植体接种于MS基本培养基A中培养后有愈伤组织出现，将愈伤组织切割转接至MS基本培养基B中培养，愈伤组织不断增殖，且表面分化出丛生芽，将丛生芽切割转接至MS基本培养基C中；将丛生芽按40d的生长周期轮流接入MS基本培养基B与MS基本培养基C，作为红果参丛生芽分化和增殖的培养方式，反复继代增殖3～4代，得到种苗；取种苗中高3‑4cm的健壮主苗接种于MS基本培养基D中培养获得苗壮根粗的生根苗；取生根苗置于室温下炼苗移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得生根移栽苗。本发明的有益效果是红果参繁殖方法成本低、繁殖周期短、质量和成活率高。
Description
技术领域
本发明属于中草药繁殖技术领域，涉及一种红果参离体外繁方法。
背景技术
红果参学名长叶轮钟草[Campanumoealancifolia(Roxb.)Merr.]，为桔梗科(Campanulaceae)金钱豹属(Campanumoea)多年生植物，别名肉算盘、山荸荠，主要分布在东南亚部分国家，在我国仅产长江以南的部分地区，生长于海拔300～1800m的草坡、沟边或林中，为药食两用植物，同时也具有很强的观赏性。红果参以根入药，味甘、微苦、性平，具有补虚益气，祛痰止痛的功效，主治劳倦气虚乏力，跌打损伤，肠绞痛等。红果参果实亦可食用，主含多糖、天然纤维、粗蛋白、粗脂肪和矿质素等，多糖含量高达45.80％，其多糖能很好的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，对油脂的氧化有明显的抑制作用。
红果参通常以种子为繁殖单位，但其种子苗生长缓慢、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化(基因型背景一致)种植和优质品种的大面积推广。因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大红果参种苗的繁殖量，进行红果参高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红果参离体外繁方法，解决了红果参种子苗生长缓慢、并受到萌发季节的限制，难以进行规模化繁殖的问题。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：愈伤组织诱导
将消毒灭菌处理后红果参外植体接种于MS基本培养基A中：
MS基本培养基A配方如下
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行愈伤组织诱导，培养15d后有愈伤组织出现，质地紧密，颜色翠绿，30d后愈伤组织膨大；
步骤2：丛芽发生和增殖同步培养
将步骤1中培养的愈伤组织切割为0.5～1.0cm2大小，转接至MS基本培养基B中：
MS基本培养基B配方
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养10d后愈伤组织不断增殖，且表面分化出丛生芽，待丛生芽生长旺盛时，将丛生芽切割为3～5芽一丛转接至MS基本培养基C中；
MS基本培养基C配方
蔗糖 30000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.4～5.8
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在20±1℃的条件下，丛生芽生长良好；
步骤3：将丛生芽按40d的生长周期轮流接入MS基本培养基B与MS基本培养基C，作为红果参丛生芽分化和增殖的培养方式，反复继代增殖3～4代，得到增殖苗；
步骤4：取种苗中高3-4cm的健壮主苗接种于MS基本培养基D中：
MS基本培养基D配方
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养30d获得苗壮根粗的生根苗；
步骤5：取6-8cm高的生根苗置于室温下炼苗7d后，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1-0.2％的多菌灵溶液中消毒2-3min，后移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，保持温度在20～25℃左右、湿度在75％～95％之间，生长30d后，即得生根移栽苗。
进一步，步骤1中消毒灭菌处理方法为：先用自来水清洗表面的泥土和灰尘，再放到流水下冲洗2h后，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒60s，再用质量百分比为0.1％的HgCl2灭菌6min，最后用无菌水冲洗若干次后放在无菌滤纸上吸干表面水分，最终得到消毒灭菌处理的外植体。
进一步，步骤1中红果参外植体为生长健壮的野生植株带芽茎段，按1.5-2.0cm长度切取。
本发明的有益效果是红果参繁殖方法成本低、繁殖周期短、质量和成活率高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下第3-5节茎段，用手术刀切割为约2-3cm长。
2、将1步骤的带芽茎段先用自来水清洗表面的泥土和灰尘，再放到流水下冲洗2h后，置于超净工作台上用75％(体积比)酒精消毒60s，再用0.1％HgCl2(质量比)灭菌6min，最后用无菌水冲洗8次后放在无菌滤纸上吸干表面水分。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、愈伤组织诱导：将经过2步骤消毒灭菌好的带芽茎段为材料，切割为1.5-2.0cm长，接入下列MS基本培养基A中：
在光照度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度控制在21℃的条件下，外植体培养15d后有愈伤组织出现，质地紧密，颜色翠绿，30d后愈伤组织膨大。
4、丛芽发生和增殖同步培养：将步骤3中培养的愈伤组织转入MS基本培养基B中：
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，培养10d后愈伤组织不断增殖，且表面分化出丛生芽。
5、优化培养：将步骤4中培养的丛生芽切割为3～5芽一丛转接至MS基本培养基C中。
蔗糖 30000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，且丛生芽生长良好。
6、将丛生芽丛按40d的生长周期轮流接入MS基本培养基B与MS基本培养基C，各培养40d，得到种苗，平均繁殖系数亦达12.0以上；在本步骤中可大量繁殖至生产所需的种苗基数。
7、取6步骤种苗中高3-4cm的健壮主苗接种于MS基本培养基D中：
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，培养30d后获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。
8、炼苗和移栽：取7步骤长至6cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗7d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，保持温度在20℃左右、湿度在85％％生长30d后，即得移栽苗，成活率可达96％。
本发明提供的红果参繁殖方法成本低、繁殖周期短、质量和成活率高，这种能将优良性状固定下来的无性繁殖方法可以用来扩大红果参种苗的繁殖量，进行红果参高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。本发明优点还在于：
1、用组织培养技术在培养室内好可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。
2、实现了高效快繁的目的，35-45d为一个培养周期，繁殖系数可达12.0以上。3、解决了红果参快速繁殖中愈伤组织多样且难以分化丛芽的问题，提高了种苗质量。
4、解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题，通过本发明，可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗。
5、对红果参快速繁殖体系进行了优化，轮流使用丛生芽诱导与增殖培养基和空白MS培养基，以丛生芽诱导与增殖培养基同时进行丛芽发生和增殖培养，以空白培养基保持丛芽分化，获得丛芽的快速增殖。整个快速繁殖过程所需培养基简单，完全解决了从愈伤组织、丛芽发生和增殖以及生根问题，利于安排生产计划。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种红果参离体外繁方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下第3-5节茎段，用手术刀切割为约2-3cm长；
2、将1步骤的带芽茎段先用自来水清洗表面的泥土和灰尘，再放到流水下冲洗2h后，置于超净工作台上用75％(体积比)酒精消毒60s，再用0.1％HgCl2(质量比)灭菌6min，最后用无菌水冲洗8次后放在无菌滤纸上吸干表面水分， 在整个消毒过程中充分摇动器皿；
3、愈伤组织诱导：将经过2步骤消毒灭菌好的带芽茎段为材料，切割为1.5-2.0cm长，接入下列MS基本培养基A中：
在光照度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度控制在21℃的条件下，外植体培养15d后有愈伤组织出现，质地紧密，颜色翠绿，30d后愈伤组织膨大；
4、丛芽发生和增殖同步培养：将步骤3中培养的愈伤组织转入MS基本培养基B中：
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，培养10d后愈伤组织不断增殖，且表面分化出丛生芽；
5、优化培养：将步骤4中培养的丛生芽切割为3～5芽一丛转接至MS基本培养基C中，
蔗糖 30000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，且丛生芽生长良好；
6、将丛生芽丛按40d的生长周期轮流接入MS基本培养基B与MS基本培养基C，各培养40d，得到种苗，平均繁殖系数亦达12.0以上；在本步骤中可大量繁殖至生产所需的种苗基数；
7、取6步骤种苗中高3-4cm的健壮主苗接种于MS基本培养基D中：
在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在21℃的条件下，培养30d后获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％；
8、炼苗和移栽：取7步骤长至6cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗7d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，保持温度在20℃左右、湿度在85％生长30d后，即得移栽苗。
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