CN101861797B - 一种离褶伞菌液体菌种的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种离褶伞菌液体菌种规模化生产方法。将野外收集的离褶伞菌(Lyophyllum Karst)子实体通过组织分离方法获得纯菌株，再纯化得到离褶伞母种，使用固化和液体培养基制备母种，使用液体培养基按照液体菌种培养方法进行离褶伞菌丝体的发酵培养，规模化生产离褶伞原种和栽培种。具有成本低、易实现、可广泛地应用于离褶伞的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南离褶伞菌的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南离褶伞菌丝体发酵培养，实现离褶伞自然资源的可持续利用。

Description

一种离褶伞菌液体菌种的培养方法

技术领域

本发明属于野生食用菌驯化栽培技术领域，特别是一种离褶伞菌(Lyophyllum Karst)液体菌种的培养方法。

技术背景

离褶伞菌隶属于担子菌门(Basidomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、离褶伞属(Lyophyllum Karst)，包括：荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)，簇生离褶伞(Lyophyllum aggregatum)，玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji)，灰离褶伞(Lyophyllum cinerascens)，烟色(褐)离褶伞(Lyophyllum fumosum)，黑离褶伞(Lyophyllum cabonarium)，墨染离褶伞、墨色离褶伞(Lyophyllum semitale)，角孢离褶伞(Lyophyllum trigonosporum)，角孢离褶伞、角形离褶伞(Lyophyllum transforme)等。属于味道鲜美、营养丰富，具有很高药用价值的名贵野生菌类。具有抗氧化、溶血栓、增强人的免疫力等功效。是一类最有开发研究价值和利用前景的珍稀菌类。不仅价值极高，而且具有驯化栽培、种质创新、产业化发展的条件。其中最负盛名的就是云南省大理州宾川县佛教圣地鸡足山特有的一种珍贵野生食用菌“鸡山冷菌”，鸡山冷菌味之佳美，超过任何一种食用菌，食用价值远远超过松茸、羊肚菌、牛肝菌等，堪称菌类之冠，品位很高。但此菌自然产量很低，据调查统计，鸡足山地区鸡山冷菌的自然产量鲜菇每年不超过1500公斤，市场上较为少见，价值很高。对采集到的不同生态位的很多个鸡山冷菌样品进行ITS(Internal Transcribed Spacers)序列比对，结合形态解剖学分类，鉴定结果表明鸡山冷菌隶属于荷叶离褶伞(Lyophyllumdecastes)、簇生离褶伞(Lyophyllum aggregatum)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimej)和褐离褶伞(Lyophyllum fumosum)。鸡山冷菌是目前国内市场销售价格最高的为数不多的几种野生菌之一。经测试分析，鸡山冷菌含18种氨基酸，还富含钙、铁、磷、锌、蛋白质、脂肪、维生素、蘑菇多糖等多种营养成份，尤其多糖含量达3.10％，比韩国、日本灵芝高一倍。可治多种疾病，如心脑血管病、高血压病、糖尿病等，还可以提高人体的免疫功能，抑制癌细胞的生长，具有很高的药用价值、经济价值、保健价值。是一种很有开发价值和利用前景的珍稀菌类。我国的离褶伞菌的生产以野生为主，随着需求量不断增加，野生离褶伞食用菌遭到了掠夺性采集，野生产量逐年下降，有的几近绝迹。驯化栽培已是迫在眉睫，所幸的是我国食用菌工作者对离褶伞属驯化栽培日渐关注，上述离褶伞菌目前已有荷叶离褶伞人工栽培获得了子实体，其他种类离褶伞菌通过半人工栽培或者人工促繁可以有效提高产量。现实存在的的关键技术问题之一就是优质菌株的筛选和菌种的规模化培育。由于离褶伞菌的生境和生物学特性所限，不仅优质菌株的筛选困难，已经获得的优质菌株在人工条件下生长缓慢，采用传统的固体发酵方法培育菌种往往周期长或难于生长。制约了离褶伞菌的可持续利用和产业化发展。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于筛选到离褶伞菌的优质菌株并提供一种新的栽培离褶伞菌的液体菌种规模化培养方法，该方法能快速地进行离褶伞菌丝体的液体发酵培养，解决了离褶伞菌的人工栽培、半人工栽培和人工促繁的菌种供应问题。

本发明的离褶伞菌液体菌种规模化生产方法是，将野外收集的离褶伞菌(LyophyllumKarst)子实体通过组织分离方法获得纯菌株，将野外获得的纯菌株再经过纯化，得到在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速，在液体培养基内生长快速、菌丝体呈明显的絮棉状或者碎屑状的离褶伞母种。用液体培养基对离褶伞母种进行离褶伞菌丝体的发酵培养，规模化生产离褶伞原种和栽培种。具有成本低、易实现、可广泛地应用于离褶伞的大规模人工生产中。

本发明的离褶伞液体菌种规模化生产方法包括母种的来源(获得)，固化和液体母种制备、液体原种的制备、液体栽培种的制备。具体如下：

1、将野外收集的离褶伞菌子实体通过组织分离方法获得纯菌株；将该纯菌株经过纯化、多代选择，得到在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速，在液体培养基内生长快速、菌丝体呈明显的絮棉状或者碎屑状的离褶伞菌母种；

2、用液体或固化培养基配制扩大母种：

A、母种液体摇瓶种子培养：将分离纯化的离褶伞纯菌株挑取米粒大小的5-10块接入装有150-300mL母种液体培养基的500mL摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体母种；

B、固化母种扩繁培养：将分离纯化的离褶伞纯菌株挑取米粒大小的3-5块转接入含有母种固化培养基的250mL三角瓶上，接种块间距2厘米左右，在15-25℃条件下培养20天左右菌落基本相连接即成为成熟固化母种；

上述步骤A中母种液体培养基组成为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，蛋白胨2g，酵母膏2g，水1000mL组成，pH自然；步骤B中的母种固化培养基是在上述液体培养基的基础上再添加琼脂15-20g配制而成。

3、原种液体摇瓶种子培养：

A、在500mL摇瓶中装入150-300mL液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比5-10％的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种。

B、在500mL摇瓶中装入150-300mL原种液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种3-5瓶500mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种。

原种液体培养基组成为：糖类25g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，蛋白胨2g，酵母粉2g，水1000mL组成，pH自然。

4、栽培种发酵罐培养

严格按无菌操作，以发酵培养基体积百分比5-10％的接种量把成熟液体原种接入装有100-150升无菌发酵培养基的总容积为200升的种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度15-25℃，通气量1∶0.4-0.8V/V·min，搅拌速度60-160转/分钟，保持罐压0.03-0.10MPa，经过10-15天通气培养，达到对数生长期即可。

栽培种发酵培养基组成为：淀粉30g，蔗糖20g，葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL组成，pH自然。

本发明中离褶伞菌菌种为野外采集分离纯化筛选获得，包括：荷叶离褶伞(Lyophyllumdecastes)，簇生离褶伞(Lyophyllum aggregatum)，玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji)，灰离褶伞(Lyophyllum cinerascens)，烟色(褐)离褶伞(Lyophyllum fumosum)，黑离褶伞(Lyophyllum cabonarium)，墨染离褶伞、墨色离褶伞(Lyophyllum semitale)，角孢离褶伞(Lyophyllum trigonosporum)，角孢离褶伞、角形离褶伞(Lyophyllum transforme)。

采用本发明筛选的菌株和工艺培养离褶伞菌种可以快速和规模化培养，与传统的固体发酵方式培养菌种相比，培养基的配方简单，降低了生产成本，离褶伞菌液体菌种在此条件下生长良好，极大地缩短了菌种培养时间。本发明工艺生产的菌丝体在液体状态下主要是依靠断裂的菌丝体片段作为新的生长点，在此基础上培养获得大量菌丝。由于采用处于对数生长期的强壮菌种，保证了菌种接种后的及时萌发和定植生长，能有效形成生长优势保证发菌质量，解决了离褶伞菌人工栽培、半人工栽培和人工促繁过程中的一些关键技术问题。具有成本低、易实现、可广泛地应用于离褶伞的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南离褶伞菌的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南离褶伞菌丝体发酵培养，实现离褶伞自然资源的可持续利用。

具体实施方式

实施例1：

1鸡山冷菌原始母种的取得：取秋冬季产于云南省宾川县鸡足山海拔2000米以上地带的新鲜鸡山冷菌子实体，清除子实体表面异物，切去菇柄基部，将子实体一掰为二，按无菌操作，用解剖刀切取菌柄与菌盖交接处的菌肉中心组织块直径3-5毫米，迅速移接到含有母种固化培养基的培养皿上，15-23℃条件下培养，待长出菌丝体后，选择菌丝生长快，长势旺盛，无污染的菌落，挑取菌落的前端菌丝转皿培养，重复进行3-5次，进行驯化、确保纯种，直至获得在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速的鸡山冷菌原始母种，将鸡山冷菌原始母种转管扩大成试管斜面母种放入冷藏设备中保存备用。

2、液体母种制备：将保存的鸡山冷菌试管斜面母种挑取米粒大小的5-10块接入装有150-300mL母种液体培养基的500mL摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为16-21℃，培养10-20天成为成熟液体母种。

上述母种液体培养基组成为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，蛋白胨2g，酵母膏2g，水1000mL组成，pH自然。母种固化培养基是在液体培养基的基础上再添加琼脂15-20g配制而成。

3、原种液体摇瓶种子培养：在500mL摇瓶中装入150-300mL原种液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比5-10％的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分钟，培养温度为16-22℃，培养10-20天成为成熟液体原种。

原种液体培养基组成为：糖类25g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，蛋白胨2g，酵母粉2g，水1000mL组成，pH自然。

4、栽培种发酵罐培养：严格按无菌操作，以发酵培养基体积百分比5-10％的接种量把成熟液体原种接入装有100-150升无菌发酵培养基的总容积为200升的种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度为15-25℃，通气量1∶0.4-0.8V/V·min，搅拌速度60-160转/分钟，保持罐压0.03-0.10MPa，经过10-15天通气培养，达到对数生长期即可得到离褶伞菌液体菌种。

栽培种发酵培养基组成为：淀粉30g，蔗糖20g，葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL组成，pH自然。

栽培种发酵罐培养完毕将液体菌种按无菌操作转移到其他容器妥善保存，并尽快应用于鸡山冷菌的人工栽培、半人工栽培和人工促繁等规模化人工栽培生产中。可广泛地应用于离褶伞的大规模生产中。

上述的鸡山冷菌隶属于荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)、簇生离褶伞(Lyophyllumaggregatum)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji)和褐离褶伞(Lyophyllum fumosum)。

实施例2：

1、离褶伞菌原始母种的取得：取夏秋季产于云南省海拔1800米以上地带的新鲜离褶伞菌子实体，清除子实体表面异物，切去菇柄基部，将子实体一掰为二，按无菌操作，用解剖刀切取菌柄与菌盖交接处的菌肉中心组织块直径3毫米左右，迅速移接到含有母种固化培养基的培养皿上，20-25℃条件下培养，待长出菌丝体后，选择菌丝生长快，长势旺盛，无污染的菌落，挑取菌落的前端菌丝转皿培养，重复进行3-5次，进行驯化、确保纯种，直至获得在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速的离褶伞菌原始母种，将离褶伞菌原始母种转管扩大成试管斜面母种冷藏保存。其中的母种固化培养基与实施例1中的相同。

2、固化母种扩繁：将保存的离褶伞菌试管斜面母种挑取米粒大小3-5块转接入含有母种固化培养基的250mL三角瓶上，接种块间距2厘米左右，在20-25℃条件下培养20天左右菌落基本相连接即成为成熟固化母种。

母种固化培养基组成为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，蛋白胨2g，酵母膏2g，琼脂20g，水1000mL组成，pH自然。

3、原种液体摇瓶种子培养：在500mL摇瓶中装入150-300mL原种液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种3-5瓶500mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养。培养条件：旋转式摇床80-160转/分钟，培养温度为20-25℃，培养15天左右成为成熟液体原种。

原种液体培养基组成为：蔗糖20g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，蛋白胨2g，酵母粉2g，水1000mL组成，pH自然。

4、栽培种发酵罐培养：严格按无菌操作，以发酵培养基体积百分比5-10％的接种量把成熟液体原种接入装有100-150升无菌发酵培养基的总容积为200升的种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度为20-25℃，通气量1∶0.4-0.8V/V·min，搅拌速度80-160转/分钟，保持罐压0.03-0.10MPa，经过10-15天通气培养，达到对数生长期即可。

栽培种发酵培养基组成为：淀粉30g，蔗糖25g，葡萄糖5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL组成，pH自然。

栽培种发酵罐培养完毕将液体菌种按无菌操作转移到其他容器妥善保存，并尽快应用于离褶伞菌的人工栽培、半人工栽培和人工促繁等栽培方式的生产培养。

上述的离褶伞菌隶属于荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)，簇生离褶伞(Lyophyllumaggregatum)，玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji)，灰离褶伞(Lyophyllum cinerascens)，烟色(褐)离褶伞(Lyophyllum fumosum)，黑离褶伞(Lyophyllum cabonarium)，墨染离褶伞、墨色离褶伞(Lyophyllum semitale)，角孢离褶伞(Lyophyllum trigonosporum)，角孢离褶伞、角形离褶伞(Lyophyllum transforme)。

Claims (1)

1.一种离褶伞菌液体菌种规模化生产方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)将野外收集的离褶伞菌通过组织和孢子分离方法获得纯菌株；

(2)将野外获得的纯菌株经过纯化、多代选择，得到在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速，在液体培养基内生长快速、菌丝体呈明显的絮棉状或者碎屑状的离褶伞菌母种；

(3)配制扩大母种：

A、母种液体摇瓶种子培养：将分离纯化的离褶伞菌纯菌株挑取米粒大小的5-10块接入装有150-300mL母种液体培养基的摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体母种；

B、固化母种扩繁培养：将分离纯化的离褶伞纯菌株挑取米粒大小的3-5块转接入含有母种固化培养基的三角瓶上，接种块间距2厘米左右，在15-25℃条件下培养20天左右菌落基本相连接即成为成熟固化母种；

所述液体培养基由葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B₁50mg，蛋白胨2g，酵母膏2g，水1000mL组成，pH自然；母种固化培养基是在上述液体培养基中添加琼脂15-20g配制而成；

(4)原种液体摇瓶种子培养：

A、在500mL摇瓶中装入150-300mL液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比5-10％的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种；

B、在500mL摇瓶中装入150-300mL原种液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种3-5瓶500mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种；

原种液体培养基组成为：糖类25g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，蛋白胨2g，酵母粉2g，水1000mL组成，pH自然；

(5)栽培种发酵罐培养：

以发酵培养基体积百分比5-10％的接种量把成熟液体原种接入装有100-150升无菌发酵培养基的总容积为200升的种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度15-25℃，通气量1∶0.4-0.8V/V·min，搅拌速度60-160转/分钟，保持罐压0.03-0.10MPa，经过10-15天通气培养，达到对数生长期即可得到离褶伞菌液体菌种；

栽培种发酵培养基组成为：淀粉30g，蔗糖20g，葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL组成，pH自然。