CN103283487B - 一种秀珍菇液态菌种的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种秀珍菇液态菌种的培养方法，步骤如下：将秀珍菇母种接种到一级转接斜面培养基上，22~27℃培养9~11天，得一级秀珍菇种子；将一级秀珍菇种子接入到二级扩大培养基中，按每0.2~0.4cm³的琼脂斜面母种3块～5块加入到600-700ml二级扩大培养基中进行接种，于22~27℃培养8~10天，得二级秀珍菇种子液；将二级秀珍菇种子按接种量为0.109~0.127%接入到三级扩大培养基中，于22~27℃培养8~10天，得秀珍菇液态菌种。本发明培养方法工艺简便、生产周期短、污染少，而且降低了成本、适宜于工厂化生产，同时，所制备得到的秀珍菇液态菌种萌发快速、纯度较高。

Description

一种秀珍菇液态菌种的培养方法

技术领域

本发明属于食用菌菌种的制备技术领域，尤其是一种秀珍菇液态菌种的培养方法。

背景技术

秀珍菇，在真菌分类中隶属于无隔担子菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属。食用菌秀珍菇，是一种高蛋白的营养食品，秀珍菇菌肉肥嫩，味鲜爽口，有鲜甜海鲜味，并且营养丰富，蛋白质含量比双胞蘑菇、香菇、草菇更高，接近肉类，比一般蔬菜高3～6倍，富含人体必需的八种氨基酸和多种维生素，特别是硒含量达0.4-0.5mg/kg。质地细嫩，纤维含量少，因此它鲜美可口，具有独特的风味，美其名曰“味精菇”，附加值高。而且，秀珍菇的产出期在6-8月份，恰在其他食用菌菇产出的空档季节，产品竞争优势明显，销售市场十分广阔，有着巨大的发展空间。

但是，目前秀珍菇液态菌种的培养方法大都工艺较为繁琐，生产周期较长，污染较为严重、速度较慢，而且生产成本较高，同时，所制备得到的秀珍菇的纯度较低，不适宜于工厂化生产。

通过检索，发现如下两篇与本发明申请相关的专利公开文献：

1、利用钴60辐射处理提高子实体产量和氨基酸总量的秀珍菇菌种生产方法（CN102499070A），包括以下工艺步骤：生产母种、生产原种、利用原种生产栽培种，其特征是：在生产母种时，其制作步骤为：备料，包括制作母种培养基，将母种培养基装入试管中；从秀珍菇子实体中提纯复壮后获得母种，将母种菌丝体接入母种培养基上；菌丝体满管后进行钴60辐射诱变育种处理，辐射诱变时间为30-60分钟、辐射剂量掌控为0.4KGY-0.6KGY。与已有技术比较，本发明可明显提高秀珍菇子实体产量和各类氨基酸总量，包括硫氨基酸总量、支链氨基酸总量、儿童氨基酸总量、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量、甜味氨基酸总量和氨基酸总量显著提高。

2、一种平菇、秀珍菇菌种倍增循环繁殖方法（CN102771310A），涉及到一种平菇、秀珍菇菌种倍增循环繁殖方法。具体包括：设置有空气对流窗口、有遮光物，空间大小约40～50m3/间的菌种培养室，在培养室构建多层结构的菌种培养床架，菌种倍增循环培养时是在床架里进行，培养期间匹配间歇定时器来控制氧气泵给菌种间歇供氧以利菌丝快速萌发且吃料；生产用培养基质料是通过发酵而成，繁殖时根据重量比将生产用培养基质料和菌种混合后在培养床架里培养得第一批菌种，然后再根据重量比将第一批菌种与生产用培养基质料混合又通过管理培养得第二批菌种，接下来同样按照上述方法将第二批菌种循环倍增培养出适合足够自身安排的菌种量。

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方法简便、生产周期短、污染少、快速萌发、低碳环保、降低了生产成本、适宜于工厂化生产的秀珍菇液态菌种培养方法，该方法所制备得到的秀珍菇出菇整齐、纯度较高，为绿色有机食品。

本发明实现目的的技术方案是：

一种秀珍菇液态菌种的培养方法，步骤如下：

(1)秀珍菇母种的一级转接

将秀珍菇母种接种到一级转接斜面培养基上，22~27℃培养9~11天，得一级秀珍菇种子；

其中，一级转接斜面培养基的配方为：每1000ml纯净水中加入马铃薯培养基 38~40g、琼脂 <0.1g，121℃、0.11Mpa灭菌15min；

(2)秀珍菇菌种的二级扩大培养

将步骤(1)中的一级秀珍菇种子接入到二级扩大培养基中,按每0.2~0.4cm³的琼脂斜面母种3块～5块加入到600-700ml二级扩大培养基中进行接种，于22~27℃培养8~10天，得二级秀珍菇种子液；

其中，二级扩大培养基的配方为：每1000ml纯净水中添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，葡萄糖：蛋白胨：酵母膏的质量比为10：3：2，121℃、0.11Mpa灭菌25min；

(3)秀珍菇菌种的三级扩大培养

将步骤(2)中的二级秀珍菇种子按接种量为0.109~0.127%接入到三级扩大培养基中，于22~27℃培养8~10天，得秀珍菇液态菌种；

其中，三级扩大培养基的配方为：

自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，或自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、食用油，其中，自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：工业消泡剂的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：540~560：9~11：1.5~2.5：1~2：0.5~1.5：0.3~0.7：70~90；自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：食用油的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：540~560：9~11：1.5~2.5：1~2：0.5~1.5：0.3~0.7：400-500，然后高压灭菌；

高压灭菌的程序如下：第一阶段:保温温度100℃，保温时间70min；第二阶段：保温温度112℃，保温时间20min；第三阶段：灭菌温度121℃，保温时间50min；第四阶段：冷却行程温度30℃，时间40min左右。

而且，所述步骤(1)中一级转接斜面培养基的配方为：每1000ml纯净水中加入马铃薯培养基 39g、琼脂 0.01~0.099g，121℃、0.11Mpa灭菌15min。

而且，所述步骤(2)中二级扩大培养基的配方为：每1000ml纯净水中添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，葡萄糖：蛋白胨：酵母膏的质量比为10：3：2，121℃、0.11Mpa灭菌25min。

而且，所述步骤(3)中三级扩大培养基的配方为：

自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，或自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、食用油，其中，自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：工业消泡剂的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：550：10：2：1.5：1：0.5：80；自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：食用油的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：550：10：2：1.5：1：0.5：400~500。

本发明的优点和有益效果为：液态菌种培养周期短，走菌快，污染少

1、本发明培养方法工艺简便、生产周期短、污染少，而且降低了成本、适宜于工厂化生产，同时，所制备得到的秀珍菇液态菌种萌发快速、纯度较高。

2、本发明方法培养得到的秀珍菇液态菌种接种后，所制备得到的秀珍菇纯度较高，出菇整齐，口感润滑、美味营养，食用方便，为绿色有机食品，包装后可以进行市场销售。

3、本发明培养方法在秀珍菇菌包和指导栽培的过程中不添加任何化学物质，完全符合国家环保标准，该方法低碳、绿色环保、有利于绿色食品行业的成长，有利于提高当地农民的收入，有利于促进当地经济的发展。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

如无特殊说明，本发明中所使用的试剂为常规试剂；如无特殊说明，所使用的方法为常规方法。

本发明中所使用的秀珍菇母种购买于天津宝地农业科技发展有限公司。

一种秀珍菇液态菌种的培养方法，步骤如下：

（一）母种的扩大培养（一级试管转接）

1、实验仪器

玻璃试管（18mm×180mm或20mm×200mm）、接种针、酒精（75%）。

2、试管培养基工艺参数及制作

①培养基工艺参数

一级转接斜面培养基的配方为：39g PDA(马铃薯培养基)、琼脂（不足0.1g）、纯净水1000ml，121℃、0.11Mpa灭菌15min；

②培养基的制作

1）计算：首先要计算出1000mL的PDA需用多少四角瓶与试管，一般情况下，试管添加量大概为8—9mL，四角瓶为38—40mL左右。

2）仪器要求：把需要的试管、四角瓶、三角瓶等清洗干净，瓶壁上无水珠备用；

3）称量：称取39gPDA(马铃薯培养基)于一张白纸上面，再加入定量的琼脂（不足0.1g），倒入1000ml的烧杯中；

4）溶解：打开电饭煲，加入纯净水，然后量取1000ml纯净水，倒入烧杯中，边加入边搅拌，把烧杯放到电饭煲中加热，边搅拌边加热；1h后，等煮制的PDA溶液澄清透明后，方可制作培养基进行分装；

5）分装：先倒出一部分溶液，剩余的继续加热，先分装到四角瓶中，瓶口用漏斗分装，加入一定量时，把四角瓶水平放置，看培养基是否覆盖整个平面，不得溢出，其他四角瓶以此为标准，进行分装，速度要快，防止培养基凝固，试管也是同样分装，剩余的培养基倒入500ml三角瓶里,留做平皿使用；

6）包扎：把试管、三角瓶、四角瓶塞上棉塞包扎好；

7）灭菌：把所有灭菌的容器放到高压锅内灭菌，灭菌时间与温度为121度15分钟；

8）灭菌结束：关闭开关，切断电源，等压力降至0 Mpa时，打开手动放气阀，排出锅内蒸汽；

9）斜面制作：取出灭菌完的溶液；把四角瓶水平放置，试管棉塞处略高些，底部放到桌面上，使培养基溶液液面为试管的2/3处为最佳，把试管摆放整齐，三角瓶稍冷却后，手掌握住瓶底不烫手为佳，无菌操作倒入到平皿（25ml）内，倒完把平皿放置在一起，最上层用三角瓶（内加温水）压住，使其自然冷却；

10）将秀珍菇母种接种到一级转接斜面培养基上，

11）实验结束：制作结束后，整理实验台。

3、注意事项

①分装培养基时，速度要迅速，防止培养基凝固，不易分装；

②如果培养基粘瓶口处，要立即用纱布擦拭干净，再塞上棉塞，防止被污染；

③做PDA时，一定要加入少量琼脂，如果不加防止做好的培养基凝固度不良，易破碎，对下面的工序也会有所影响；

④做好PDA斜面，如果放置几天后，试管与四角瓶瓶壁上有过多的冷凝水，不宜使用；等试管与四角瓶无冷凝水时，方可使用；

⑤基本上每月做一次PDA，每周转接两次母种，要计算一下所需使用量；

⑥做试管时，建议用10ml的吸管把溶液移到试管里，会避免有溶液粘到试管口处，容易被污染。

（二）菌种二级扩大培养（液体三角瓶接种）

1、实验仪器

（三角瓶）1000ml、烧杯（1000ml）

2、液体三角瓶培养基的制作灭菌及接种

①培养基工艺参数

二级扩大培养基的配方为：二级扩大培养基的配方为：每1000ml纯净水中添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，葡萄糖：蛋白胨：酵母膏的质量比为10：3：2，121℃、0.11Mpa灭菌25min；

②液体三角瓶培养基的制作

1）称料：电子天平分别称取葡萄糖50g，蛋白胨15g，酵母膏10g，关闭电子天平，水平放置在工作台上；

2）量水：用量杯量取1000ml自来水(用活性炭过滤)，倒入到1000ml的烧杯中；打开电饭锅，加入少量水，把量好的烧杯放到电饭锅里加热，目的使原料溶解；

3）溶解：把加热好的温水倒入到量杯中，量杯里为所加原料，用勺子搅拌至完全溶解；另外量取4000ml自来水加入到大桶里备用；

4）搅拌：把完全溶解的原料加入到桶里，搅拌至均匀；

5）分装：把所需的三角瓶清洗干净，加入磁铁，每个瓶里放一个磁铁，量取配好的溶液600ml，倒入三角瓶里；分装三角瓶后，塞上棉塞，棉塞不得过紧或过松，塞上拔出时有砰的声音为佳，里层包一层白纸，外层包一层玻璃纸，用橡皮筋扎紧；

6）灭菌：把所需灭菌的三角瓶放到灭菌槽内，三角瓶上面用3-5层报纸盖住，最上层用玻璃纸覆盖，检查灭菌锅里水是否达到水位线，不足的话加入水至水位线，旋紧灭菌盖，检验放气阀是否关紧，插上电源；打开灭菌锅开关，设定灭菌时间与温度（121℃、25min），按计时工作键进行工作；一定要把手动放气阀关闭，放气阀连接的橡胶管口，一定要插到水桶液面下；

7）结束：灭菌结束后，关闭灭菌锅开关，切断电源；等压力降至0mpa打开手动放气阀，放出灭菌锅内的蒸汽；打开灭菌锅，取灭菌后的三角瓶，待用；把灭菌锅的锅盖合上。

③液体三角瓶的接种

1）要求：穿好工作服，更换工作鞋，一定要通过风淋室进入；

2）准备工作：整理水平操作台，打开无菌风15min左右，打开无菌灯；

3）消毒：先用自来水擦试工作台，再用75%的酒精倒到脱脂棉上，擦拭工作台，包括接种使用的接种针、酒精灯、灯架等；换用另一块脱脂棉，倒上酒精，擦拭三角瓶各个部位，用酒精进行消毒试管（四角瓶、平皿）；擦完后放到无菌操作台上备用；

4）选用优良原种：要确保原种无杂菌，菌丝爬满整个斜面，按照母种的先后日期，记录原种的日期与编号；

5）酒精消毒：倒入一杯75%的酒精溶液，把接种针插到玻璃杯内消毒，由于酒精易挥发，使用完一次后，用纸包装好，重复使用两次倒掉；用75%的酒精消毒双手与手臂；打开酒精灯，灯帽放置旁边，点燃酒精灯，酒精灯放置在操作台中间位置；

6）接种：打开三角瓶包装纸，靠近酒精灯火焰，把棉塞拔出，灼烧三角瓶的瓶口周围，灼烧两圈，然后灼烧棉塞，立即塞上棉塞，四角瓶或试管也同样操作；右手拿接种针，先垂直灼烧接种针旋转，然后水平放置，灼烧顶端至微红，然后整支接种针重复灼烧4次，不得过快或过慢，恰到好处；

7）试管消毒操作：用左手和手掌托起试管，瓶塞对准火焰处，右手拿接种针，拔掉棉塞，然后灼烧试管瓶口旋转两圈，把接种针插入试管内，接种针不得碰到菌丝表面；

8）预冷及取点：先将接种针在试管中间位置冷却，取出一小块菌丝，用接种针取出；灼烧试管瓶口与棉塞，立即塞上棉塞，然后拔下三角瓶棉塞，灼烧三角瓶瓶口与棉塞，把菌块迅速敲下去，再灼烧瓶口与棉塞，每个三角瓶里取三个生长点，按每0.3cm³的琼脂斜面母种3块～5块加入到600-700ml二级扩大培养基中进行接种；接种完三角瓶，立即用纸与玻璃纸盖上，用橡皮筋包扎好，记录接种日期；

9）实验结束：整理水平操作台，关闭无菌风与灯。

3、注意事项

1）液体三角瓶培养基制作注意事项

a.必须确保电子天平的精确度，这样称量的原料精确无误；

b.电饭煲里加入的水是纯净水，防止锅底有杂质粘到锅底；

c.做三角瓶时，要清洗三角瓶与磁铁，坏的磁铁单独放在一起，防止再次使用；

d.棉塞重复使用两三次后，要更换新的棉塞；

e.一切做完后，要注意整理实验台。

2）液体三角瓶接种的注意事项

a.在接种过程中，保持四角瓶（试管）与桌面平行，管口略向下倾斜，不得远离酒精灯火焰；

b.接种前一定要确保所用接种工具消毒彻底，防止接种过程中被污染；

c.接种的菌块不易过大，所带培养基较薄，易培养；

d.如果把菌块敲到瓶口壁上，要及时用接种针取出，灼烧瓶口与棉塞，立即塞上棉塞；

e.接种完的三角瓶，要写上日期与编号，以便做记录；

f.接种完的三角瓶需放置24h后，方可放到磁力搅拌机上进行培养观察，转速要调慢些，三天后再上调；

g操作工作台每周消毒清洗两次；

h.接种针冷却时，插入的接种针后端不得碰到菌丝表面，防止烧死菌丝。

（三）菌种三级扩大培养（液体发酵罐接种）

1、设备

液体发酵罐、水桶、过滤塞、大勺、搅拌棒、电子称

2、配料工序卫生要求及操作规范

①卫生要求

1）配料室人员严格按照卫生要求进入；

2）随时保持配料室环境卫生，防止微生物的滋生；

3）配料时戴口罩和手套。

②操作规范

1）接到生产通知后，严格按照配方的用量计算各种配料的数量；

2）领用的各种配料必须放置于垫板上，禁止直接放置在地板上；

3）称量分装：

a.按照称量多少选择电子称量程；

b.去皮：将分装配料的包装袋去皮，保证其净含量；

c.称量：待数字显示稳定后再移走。及时将掉落在电子称上的配料清理干净；

d.称量好的原料应按用量分别放置在一定区域，并标示清楚名称及数量。

3、液体发酵罐的制作灭菌及接种

①培养基配制工艺参数

三级扩大培养基的配方为：葡萄糖：10kg、酵母膏：1.5kg、硫酸镁：0.5kg、蛋白胨：2kg、磷酸二氢钾：1kg、消泡剂（食用油）：400-500ml或工业消泡剂80ml。

②制作发酵罐工艺流程

1）称料：用电子秤称取所需原料，要确保电子秤精确，由于葡萄糖量较多，称取时分装两个大桶，容易溶解，称完的原料要密封保存，以备下次使用；

2）溶解：把称好的原料加水溶解，用木棒搅拌均匀，无沉淀、细小颗粒为止；

3）装桶：把完全溶解的原料，加入到发酵罐内，倒入时用木筛过滤，以防止不容物或其他杂质进入；

4）消泡剂：加入食用油400-500ml或加工业消泡剂80ml；

5）加水定量：加入自来水500-550kg定量；

6）密封：检验所有原料是否添加完全，水定量到位，封闭发酵罐进行灭菌；

7）复检：发酵罐密封后，发酵罐下面的阀门要关闭，用铝箔纸包装好，发酵罐上面的出气孔用绳子包扎紧，检验无误后，推到蘑菇灭菌器内，把发酵罐的两个气阀分别连接灭菌器上（上进气下出气）；

8）灭菌：检验是否连接正确，设定一定的工艺参数，工艺参数的设定如下：

第一阶段:保温温度100℃，保温时间70min；

第二阶段：保温温度112℃，保温时间20min；

第三阶段：灭菌温度121℃，保温时间50min；

第四阶段：冷却行程温度30℃，时间40min左右。

备注：整个灭菌流程控制在4个小时左右，在蒸汽正常的情况下，第一阶段升温需要40min左右；第二、第三阶段需要20min左右。灭菌过程中未经允许不得更改任何工艺参数，灭菌过程中门不可开，灭菌结束后压力将为零时方可打开。

9）结束：灭菌完全后，推出发酵罐，等发酵罐温度降低到20℃左右方可接菌。

③接种液体发酵罐工艺流程

1）准备工作：打开无菌风（15min），先用打火机在无菌风旁边点燃，确定无菌风的风向是否正常；

2）筛选菌种：选择培养好的三角瓶，检验菌丝是否正常、有无悬浮物、泡沫等异常情况，并记录原种的日期与编号；

3）三角瓶消毒：把三角瓶放置在托盘上，用75%的酒精溶液进行消毒，用脱脂棉擦洗瓶身；

4）发酵罐要求：检验发酵罐是否正常，如：桶温、是否加食用油等；

5）无菌操作台消毒：把发酵罐推到无菌风下方，用75%的酒精溶液消毒屏风四周；

6）解压:解开出气孔的橡胶管，松动阀门，放出发酵罐内的气压；

7)消毒：用75%的酒精溶液消毒，喷洒发酵罐罐口四周，要均匀；用75%的酒精溶液消毒双手与手臂，要使伸进无菌风内的手与手臂要完全消毒；

8）火焰消毒：另一位技术员点燃酒精喷灯，递给操作员，酒精喷灯火焰要调大，然后灼烧桶盖最外层两圈，中间两圈，最里层5-6圈，试大桶周围完全消毒；熄灭酒精喷灯并递给技术员；打开桶盖，盖子放置桶口旁边，右手拿酒精喷灯灼烧管口与盖子，左手拿三角瓶，右手拔下棉塞，用酒精喷灯灼烧瓶口，再次灼烧一下罐口与盖子，递出酒精喷灯；

9）接种：左手握住三角瓶底部，右手在三角瓶的上方，倾斜，离管口较近，缓慢倒入菌液，然后加快速度，最后稍慢些，倒完后递出，另一人嗅其气味是否正常；接完菌后再用酒精喷灯灼烧管口与盖子，迅速扣紧盖子，关闭无菌风；

其中，将二级秀珍菇种子按接种量为0.109~0.127%接入到三级扩大培养基中，于22~27℃培养7~9天，得秀珍菇液态菌种；；

10）连接洁净空气：把接好的大桶推倒气压阀下，按接菌的先后顺序排列，连接气压阀；连接气压阀时，先用75%的酒精喷洒气压阀接口与连接大桶的另一接口，后用酒精喷灯灼烧灭菌，最后迅速接上气阀，打开压力阀，调试气压为0.11MPa，4天后气压调至0.15MPa；

11）结束：操作结束后，记录完成时间与三角瓶的时间和性状，清洗实验仪器。

4、注意事项

1）配料室注意事项

a.当天余下的配料应及时扎紧袋口，防止回潮；送回仓库或者存放在干净的垫板上；

b.定期（1周）对使用的电子称进行校准。

c.做好用料记录。

d.对于原料的配方要保密，不得告知任何人。

2）液体发酵罐制作注意事项

a.有些原料难熔解，如：硫酸镁、磷酸二氢钾等，加热水易溶解，而蛋白胨也难溶解，但不能加热水，边加自来水边用木棒搅拌，然后带上橡胶手套进行细搓，直至均匀；

要确保发酵罐干净，各个管口要清洗干净；

b.如果更换任何一种原料，都要做好标识，以便做实验观察；

c.发酵罐如果灭菌不彻底，要进行二次灭菌，并做好标记；

d.不得漏加或多加某种原料，加完后要复检；

e.由于发酵罐密封圈使用久易老化，所以清洗发酵罐时要检查密封圈，如有发现，要及时反馈并及时更换密封圈。

f.一定要确保盖子的旋紧性，螺丝旋紧到位，一定要对角旋紧，防止一边松一边紧，造成密封不良，防止未旋紧影响下道工序；

j.发酵罐所连接的橡胶管也要确保其完整性，无小气孔，一旦发现及时更换。

3）安装大桶注意事项

a.安装细菌过滤器时，分清进气孔与出气孔，压缩空气从细菌过滤器（带数字符号）的方向进入，然后连接细硅胶管，一定要安装到位，并用扎带扎紧。每个大桶安装4个细菌过滤器。

b.硅胶管与大桶的每个连接点都要安装到位，并用喉箍锁紧。

c.要确保连接大桶的各个硅胶管的完好无缺，保证其密封性良好。

4）灭菌前注意事项

a.桶盖上出气孔连接的硅胶管要用夹子夹紧，并用尼龙绳扎紧。

b.大桶最下方的出气孔要用铝箔纸包装好，保证其密封性。

c.推进大桶时一定要注意各个连接口不得碰到食用菌灭菌器，防止硅胶管因碰壁破裂。

d.推进大桶后，连接进气阀（下排）与出气阀（上排），细菌过滤器一定要放到大桶上方，防止出现倒吸现象，造成灭菌不彻底。

5）灭菌过程中注意事项

a.一定要确保系统的各个阀门（蒸汽、压缩空气、排气、冷凝水）打开，保证其正常工作。

b.每小时对其进行巡检，查看系统是否正常运转。

c.灭菌过程中如出现异常及时反馈，并及时解决异常。

5）灭菌结束注意事项

a.系统出现报警时，说明灭菌已完成。

b.出炉时先拔下进气阀，然后拔下出气阀，防止出现倒吸现象。

c.推出时一定要小心，不可碰壁，防止硅胶管破裂。

d.推到放冷室冷却，桶温降至20℃左右方可接种。

E.如出现爆管、倒吸等现象，造成灭菌不彻底，进行二次灭菌（最好不要二次灭菌，成分易破坏）。

6）接种过程中注意事项

a.每周对无菌风机进行消毒两次；

b.如果大桶管口槽内有水，要用脱脂棉擦拭干净，后喷洒酒精消毒，再用喷灯灼烧灭菌；

c.如果更换培养原料或消泡剂，要做好标识，以便以后的观察、对比；

d.接大桶前，要检查大桶是否正常（如大桶的温度、是否加食用油[消泡剂]、水位是否达到所需标准等）；

e.接大桶时，菌液不得流到罐口外面，拔三角瓶棉塞时，不得离罐口太近，以减少污染；

f.接大桶时，从三角瓶上拔下的棉塞，不得放入托盘中，棉塞掉地上用到其他三角瓶，易造成污染。

本发明方法经发酵罐培养7-9天后培养得到的珍菇液态菌种，菌种达到一定的成熟稳定期（颜色浅黄、菌丝形态为小颗粒、羽绒，浓稠），可以用于接种，每包菌包接菌量为25-30ml，液态菌种培养周期短，走菌快，污染少。

使用本发明方法培养出的秀珍菇液态菌种培养的秀珍菇形秀小、白漂，口感柔嫩，美味爽口，营养丰富，蛋白质含量比双孢蘑菇、香菇、草菇更高，质地细嫩，纤维含量少；据福建省农业科学院运动土壤肥料研究所测定，鲜菇中含蛋白质3.65-3.88%、粗脂肪1.13-1.18%、还原糖0.87-1.80%、糖分23.94-34.87%、木质素2.64%、纤维素12.85%、果胶0.14%，还含有纤维素、矿质无素等。它的蛋白质含量，接近于肉类，比一般蔬菜高3-6倍，秀珍菇含有17种以上氨基酸，更为可贵的是，它含有人体自身不能制造，而肉食中通常又缺乏的苏氨酸、赖氨酸、亮氨酸等。

Claims (3)

1.一种秀珍菇液态菌种的培养方法，其特征在于：步骤如下：

⑴秀珍菇母种的一级转接

将秀珍菇母种接种到一级转接斜面培养基上，22～27℃培养9～11天，得一级秀珍菇种子；

其中，一级转接斜面培养基的配方为：每1000ml纯净水中加入马铃薯培养基38～40g、琼脂<0.1g，121℃、0.11Mpa灭菌15min；

⑵秀珍菇菌种的二级扩大培养

将步骤⑴中的一级秀珍菇种子接入到二级扩大培养基中,按每0.2～0.4cm³的琼脂斜面母种3块～5块加入到600-700ml二级扩大培养基中进行接种，于22～27℃培养8～10天，得二级秀珍菇种子液；

其中，二级扩大培养基的配方为：每1000ml纯净水中添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，葡萄糖：蛋白胨：酵母膏的质量比为10：3：2，121℃、0.11Mpa灭菌25min；

⑶秀珍菇菌种的三级扩大培养

将步骤⑵中的二级秀珍菇种子按接种量为0.109～0.127％接入到三级扩大培养基中，于22～27℃培养8～10天，得秀珍菇液态菌种；

其中，三级扩大培养基的配方为：

自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，或自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、食用油，其中，自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：工业消泡剂的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：540～560：9～11：1.5～2.5：1～2：0.5～1.5：0.3～0.7：70～90；自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：食用油的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：540～560：9～11：1.5～2.5：1～2：0.5～1.5：0.3～0.7：400-500，然后高压灭菌；

高压灭菌的程序如下：第一阶段:保温温度100℃，保温时间70min；第二阶段：保温温度112℃，保温时间20min；第三阶段：灭菌温度121℃，保温时间50min；第四阶段：冷却行程温度30℃，时间40min左右。

2.根据权利要求1所述的秀珍菇液态菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤⑴中一级转接斜面培养基的配方为：每1000ml纯净水中加入马铃薯培养基39g、琼脂0.01～0.099g，121℃、0.11Mpa灭菌15min。

3.根据权利要求1所述的秀珍菇液态菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤⑶中三级扩大培养基的配方为：

自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，或自来水中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、食用油，其中，自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：工业消泡剂的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：550：10：2：1.5：1：0.5：80；自来水：葡萄糖：蛋白胨：酵母膏：磷酸二氢钾：硫酸镁：食用油的比例kg：kg：kg：kg：kg：kg：ml为：550：10：2：1.5：1：0.5：400～500。