CN105154335B - 一种培养血耳混合菌种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养血耳混合菌种的方法，属于食用、药用真菌栽培的技术领域，本发明包括以下工艺步骤：1)、分离野生血耳中的耳友菌与血耳担孢子菌种，分别纯化并初步培养，得到两种菌种；2)、将两种菌种分别于液体培养基中进行扩大培养，将扩大培养完成后的两种菌种混合，得到混合液体种；3)、将混合液体种混合搅拌接种于固体木屑麸皮培养基，进行培养获取用于血耳栽培的血耳固体混合菌种。将混合菌种培养成熟后用于原木栽培即可获得血耳成品。该方法可显著提高菌种成活率与穴出耳率，减少杂菌污染，使得血耳品质更均一，并能将整体血耳生产流程时间较传统方法缩短110天左右。

Description

一种培养血耳混合菌种的方法

技术领域

本发明涉及食用、药用真菌栽培的技术领域，具体而言，涉及一种培养血耳混合菌种的方法。

背景技术

血耳是一种具有很高经济价值的珍稀药食兼用真菌，具有滋阴补阳和补血强身的功效，被看作是治疗妇科疾病的良药。野生的血耳产量极少，而人工栽培由于菌种生产技术没有突破，故产量极低。

血耳菌种是一个由血耳纯菌丝和其生长所必需的被称为“耳友菌”的伴生菌丝构成的混合菌丝结构。现有的血耳栽培技术还停留在半人工仿生栽培阶段。所使用的“血耳菌种”只是从野生血耳生长基质上分离得到血耳“耳友菌”，经纯化后采用常规方法接种于木屑麸皮培养基，菌丝长满后用于仿生栽培。

此种栽培技术需要接种口开放不封口，以等待自然接种空气中的野生血耳孢子，每个接种穴只有成功接种了血耳孢子、成功萌发，且与“耳友菌”伴生6个月后才能够顺利长出血耳子实体，因而存在自然接种成功率低、培育时间过长等问题。此外，自然接种的野生血耳孢子不一定来自同一菌株，更何况还有很大可能混入一些近缘种及杂菌，会导致最后有幸收获的血耳产品良莠不齐，品质无法保障。这些因素都限制了血耳的产量与良品率。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养血耳菌种的方法，该方法可增加菌种的穴出耳率，提升血耳成品的品质，大幅降低血耳培育时间。

为了实现以上目的，本发明采用的混合菌种栽培血耳新方法，其流程如下：

1)、分离野生血耳中的耳友菌与血耳担孢子菌种，分别纯化并初步培养，得到两种菌种；

2)、将两种菌种分别于液体培养基中进行扩大培养，将扩大培养完成后的两种菌种混合，得到混合液体种；

3)、将混合液体种混合搅拌接种于木屑麸皮培养基进行培养，获取用于血耳栽培的血耳固体混合菌种。

传统的血耳菌种中只含有耳友菌菌种，本发明将耳友菌菌种与血耳孢子菌种混合在一起，混合接种于木屑麸皮培养基,制成混合固体菌种，可有效解决血耳接种成功率低、培育时间长的问题。

优选的，对于上述培养血耳混合菌种流程2)中所述液体培养基，主要由以下组份制成：

麸皮微粉0.2～0.5份、豆粕微粉0.2～0.5份、玉米微粉0.1～0.3份、葡萄糖1.5～2.5份、硫酸镁0.05～0.15份、磷酸二氢钾0.05～0.15份、消泡剂0.1～0.2份、水98～102份。

其中麸皮、豆粕、玉米微粉及葡萄糖可为真菌的生长提供充足的碳水化合物及常规养分；硫酸镁是真菌EMP、TCA途径及赖氨酸产生的重要酶激活剂；磷酸二氢钾可为培养基提供pH缓冲作用，且磷是细胞膜的组成部分，是蛋白质和核酸的合成原料，也是ADP、ATP的组成部分，必不可缺。钾离子可为真菌提供适合的代谢中酶反应的离子环境；消泡剂可解决培养基通气搅拌时容易产生气泡的问题。在此培养基下，菌种生长状态好，生长速度快。

优选的，基于上述的液体培养基，所述的消泡剂包括天然油脂、聚醚类消泡剂、硅类消泡剂、聚醚改性硅消泡剂的一种或多种。

优选的，耳友菌扩大培养的时间为5～7天，而血耳芽孢扩大培养的时间为3～5天。

在该培养时间范围内，菌种产量较为合适，且菌种生长状态较好。

优选的，扩大培养时的温度为23～25℃。

在该培养温度范围内，菌种生长状态较好。

优选的，上述培养血耳混合菌种流程3)中所述的混合培养种培养时所用的固体培养基按照重量百分数计，包括：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒76～80％、麸皮18～22％、蔗糖0.8～1.2％、石膏粉0.8～1.2％。

其中干木屑、麸皮和蔗糖能提供真菌生长所需的营养。石膏可直接补充培养基中硫、钙的不足，供给菌丝吸收利用，钙离子还能有利于真菌菌丝吸收营养，中和菌丝在生长过程中产生的酸，提供缓冲体系。水可提供真菌生长所需的水分和潮湿的环境。

进一步优选的，所述的固体培养基含水量为47～53％。

优选的，在上述的混合培养过程中，按照两种液体种的体积比，血耳菌/耳友菌的比值在1～1.3之间。

耳友菌帮助血耳分解、吸收养分。当两者混合比例控制在上述范围内时，既不会造成菌种的浪费，菌种生长状态也较好。

优选的，上述将混合液体种混合搅拌接种于木屑麸皮培养基进行培养时，接种了混合液体种的培养基含水量控制在52～55％。

优选的，上述混合培养过程中，培养温度范围为23～25℃。

此温度范围为耳友菌和血耳均能良好生长的适宜温度范围。

与现有技术相比，本发明的技术效果包括以下几个方面：

1)、应用本发明生产的血耳菌种栽培血耳，由于菌种是耳友菌菌种与血耳孢子的混合菌种，避免了自然接种野生血耳孢子成功率低、接种时间长的问题。

2)、由于毋须自然接种野生血耳孢子，原木接种后，接种口可封闭，降低了干旱、日照、高温、病虫害等不良环境因素对接种穴中菌种的影响，保障了两种“菌”正常的生长发育，接种成活率高，产量与品质也获得提高。

3)、由于接种口可封闭，也避免了杂菌污染的可能性。

4)、由于两种菌种均为人工培育，保证了菌种的纯度，避免了自然接种野生血耳孢子质量参差不齐的缺点。

5)、综合上述几点原因，使得整体的菌种培育及后续的血耳栽培时间大幅缩短。如果栽培环境适宜，从菌种培育到血耳成品产出一共能较传统方法缩短生产时间110天左右。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1)、分别在无菌条件下，于血耳耳根着生处及子实体处分离得到耳友菌与血耳担孢子菌种，选用常规分离培养基，进行纯化与初步培养，得到两种菌种；

2)、将两种菌种分别于液体培养基中进行扩大培养，将扩大培养完成后的两种菌种混合得到混合液体种；

3)、将混合液体种混合搅拌接种于木屑麸皮培养基，进行培养获取用于血耳栽培的血耳混合固体菌种。

实施例2

1)、采集优良野生血耳标本，分别在无菌条件下，于血耳耳根着生处及子实体处分离得到耳友菌与血耳担孢子菌种，23℃，进行纯化与初步培养，得到两种菌种；

2)、扩大培养阶段。

将耳友菌与血耳孢子菌种用700升的气升式发酵罐，分别进行加水、投料、灭菌、冷却、接种、23℃下保压0.03兆帕充气发酵培养。耳友菌扩大培养的时间为7天，血耳芽孢扩大培养的时间为5天。

其中扩大培养所用液体培养基配方为：麸皮微粉0.2份、豆粕微粉0.2份、玉米微粉0.1份、葡萄糖1.5份、硫酸镁0.05份、磷酸二氢钾0.05份、玉米油0.1份、水98份。

3)、混合固体菌种培养阶段。

3.1.固体培养基配方：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒80％、麸皮18％、蔗糖0.8％、石膏粉1.2％，充分混匀；含水量47％。用高压聚丙烯塑料滤菌透气袋盛装，每袋装料25kg,扎紧袋口，置于高压灭菌锅中，0.15兆帕灭菌2小时，冷却备用。15×28cm高压聚丙烯塑料滤菌透气袋适量，用大的高压聚丙烯滤菌透气袋盛装后扎紧，如上法高压灭菌后，冷却备用。

3.2.接种：准备一间消毒过的房间，将灭菌后的培养基及小料袋、拌料机、装袋机，扎口机等放进接种间提前消毒；进行无菌操作；耳友菌和血耳的液体种按1.2:1的比例混合后与培养基边搅拌边混合，控制培养基含水量在52％；装袋；扎口。

3.3.将接种过混合液体菌种的培养基袋移送至23～25℃的培养室，避光培养，28天菌丝即可长满。

实施例3

1)、采集优良野生血耳标本，分别在无菌条件下，于血耳耳根着生处及子实体处分离得到耳友菌与血耳担孢子菌种，24℃，进行纯化与初步培养，得到两种菌种；

上述过程所用的分离耳友菌的培养基为常规PDA培养基；血耳分离培养基为：土豆200克、耳友菌培养基100克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、琼脂20克、水1000毫升，常规制备，分装于试管及250毫升三角瓶适量，灭菌备用；液体种初级培养用培养基为：麸皮微粉3克、豆粕微粉3克、玉米微粉2克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、水1000毫升，混均分装于1000毫升三角瓶，每瓶分装500毫升，灭菌备用。

2)、扩大培养阶段。

将耳友菌与血耳孢子菌种用700升的气升式发酵罐，分别进行加水、投料、灭菌、冷却、接种、24℃下保压0.03兆帕充气发酵培养。耳友菌扩大培养的时间为6天，血耳芽孢扩大培养的时间为4天。

其中扩大培养所用液体培养基配方为：麸皮微粉0.5份、豆粕微粉0.5份、玉米微粉0.3份、葡萄糖2.5份、硫酸镁0.15份、磷酸二氢钾0.15份、二甲基硅油0.2份，水102份。

3)、混合固体菌种培养阶段。

3.1.固体培养基配方：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒76％、麸皮22％、蔗糖1.2％、石膏粉0.8％；含水量53％。常规方法搅拌均匀后用高压聚丙烯塑料滤菌透气袋盛装，每袋装料25kg，扎紧袋口，置于高压灭菌锅中高压灭菌。

3.2.接种：准备一间消毒过的房间。将灭菌后的培养基及小料袋、拌料机、装袋机，扎口机等放进接种间提前消毒；进行无菌操作；血耳菌和耳友菌的液体种按1.3:1的比例混合后与培养基边搅拌边混合，控制培养基含水量在55％；装袋；扎口。

3.3.将接种过混合液体菌种的培养基袋移送至23℃～25℃的培养室，避光培养，28天菌丝即可长满。

实施例4

1)、采集优良野生血耳标本，分别在无菌条件下，于血耳耳根着生处及子实体处分离得到耳友菌与血耳担孢子菌种，25℃，进行纯化与初步培养；将长满试管斜面培养基的血耳耳友菌菌丝适量接入三角瓶液体培养基中，25℃，170转/min摇床培养；48小时后挑取试管中提纯后的血耳芽孢团适量于三角瓶液体培养基中，25℃，170转/min摇床培养；耳友菌第3天取样菌检，血耳芽孢2天后菌检，无其它微生物污染即可用于扩大培养。

上述过程中，耳友菌所用培养基为PDA培养基；血耳分离培养基配方为：马铃薯200克、耳友菌培养基100克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、琼脂20克、水1000毫升；液体种初级培养用培养基为：麸皮微粉3克、豆粕微粉3克、玉米微粉2克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、水1000毫升

2)、扩大培养阶段。

将耳友菌与血耳芽孢用700升的气升式发酵罐，分别进行加水、投料、灭菌、冷却、接种、25℃下保压0.03兆帕充气发酵培养。耳友菌扩大培养的时间为6天，血耳芽孢扩大培养的时间为5天。

麸皮微粉0.4份、豆粕微粉0.4份、玉米微粉0.3份、葡萄糖2份、硫酸镁0.13份、磷酸二氢钾0.13份、聚醚型消泡剂0.15份，水101份。

3)、混合液体种接种木屑麸皮培养基的固体血耳种培养阶段。

3.1.培养基配方：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒77％、麸皮21％、蔗糖1.1％、石膏粉0.9％；含水量49％。常规方法搅拌均匀后用高压聚丙烯塑料滤菌透气袋盛装，每袋装料25kg,扎紧袋口，置于高压灭菌锅中高压灭菌。

3.2.接种：准备一间消毒过的房间。将灭菌后的培养基及小料袋、拌料机、装袋机，扎口机等放进接种间提前消毒；进行无菌操作；耳友菌和血耳的液体种按1.1:1的比例混合后与培养基边搅拌边混合，控制培养基含水量在53％；装袋；扎口。

3.3.将接种过混合液体菌种的培养基袋移送至24℃的培养室，避光培养，28天菌丝即可长满。

实施例5

培养血耳混合菌种的方法，其工艺流程包括如下步骤：

1).分离、纯化及初步培养阶段。

1.1.采集优良野生血耳标本。要求：朵大，开片好，干耳色黑、鲜耳红褐色，置于水中溶液变深红如血，根小，无病虫害。将着生的木料与血耳子实体一起取回并对其表面清洁处理后备用。

1.2.培养基准备：

制备PDA加富试管斜面分离培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、琼脂20克、水1000毫升，常规配置，分装于试管，灭菌备用；

制备血耳分离培养基：土豆200克、耳友菌培养基100克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、琼脂20克、水1000毫升，分装于试管及250毫升三角瓶适量，灭菌备用。

制备液体种培养基：麸皮微粉3克、豆粕微粉3克、玉米微粉2克、葡萄糖20克、硫酸镁1克、磷酸二氢钾1克、水1000毫升，混均分装于1000毫升三角瓶，每瓶分装500毫升，灭菌备用。

1.3.菌种分离与纯化：

在超净工作台中作业。于耳根着生处进行基内分离得到血耳“耳友菌”，接种于PDA培养基中，多次提纯后转管，25℃培养备用。

在超净工作台中作业。于血耳子实体处取材，置于盛有血耳分离培养基的三角瓶中获取血耳孢子，经提纯，转接试管斜面分离培养基，25℃培养备用。

1.4.常规接种。将长满斜面的耳友菌挑取适量接种于液体三角瓶培养基；耳友菌接种48小时后，挑取试管中血耳芽孢团于另一个液体三角瓶培养基；置于25℃下，170转/min培养。耳友菌培养3天取样无菌操作菌检，若无杂菌污染第5天使用，血耳芽孢菌种48小时后无菌操作取样菌检，若无污染24小时后使用。

2)、扩大培养阶段。

将耳友菌与血耳芽孢用700升的气升式发酵罐，分别进行加水、投料、灭菌、冷却、接种，25℃下保压0.03兆帕充气发酵培养。时间安排上，血耳芽孢培养接种迟于耳友菌48小时。耳友菌液体种72小时后取样菌检，若无污染第5天使用；血耳芽孢液体种48小时后取样菌检，若无污染第3天使用。

其中扩大培养所用液体培养基配方为：麸皮微粉0.3份、豆粕微粉0.3份、玉米微粉0.2份、葡萄糖2份、硫酸镁0.1份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸三丁酯0.18％，水100份。

3)、混合液体种接种木屑麸皮培养基的血耳固体菌种培养阶段。

3.1.培养基配方：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒78％、麸皮20％、蔗糖1％、石膏粉1％；含水量50％。常规方法搅拌均匀后，用高压聚丙烯塑料滤菌透气袋盛装，每袋装料25kg，扎紧袋口，置于高压灭菌锅中，0.15兆帕灭菌2小时，冷却备用。15×28cm高压聚丙烯塑料滤菌透气袋适量，用大的高压聚丙烯滤菌透气袋盛装后扎紧，如上法高压灭菌后，冷却备用。

3.2.装料器具及接种室准备：准备一间20平方米的接种间及与之相连的6平米的缓冲间，要求房间密闭条件好，四周及地面贴瓷砖便于清洁消毒，装匹配的紫外线灯管及照明灯管，使用前用杀菌剂清洁、熏蒸消毒备用。准备一台搅拌机、一台装料机、一台扎口机，将灭菌冷却后的培养基、小料袋、三种机械等放进接种间。准备四套连体接种工作服及卫生帽、胶鞋、手套，放进缓冲间。将培养成熟的上述两种液体种，通过灭菌管道三通连接：一端接耳友菌发酵罐出料口，一端接血耳芽孢发酵罐出料口，还有一端接电磁阀及接种喷口至接种间里的搅拌机。调试两个发酵罐充排气平衡罐压至0.12兆帕。接种前一天对接种间与缓冲间常规消毒。

3.3.接种：接种人员4人，分别负责拌料、装料、扎口与码放。接种时首先进入缓冲间，换戴消毒后的衣、帽、鞋、手套，再进入接种间。首先启动搅拌机，每次加培养基2袋，料重50kg，边搅拌边喷雾，将耳友菌和血耳芽孢按1:1的比例混合液体种，调节混合料湿度至55％时结束喷雾液体菌种。将装料机进料口置于拌料机出料口下方，启动。一人负责套袋装料；一人在装料的下方，负责接袋、扎口；一人在扎口的下方，负责接袋、码放。每两袋培养基拌、装、扎、码放结束，再进行下一组。如此连续进行，直到将培养基拌装结束。

3.4.将接种过混合液体菌种的培养基袋移送至25℃的培养室，避光培养，28天左右菌丝即可长满；除白色耳友菌菌丝外，大量点状白色菌球(血耳孢子萌发长出血耳菌丝)出现；待菌种成熟，即可用于栽培。将此菌种置于光照刺激，通风培养，即有血红分泌物及血耳耳芽产生。

试验例1本发明的混合菌种与传统菌种栽培效果比较。

使用上述实施例1～5制备的混合菌种与传统菌种进行实际生产栽培效果比较。每组选取一米长，直径8CM粗的栓皮栎原木50根，各组原木栽培环境完全一致，接种穴数一样，管理一样。其中：平均菌种培育时间＝从野生血耳菌上分离菌种开始至可用于原木栽培所用时间；平均穴出耳率＝每组出耳总穴数/每组原木接种总穴数×100％；平均杂菌率＝每组污染杂菌总穴数/每组原木接种总穴数×100％(污染杂菌的定义为：接种穴中长出不同于耳友菌及血耳菌的其它微生物)；原木栽培平均出耳时间＝从菌种接种至原木长出首批血耳子实体(商品)所需时间；平均产量＝每组原木所长出的成熟血耳的干重之和/每组原木根数；总培养时间＝平均菌种培育时间+原木栽培首批出耳所需时间，每组总产量＝平均产量×50根。

表1混合菌种与传统菌种栽培效果比较

综上所述，本发明提供了一种培养血耳混合菌种的方法，该方法由于菌种是耳友菌与血耳菌的混合菌种，不需自然接种血耳孢子，大大增加了菌种的穴出耳率，保证了菌株的单一性；原木接种后，接种口可以封口养菌，减小了不良环境因素对接种穴中菌种的影响，保障了血耳的正常生长发育，菌种成活率大幅提升。如果栽培环境适宜，3个月即可长出血耳子实体，大幅缩短了栽培时间；由于封口养菌的缘故，杂菌污染的可能大为降低，血耳产量与品质有了大幅提高。

本发明质量可控性高、生育期短，劳动生产率得到了提高，且生物转化率相对较高，是一种具有较高推广价值的培养血耳菌种的新方法。推广应用本发明，利于推进山区农村血耳栽培，既丰富了食用菌产业新的栽培品种，促进了山区农村经济的发展，又为市场提供了丰富优质的血耳产品，使广大人民群众吃的起、吃的着，让血耳不再是富人们的专享，也有益于广大人民群众健康水平的提高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、分离野生血耳中的耳友菌与血耳担孢子菌种，分别纯化并初步培养，得到两种菌种；

2)、将两种菌种分别于液体培养基中进行扩大培养，将扩大培养完成后的两种菌种混合，得到混合液体种；

3)、将混合液体种混合搅拌接种于木屑麸皮培养基进行培养，获取用于血耳栽培的血耳固体混合菌种。

2.如权利要求1所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述的液体培养基主要由以下组份制成：

麸皮微粉0.2～0.5份、豆粕微粉0.2～0.5份、玉米微粉0.1～0.3份、葡萄糖1.5～2.5份、硫酸镁0.05～0.15份、磷酸二氢钾0.05～0.15份、消泡剂0.1～0.2份、水98～102份。

3.如权利要求2所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，所述消泡剂包括天然油脂、聚醚类消泡剂、硅类消泡剂、聚醚改性硅消泡剂中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，耳友菌扩大培养的时间为5～7天，血耳芽孢扩大培养的时间为3～5天。

5.如权利要求4所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，扩大培养时发酵罐内的温度为23～25℃。

6.如权利要求1所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述的混合液体种培养时所用的固体培养基按照重量百分数计，包括：

1～4毫米大小的栓皮栎干木屑颗粒76～80％、麸皮18～22％、蔗糖0.8～1.2％、石膏粉0.8～1.2％。

7.如权利要求6所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，所述的固体培养基含水量为47～53％。

8.如权利要求7所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，

所述的混合液体种按照体积比，血耳菌/耳友菌的比值在1～1.3之间。

9.如权利要求8所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，

将混合液体种混合搅拌接种于木屑麸皮培养基进行培养时，接种了混合液体种的培养基含水量控制在52～55％。

10.如权利要求9所述的培养血耳混合菌种的方法，其特征在于，所述的混合液体种培养温度为23～25℃。