CN105543104B

CN105543104B - 一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法

Info

Publication number: CN105543104B
Application number: CN201610006142.8A
Authority: CN
Inventors: 谢春芹; 曹正; 贾君; 许俊齐
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2016-01-05
Filing date: 2016-01-05
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2036-01-05
Also published as: CN105543104A

Abstract

本发明公开了一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法，固体培养基采用主料40g、配料2g、栽培营养液60mL的配方；其中主料选自杂交米、玉米、小麦和荞麦中的一种，配料选自蚕蛹粉、脱脂奶粉、蛋清、蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋中的一种；对野生蝉花菌种进行人工驯化培养，并提出了相应的发菌管理、原基形成管理、出草管理方法，较传统菌种培养方法，提出了一种系统有效的对野生蝉花进行人工驯化栽培培养基的优化方法，从而为野生蝉花的人工规模化栽培提供可行的技术指导和服务的野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法。

Description

一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法

技术领域

本发明涉及生物菌剂领域，尤其涉及一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法。

背景技术

蝉花又名金蝉花、蝉茸、蝉蛹草、虫花等，为麦角菌科真菌大蝉草寄生在蝉科昆虫若虫上的子座及若虫尸体的复合体。蝉花的主要成分有虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、多种维生素、麦角甾醇、蛋白质以及超氧化物歧化酶等,蝉花与冬虫夏草的无性型同属，它的所含成分和药用价值能够与冬虫夏草媲美。具有镇痛、镇静催眠、抗高血压、双向免疫调节、抗肿瘤生成及抗炎、改善肾功能等作用。

由于蝉花是一种具有药用和滋补功效的珍贵传统中药材，以蝉花为原料的药用保健品在不断的开发，野生蝉花的数量已经远远不能满足国内外市场的需求。然而在自然条件下，蝉花的出产率非常的低，天然野生蝉花的产生总是依赖于寄主，而寄主又受自然环境的制约。因此推出人工培养品来替代日益枯竭的自然资源，人工培养物的主要生物活性成分、药理学作用均和天然蝉花相似或超出天然蝉花。

目前人工栽培蝉花的事业刚刚起步，尚处于发展时期。而国内外市场对蝉花及其深加工产品的需求量很大，因此，人工栽培蝉花的市场前景广阔，也必将会给种植者带来可观的经济效益，同时也将产生巨大的社会效益。

目前尚无一套系统有效的对野生蝉花进行人工驯化栽培培养基的优化方法，从而为野生蝉花的人工规模化栽培提供可行的技术指导和服务。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的野生蝉花人工驯化培养过程中存在的问题，本发明提出了一种系统有效的对野生蝉花进行人工驯化栽培培养基的优化方法，从而为野生蝉花的人工规模化栽培提供可行的技术指导和服务的野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法，包括如下步骤：

(1)液体菌种的制备：采用以下配方的液体培养基以常规的培养方法进行制备：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B1210片，水1000mL，pH 5.0-6.0；

(2)固体培养基的制备：

i)栽培营养液的配方：葡萄糖36g,蛋白胨15g，磷酸二氢钾3g,硫酸镁3g，柠檬酸3g，维生素B130片，蒸馏水2000mL，pH自然；

ii)固体培养基的配方：主料40g、配料2g、栽培营养液60mL；其中主料选自杂交米、玉米、小麦和荞麦中的一种，配料选自蚕蛹粉、脱脂奶粉、蛋清、蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋中的一种；

iii)固体培养基的配制：选用新鲜无霉变的主料及其他配料成分，按照ii)中配方进行称量备用；按i)的配方配制好栽培营养液备用，首先将易溶的配料加入已冷却至常温的栽培营养液中，不断地搅拌，直至充分混匀；再将难溶的配料拌入主料中置于瓶内，最后将营养液倒入瓶中；用聚丙烯塑料薄膜封口一层，用橡皮筋扎紧；在121℃、0.1-0.12MPa压力下灭菌40min后冷却至室温以备接种所用；

(3)接种：将已灭菌的料瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种枪等放人超净工作台中，开启紫外线灯照射30min无菌状态下将料瓶一侧揭开一条缝,用接种枪吸取步骤(1)制备的液体菌种射入瓶内,盖好封口膜；每瓶接种量为3～4mL；

(4)培养及发菌管理：接种后的料瓶，置于清洁、避光的环境中培养；空气相对湿度为65％，初始阶段，培养温度保持在15-19℃，待料面布满菌丝后，将温度升高至20-23℃，培养10-15天后，菌丝即可吃透培养料，布满培养料；

(5)原基形成管理：当菌丝长满培养基并在表面出现一些小小隆起时，表明菌丝的营养生长阶段已结束；此时需要光照，在培养室内采用日光灯，每天进行10-14h的散射光照射，促使菌丝体扭结和刺激原基形成；

(6)出草管理：当绝大多数的料瓶内均出现原基时,进入子实体生长阶段，温度控制在18-22℃,空气相对湿度为85％-90％,以减少瓶内水分挥发，进行通风保持恒温培养箱内空气清新；原基出现后,用已灭菌的大头针在封口膜上扎几个小孔通气，排出瓶内的CO₂，原基长到0.2-0.5cm,菌丝团分裂形成多个芽,并不断生长、变粗,培养至45-50d,瓶中布满紧密的白色鹿角状体，子座长到一定高度4-5cm，表面有白色粉末状孢子产生即可采收。

更进一步的，所述步骤(2)ii)中主料选择荞麦，配料选择蚕蛹粉。

更进一步的，所述步骤(2)ii)中主料选择杂交米，配料选择蚕蛹粉或脱脂奶粉。

更进一步的，所述步骤(2)ii)中主料选择杂交米，配料选择脱脂奶粉。

更进一步的，所述步骤(2)ii)中主料选择玉米，配料选择脱脂奶粉。

更进一步的，选择玉米在作为主料时应提前浸泡12h，并加水煮沸保持20min直至变软然后将水沥干后使用。

更进一步的，所述步骤(2)ii)中主料选择小麦，配料选择蛋清。

有益效果：本发明提供的一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法，固体培养基采用主料40g、配料2g、栽培营养液60mL的配方；其中主料选自杂交米、玉米、小麦和荞麦中的一种，配料选自蚕蛹粉、脱脂奶粉、蛋清、蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋中的一种；对野生蝉花菌种进行人工驯化培养，并提出了相应的发菌管理、原基形成管理、出草管理方法，较传统菌种培养方法，培养出的野生蝉花质量有了明显的提高，且生物转化率高，本发明提出了一种系统有效的对野生蝉花进行人工驯化栽培培养基的优化方法，从而为野生蝉花的人工规模化栽培提供可行的技术指导和服务的野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例1：

(2)固体培养基的制备：

ii)固体培养基的配方：主料40g、配料2g、栽培营养液60mL；其中主料为荞麦，配料为蚕蛹粉；

实施例2：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用杂交米为主料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

实施例3：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用玉米为主料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

其中玉米应提前浸泡12h，并加水煮沸保持20min直至变软然后将水沥干后使用。

实施例4：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用小麦为主料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

培养基中的主料对蝉花生长、产量有很大的影响，不同主料的营养成分不同，直接影响蝉花产量的多少。对实施例1-4得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表1所示：

表1不同主料培养基对蝉花生长的影响

注：第一潮子座：是指培养基第一次长出的子座；第二潮子座：是是指培养基第二次长出的子座；

生物转化率(％)＝两潮子座鲜重之和/培养基的干料重×100％

由表1可以看出，蝉花在不同主料的培养基中都可以生长，并长出子座，说明蝉花菌丝能够利用的主料很多；但是不同主料中蝉花的生长状况有差异，首先从鲜重和生物转化率上来分析，荞麦主料最好，第一潮子座的鲜重达到19.16g，生物转化率为71.99％；其次是小麦，第一潮子座的鲜重达到18.74g、转化率为71.31％；杂交米比小麦差，玉米是最差的，鲜重才到2.15g、转化率为5.12％。

实施例5：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用脱脂奶粉为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

实施例6：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

实施例7：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例1相同。

培养基中的辅料为其提供氮源，相同主料的前提下，不同氮源对蝉花生长、产量也有很大的影响，实施例1、5、6、7以荞麦为主料，改变其辅料种类进行试验，对实施例1、5、6、7得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表2所示：

表2荞麦主料在不同氮源条件下对蝉花生长的影响

由表5可以看出，蝉花在荞麦主料和不同氮源的条件下培养，其生长及子实体产量不同。具体情况如下：蚕蛹粉的鲜重达到44.46g、转化率为64.92％；次之是脱脂奶粉，其鲜重为37.95g、转化率为57.04％；前两者都高于蛋清等其他氮源，生长及产量多少的顺序是蚕蛹粉>脱脂奶粉>蛋清>鸡蛋，因此以荞麦为主料时，选择蚕蛹粉为辅料为最佳的配方。

同时以杂交米为主料，改变其辅料成分进行试验比较蝉花的生长情况，具体如实施例2、8、9、10：

实施例8：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用脱脂奶粉为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例2相同。

实施例9：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例2相同。

实施例10：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例2相同。

对实施例2、8、9、10得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表3所示：

表3杂交米主料在不同氮源条件下对蝉花生长的影响

由表3可以看出，杂交米在不同氮源条件下对蝉花子实体生长有差异。从鲜重和生物转化率来看，蚕蛹粉和脱脂奶粉相差很小，但脱脂奶粉的子座最高，且形态是最好的；其次是蛋清，鲜重达到27.54g，转化率为39.37％；鸡蛋是四个氮源中最差的，鲜重与转化率明显地低于蚕蛹粉和脱脂奶粉。因此以杂交米为主料时，选择脱脂奶粉为辅料均为最佳的配方。

同时以玉米为主料，改变其辅料成分进行试验比较蝉花的生长情况，具体如实施例3、11、12、13：

实施例11：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用脱脂奶粉为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例3相同。

实施例12：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例3相同。

实施例13：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例3相同。

对实施例3、11、12、13得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表4所示：

表4玉米主料在不同氮源条件下对蝉花生长的影响

由表4可以看出，玉米主料在不同氮源条件下对蝉花培养也不相同。玉米第一潮子座的产量很低，同时还没有第二潮子座的产量。但脱脂奶粉显著地高于鸡蛋、蚕蛹粉、蛋清，鲜重为7.22g、转化率达到8.60％；最不理想的就是蚕蛹粉，鲜重是0.84g、转化率为1.00％。因此以玉米为主料时，选择脱脂奶粉为辅料为最佳的配方。

同时以小麦为主料，改变其辅料成分进行试验比较蝉花的生长情况，具体如实施例4、14、15、16：

实施例14：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用脱脂奶粉为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例4相同。

实施例15：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例4相同。

实施例16：

步骤(2)ii)固体培养基的配方中采用蛋清与蛋黄混匀的鸡蛋为辅料，其余配方以及培养方法均与实施例4相同。

对实施例4、14、15、16得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表5所示：

表5小麦主料在不同氮源条件下对蝉花生长的影响

由表5可以看出，不同氮源条件下的小麦主料在培养蝉花子实体的变化。小麦主料在蚕蛹粉、脱脂奶粉、蛋清、鸡蛋的作用下，蝉花产量整体很好。蝉花子实体的鲜重和生物转化率情况如下：蛋清是最好的，第一潮子座鲜重达到39.47g、第二潮子座为26.95g、转化率为79.07％；其次的是脱脂奶粉，随之是蚕蛹粉和鸡蛋。因此以小麦作为主料时，选择蛋清为辅料为最佳选择。

传统栽培野生蝉花的固体培养基主料是杂交米或小麦，辅料是蚕蛹，培养基的营养液中的微量元素是VB1，采用传统的以杂交米为主料以蚕蛹为辅料、微量元素添加为VB1的培养基和传统的以小麦为主料以蚕蛹为辅料/微量元素添加为VB1的培养基，培养方法按照传统培养方法进行，与实施例8的优化的杂交米为主料的培养基、实施例15优化的小麦为主料的培养基进行试验对比，对其得到的菌种的生长情况和子实体的产量进行测定，具体以出草后的子座高度、鲜重和生物转化率来进行比较衡量，结果如表6所示：

表6蝉花传统固体培养与优化固体培养基对蝉花生长的影响

由表6可以看出，本发明实施例8和5实施例1优化的固体培养基培养基培养的蝉花子实体再鲜重和生物转化率上都具有明显的优势。

综上，.本发明一种野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法，较传统的培养方法，培养出的野生蝉花菌种质量有了明显的提高，且生物转化率高，为野生蝉花的人工规模化栽培提供可行的技术指导和服务的野生蝉花的人工驯化栽培固体培养基的优化方法。

此外，在人工固体栽培中添加相同氮源条件下荞麦、小麦、玉米、杂交大米四主料为碳源的培养基中以荞麦培养基的蝉花生长的最优；.人工固体栽培中因栽培碳源的主料不同所需的辅料氮源也不同，而在荞麦为主料的固体培养中添加蚕蛹粉的蝉花生长的最优，在大米为主料的固体培养中添加蚕蛹粉和脱脂奶的蝉花生长的最优，在玉米为主料的固体培养中添加脱脂奶的蝉花生长的最优，在小麦为主料的固体培养中添加蛋清和脱脂奶的蝉花生长的最优，因此，生产中可根据当地的资源合理选择规模生产栽培配方，以期实现野生蝉花的人工高效栽培。

应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims

1.一种野生蝉花的人工驯化栽培方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）液体菌种的制备：采用以下配方的液体培养基以常规的培养方法进行制备：可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g，维生素B12 10片，水1000mL，pH 5.0-6.0；

（2）固体培养基的制备：

i）栽培营养液的配方：葡萄糖36g, 蛋白胨15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，柠檬酸3g，维生素B1 30片，蒸馏水2000mL，pH自然；

ii）固体培养基的配方：主料40g、配料2g、栽培营养液60mL；其中主料选择小麦，配料选择蛋清；

iii）固体培养基的配制：选用新鲜无霉变的主料及其他配料成分，按照ii)中配方进行称量备用；按i)的配方配制好栽培营养液备用，首先将易溶的配料加入已冷却至常温的栽培营养液中，不断地搅拌，直至充分混匀；再将难溶的配料拌入主料中置于瓶内，最后将营养液倒入瓶中；用聚丙烯塑料薄膜封口一层，用橡皮筋扎紧；在121℃、0.1-0.12MPa压力下灭菌40min 后冷却至室温以备接种所用；

（3）接种：将已灭菌的料瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种枪等放入超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，无菌状态下将料瓶一侧揭开一条缝, 用接种枪吸取步骤（1）制备的液体菌种射入瓶内, 盖好封口膜；每瓶接种量为3～4mL；

（4）培养及发菌管理：接种后的料瓶，置于清洁、避光的环境中培养；空气相对湿度为65%，初始阶段，培养温度保持在15-19℃，待料面布满菌丝后，将温度升高至20-23℃，培养10-15天后，菌丝即可吃透培养料，布满培养料；

（5）原基形成管理：当菌丝长满培养基并在表面出现一些小小隆起时，表明菌丝的营养生长阶段已结束；此时需要光照，在培养室内采用日光灯，每天进行10-14h的散射光照射，促使菌丝体扭结和刺激原基形成；

（6）出草管理：当绝大多数的料瓶内均出现原基时，进入子实体生长阶段，温度控制在18-22℃，空气相对湿度为85%-90%，以减少瓶内水分挥发，进行通风保持恒温培养箱内空气清新；原基出现后，用已灭菌的大头针在封口膜上扎几个小孔通气，排出瓶内的CO₂，原基长到0.2-0.5cm，菌丝团分裂形成多个芽，并不断生长、变粗，培养至45-50d，瓶中布满紧密的白色鹿角状体，子座长到一定高度4-5cm，表面有白色粉末状孢子产生即可采收。