CN112913585A - 一种蝉花菌丝体营养品的制备方法 - Google Patents

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CN112913585A CN202110145668.5A CN202110145668A CN112913585A CN 112913585 A CN112913585 A CN 112913585A CN 202110145668 A CN202110145668 A CN 202110145668A CN 112913585 A CN112913585 A CN 112913585A
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张婷
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Abstract

本发明公开了一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，具体步骤为：(1)菌种的分离与活化：将野生蝉花菌种接种于改良PDA培养基中，培养得到蝉花菌丝；(2)菌丝体的培养：将所述蝉花菌丝接种于培养基质中，在黑暗条件下培养6‑12d，烘干、粉碎后即得一种蝉花菌丝体营养品；其中，所述培养基质由营养液和基质组成，所述基质和所述营养液的质量比为1:1.1‑1.4；所述基质包括湿小麦和蚕蛹粉。本发明以野生蝉花为菌种，进行固态发酵，得到的蝉花菌丝体含多糖58.22mg/g、虫草酸7.20mg/g、粗蛋白77.66mg/g、粗脂肪25.98mg/g、灰分0.15mg/g，以此开发野生蝉花营养品，为野生蝉花的广泛应用提供基础。

Description

一种蝉花菌丝体营养品的制备方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种蝉花菌丝体营养品的制备方法。
背景技术
蝉花(Cordyceps cicadae)是麦角菌科真菌大蝉草(Cordyceps cicadae Shing)寄生于蝉科昆虫山蝉(Cicada flammata Dist)形成的复合体，是我国传统的中药材之一，主要产于浙江、四川、云南、江苏以及安徽等地。
蝉花性寒味甘，具有疏风散热的功效，是一种食药两用真菌，现代药理实验研究表明：蝉花具有滋补强壮、镇静催眠、调节脂类代谢、免疫调节、改善肾功能、抗肿瘤的作用。《中药大辞典》中记载该菌子实体含有多糖、虫草素、甘露醇、麦角甾醇及其他生理活性物质。研究表明蝉花多糖具有很好的抗氧化活性，可加强免疫调节。目前对于蝉花多糖的研究多为粗多糖以及甘露聚糖的研究，周俐斐等研究测定的蝉花总多糖含量达50％以上；虫草素具有抗肿瘤和抗癌，免疫调节，降低血清胆固醇和β脂蛋白，增加心肌营养的作用；虫草酸具有提高血浆渗透压、利尿、平喘祛痰、抗氧化等作用，对多种疾病的治疗有效，且可作为甜味剂和食品添加剂；蝉花在医疗保健方面有着广阔的应用前景。
蝉花为野生，产量少，加上人们的不合理采收，致使蝉花资源短缺，难以广泛应用。目前，人们尝试蝉花的人工培养，陈祝安等人利用大麦、小麦、玉米等基质，胡海燕等人利用家蚕人工培育出了蝉花孢梗束；程东庆等人的研究表明，含有鸡蛋、蚕蛹等成分的液体培养基，蝉花菌丝得率最高；文庭池等人研究发现蛹虫草子实体中虫草素的含量随培养基质米粒的增大而变小，子实体产量却随米粒的增大而增加，当采用整米作为培养基质时产量最大。偏酸性的营养液有利于提高子实体产量，提高虫草菌素的含量。曾凡清等人研究发现小麦较玉米培养基质形成蝉花菌丝团的时间短，菌丝长速快。但是，目前仍存在人工培育蝉花产量低，成本高等问题，尚未进行大规模生产，市场上也无相关产品。
为此，能够提供一种产量高、成本低的蝉花菌丝体营养品的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，本发明以野生蝉花为菌种，进行固态发酵，得到的蝉花菌丝体含多糖58.22mg/g、虫草酸7.20mg/g、粗蛋白77.66mg/g、粗脂肪25.98mg/g、灰分0.15mg/g，以此开发野生蝉花营养品，为野生蝉花的广泛应用提供基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，具体步骤为：
(1)菌种的分离与活化：在无菌条件下，分离野生蝉花子实体接种于改良PDA培养基中，培养得到蝉花菌丝，将所述蝉花菌丝再转接3-5次，培养得野生蝉花菌种；
(3)菌丝体的培养：将所述野生蝉花菌种接种于培养基质中，在黑暗条件下培养6-12d，将所得发酵物烘干、粉碎后即得一种蝉花菌丝体营养品；
其中，所述培养基质由营养液和基质组成，所述基质和所述营养液的质量比为1:1.1-1.4；所述基质包括湿小麦和蚕蛹粉。
本发明以野生蝉花为菌种，进行固态发酵；蝉花菌丝活化最佳培养基为改良PDA培养基，固态发酵基质为小麦培养基质，得到的菌丝中虫草酸、粗蛋白、粗脂肪含量高，增加比率高，以此开发野生蝉花营养品，为野生蝉花的广泛应用提供基础。
优选地，步骤(1)中所述改良PDA培养基为在PDA培养基中加入K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、VB10.02g/L、蛋白胨2g/L和蚕蛹粉2-5g/L。
蝉花是寄生于山蝉体内的真菌，分离菌种时，在培养基中加入蚕蛹粉，形成仿野生营养条件；加入蛋白胨、矿质元素、维生素等增加培养基中易吸收的氮源、矿物质和维生素，保证营养平衡和供应，能促进菌丝生长。
优选地，步骤(1)中所述培养的具体条件为：23-28℃下培养6-12d。
依据蝉花菌丝生长条件，确定上述蝉花菌丝培养条件，此条件下，菌丝生长速度快、菌丝粗壮，色泽洁白。
优选地，步骤(2)中所述蝉花菌丝的接种量为5-10％。
接种量直接影响发酵快慢，一般接种量为3-5％，此接种量稍高，能加快固体发酵过程。
优选地，步骤(2)中所述培养的温度为23-28℃，湿度为65-80％。
蝉花子实体生长的湿度一般在75％以上，而蝉花菌丝体培养环境湿度略低于子实体生长。
优选地，步骤(2)中所述营养液的原材料包括：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO40.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L和VB110mg/L。
该营养液较PDA培养基提供蝉花菌丝更易吸收的氮源和营养元素，有利于菌丝生长。
优选地，步骤(2)中所述湿小麦：蚕蛹粉质量比为110-130：0.8-1.2。
湿小麦粒经灭菌降低了硬度，且麦粒之间有空隙，能通气，有利于菌丝吸收营养和生长；而蚕蛹粉为菌丝生长提供仿野生营养条件，较其他培养基更适合蝉花菌丝生长。
优选地，步骤(2)中所述烘干的温度为45℃。
本发明采用低温烘干，保证蝉花营养成分和生物活性物质不发生变化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，本发明以野生蝉花为菌种，进行固态发酵，得到的蝉花菌丝体含多糖58.22mg/g、虫草酸7.20mg/g、粗蛋白77.66mg/g、粗脂肪25.98mg/g、灰分0.15mg/g，以此开发野生蝉花营养品，为野生蝉花的广泛应用提供基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明对比例1中5种培养基的菌丝生长情况图；
图2为本发明对比例2中3种培养基的菌丝生长情况图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，具体步骤为：
(1)菌种的分离与活化：在无菌条件下，分离野生蝉花子实体接种于改良PDA培养基中，25℃下培养10d，培养得到蝉花菌丝，将蝉花菌丝再转接3次，培养得野生蝉花菌种；其中，改良PDA培养基的原材料包括：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、VB10.02g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3.5g/L和蒸馏水；
(2)菌丝体的培养：将野生蝉花菌种接种于培养基质中，接种量为5％，在黑暗条件下，湿度为70％，25℃培养10d后，发酵物经45℃烘干，粉碎至100目，即得一种蝉花菌丝体营养品。经检测分析，蝉花营养品含多糖58.22mg/g、虫草酸7.20mg/g、粗蛋白77.66mg/g、粗脂肪25.98mg/g、灰分0.15mg/g；
其中，培养基质由营养液和基质组成，基质和营养液的质量比为1:1.3；营养液的原材料包括：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB110mg/L；基质：湿小麦：蚕蛹粉质量比120:1，将培养基质于121℃，0.1MPa下灭菌30min，灭菌完成后，使其温度降至室温，备用。
实施例2
一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，具体步骤为：
(1)菌种的分离与活化：在无菌条件下，分离野生蝉花子实体接种于改良PDA培养基中，23℃下培养12d，培养得到蝉花菌丝，将蝉花菌丝再转接5次，培养得野生蝉花菌种；其中，改良PDA培养基的原材料包括：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、VB10.02g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3.5g/L和蒸馏水；
(2)菌丝体的培养：将野生蝉花菌种接种于培养基质中，接种量为5％，在黑暗条件下，湿度为65％，23℃培养12d后，发酵物经45℃烘干，粉碎至100目，即得一种蝉花菌丝体营养品；
其中，培养基质由营养液和基质组成，基质和营养液的质量比为1:1.1；营养液的原材料包括：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB110mg/L；基质：湿小麦：蚕蛹粉质量比110:0.8，将培养基质于121℃，0.1MPa下灭菌30min，灭菌完成后，使其温度降至室温，备用。
实施例3
一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，具体步骤为：
(1)菌种的分离与活化：在无菌条件下，分离野生蝉花子实体接种于改良PDA培养基中，28℃下培养6d，培养得到蝉花菌丝，将蝉花菌丝再转接3次，培养得野生蝉花菌种；其中，改良PDA培养基的原材料包括：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、VB10.02g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3.5g/L和蒸馏水；
(2)菌丝体的培养：将野生蝉花菌种接种于培养基质中，接种量为10％，在黑暗条件下，湿度为80％，28℃培养6d后，发酵物经45℃烘干，粉碎至100目，即得一种蝉花菌丝体营养品；
其中，培养基质由营养液和基质组成，基质和营养液的质量比为1:1.4；营养液的原材料包括：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB110mg/L；基质：湿小麦：蚕蛹粉质量比130:1.2，将培养基质于121℃，0.1MPa下灭菌30min，灭菌完成后，使其温度降至室温，备用。
对比例1
活化培养基的优化：
培养基具体为：
1号活化培养基原材料包括：马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蒸馏水、葡萄糖20g/L；
2号活化培养基原材料包括：马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蒸馏水、葡萄糖20g/L、蚕蛹粉3.5g/L；
3号活化培养基原材料包括：蛋白胨2g/L、KH2P040.46g/L、葡萄糖20g/L、MgSO40.5g/L、琼脂20g/L、酵母膏2g/L、蚕蛹粉3.5g/L、蒸馏水；
4号活化培养基原材料包括：NaNO33g/L、K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、KCL 0.5g/L、FeSO40.01 g/L、蔗糖30g/L、琼脂20g/L、蚕蛹粉3.5g/L、蒸馏水；
实施例1活化培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、K2HP041g/L、MgSO40.5g/L、VB10.02g/L、蛋白胨2g/L、蚕蛹粉3.5/Lg/瓶和蒸馏水
将长势好、均匀一致的野生蝉花菌丝(菌种)，用直径1cm的打孔器取菌饼1个，同时接种于实施例1、1号、2号、3号和4号直径8cm的活化培养基中间，每组设置三个平行，放于25℃培养箱中培养3d，菌丝生长出现明显差别后，每天用菌落计数仪拍照记录菌丝生长情况，并测量菌丝长度，连续记录至菌丝长满平板；蝉花菌丝培养3d后测定菌落直径并记录数据，结果如表1所示。
表1不同培养基质中蝉花菌落直径比较
Figure BDA0002930140550000071
注：同列中小写字母表示在5％水平上的差异显著性，相同则不显著，不同则显著；下同；
根据如图1所示和表1数据可知，将菌落直径数据利用SPSS进行差异显著性分析，不同培养基质对蝉花菌丝的生长有影响实施例1培养基最利于蝉花菌丝生长，后面依次是4号，3号，2号，1号培养基中菌丝长势最差；加入蚕蛹粉的2号培养基比未加蚕蛹粉的1号培养基更利于菌丝的生长；实施例1的改良PDA培养基，相比较另外的4种培养基，蝉花菌丝长速最快。
对比例2
培养基质对蝉花菌丝生长的影响研究
培养基质为：
培养基质由营养液和基质构成，基质与营养液比例为1：1.3。
1号培养基质
营养液：蛋白胨10g/L、蔗糖20g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、KH2PO40.1g/L；基质：大米30g/瓶(250mL)、蚕蛹粉0.5g/瓶(250mL)；
2号培养基质
营养液：蛋白胨10g/L、蔗糖20g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、KH2PO40.1g/L；基质：大米30g/瓶(250mL)；
3号培养基质
营养液：蛋白胨10g/L、蔗糖20g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、KH2PO40.1g/L；基质：湿小麦60g/瓶(250mL)、蚕蛹粉0.5g/瓶(250mL)；
4号培养基质
营养液：蛋白胨10g/L、蔗糖20g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、KH2PO40.1g/L；基质：湿小麦60g/瓶(250mL)；
5培养基质
营养液：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g、KH2PO40.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB110mg/L；基质：湿小麦60g/瓶(250mL)；
实施例1培养基质：
营养液：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g、KH2PO40.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB110mg/L；基质：湿小麦60g/瓶(250mL)、蚕蛹粉0.5g/瓶(250mL)；
取生长状态良好的蝉花菌丝，打孔取样，选择长势一致、直径1cm的菌饼分别接种于上述1号、2号、3号、4号、5号和实施例1培养基质中，置于25℃恒温，70％湿度的黑暗条件下连续培养7d，每种培养基质设置3个平行，然后菌种生长情况和菌丝体营养物质含量进行观察和检测，结果如图2和表2；
其中，蝉花菌丝体多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸法；虫草酸含量的测定参照闫文娟等测定方法；粗蛋白含量的测定参照管姚香等测定方法；粗脂肪含量的测定采用脂肪测定仪测定；灰分含量的测定采用灼烧法。
1.培养基质对蝉花菌丝生长的影响
在营养液相同的情况下，1-4号培养基质中蝉花菌丝生长情况存在差异，以湿小麦+蚕蛹粉的3号培养基质菌丝生长最好，其次为1号和4号，2号生长最差，说明小麦和蚕蛹粉培养基质利于蝉花菌丝生长；以小麦做基质的情况下，调整培养基质的营养液(4号、5号和实施例1)，培养基质中蝉花菌丝体生长也存在差异，实施例1培养基质中菌丝长势最好，基本已吃透培养基如图2所示，说明小麦培养基质，以及营养液中添加蚕蛹粉和维生素B1有利于蝉花菌丝生长；长势次之的为5号培养基质中的菌丝，4号菌丝长势较差，尚有部分培养基中的基质未被菌丝覆盖，可见小麦培养基质和营养液中添加蚕蛹粉能促进蝉花菌丝的生长。
2.不同基质配方对蝉花菌丝体生物活性成分及营养成分含量的影响
以未接入蝉花菌种的培养基为空白对照，分别测定6种培养基质菌丝体中多糖、虫草酸、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量，结果见表2。
表2不同基质配方对蝉花菌丝体生物活性成分及营养成分含量的影响
Figure BDA0002930140550000091
Figure BDA0002930140550000101
用SPSS进行差异显著性分析，如表2所示，6种培养基质中多糖含量之间差异显著，1号多糖含量最高，其次是2号，4号含量最少；多糖含量由高到低依次为1号>2号>实施例1>3号>5号>4号；加入蚕蛹粉的1号培养基质生长的菌丝体多糖含量较未添加的2号高，且二者差异显著；大米培养基质普遍高于小麦培养基质。但是从蝉花菌丝体多糖含量增加比例看，实施例1培养基质培养的蝉花菌丝体多糖含量较对照增加665.18％，实施例1培养基质主要为小麦，可能小麦更利于蝉花菌丝体多糖含量的提高。
如表2所示，6种培养基质和菌丝体中虫草酸含量之间差异显著,菌丝体中虫草酸含量由高到低依次为实施例1>1号>3号>4号>2号>5号；实施例1菌丝体中的虫草酸含量最高，且与其他5种培养基质间差异显著。
如表2所示，6种培养基质中粗蛋白含量之间差异显著,粗蛋白含量由高到低依次为实施例1>3号>5号>4号>1号>2号。
如表2所示,6种培养基质中粗脂肪含量之间差异显著,粗脂肪含量由高到低依次为实施例1>3号>5号>4号>1号>2号；实施例1菌丝体中的粗脂肪含量最高，3号和5号次之且二者差异不显著，2号最少；说明粗脂肪含量与培养基质有关。
如表2所示,6种培养基质中灰分含量之间差异显著，灰分含量由高到低依次为2号>实施例1、3、5>4号>1号；在6种菌丝体中的灰分含量中，2号含量最高，实施例1、3号、5号次之，1号最少，但是整体看，菌丝体中灰分含量均表现为下降，可能蝉花生长从基质中吸收了矿物质。
综合分析，实施例1培养基质中的蝉花菌丝长势最好，培养的蝉花菌丝体中虫草酸、粗蛋白、粗脂肪含量均高于大米培养基质，虽然多糖总含量低，但是较空白对照增加的比例最高。从蝉花菌丝生长速度和大部分生物活性成分含量综合考虑，筛选确定小麦培养基质为蝉花菌丝体营养品制备的最佳配方，即土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、VB1 10mg/L配成营养液，湿小麦60g/瓶(250mL)和蚕蛹粉0.5g/瓶250mL)作为基质，基质与营养液比例为1：1.3。
各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)菌种的分离与活化：在无菌条件下，分离野生蝉花子实体接种于改良PDA培养基中，培养得到蝉花菌丝，将所述蝉花菌丝再转接3-5次，培养得野生蝉花菌种；
(2)菌丝体的培养：将所述野生蝉花菌种接种于培养基质中，在黑暗条件下培养6-12d，将所得发酵物烘干、粉碎后即得一种蝉花菌丝体营养品；
其中，所述培养基质由营养液和基质组成，所述基质和所述营养液的质量比为1:1.1-1.4；所述基质包括湿小麦和蚕蛹粉。
2.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述改良PDA培养基为在PDA培养基中加入K2HP04 1g/L、MgSO40.5g/L、VB1 0.02g/L、蛋白胨2g/L和蚕蛹粉2-5g/L。
3.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的具体条件为：23-28℃下培养6-12d。
4.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述野生蝉花菌种的接种量为5-10％。
5.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养的温度为23-28℃，湿度为65-80％。
6.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述营养液为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L和VB1 10mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种蝉花菌丝体营养品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述湿小麦：蚕蛹粉质量比为110-130：0.8-1.2。
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