CN1141392C - 中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法。本发明在灵芝细胞培养过程中，在适当时机补加一定的营养物质，促进细胞生长，提高生物量，从而提高灵芝多糖和灵芝酸的产量。本发明所述的方法为一种更加接近工业化生产规模，更加具有工业化前景的生产方法，从而为工业化经济生产灵芝多糖和灵芝酸奠定基础。
Description
本发明属于生物工程与技术领域。涉及一种灵芝多糖和灵芝酸的生产工艺，尤其涉及一种在摇瓶和生物反应器中通过补料发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的方法。
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。自古以来，在东亚地区人们就将其作为药物或补品食用。传统中医认为，灵芝具味甘、性温、无毒，可补心、肝、脾、肺、肾之气，具滋补强身、扶正固本之功效。在我国，灵芝一直被用作包治百病的“灵丹妙药”而受到人们的信赖。现代医学研究发现灵芝中所含有效成分主要有多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、甾醇类、生物碱类、呋喃类衍生物、蛋白质、多肽和有机锗核苷等。灵芝多糖的药用价值主要有：抗癌、降血糖、免疫调节、促进蛋白质和核酸的合成、消炎和辐射保护作用；灵芝酸的药用价值主要有：护肝和排毒、降低胆固醇、抑制组织胺的释放、抑制血管紧张肽转化酶、刺激和抑制凝血作用。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝的产量和质量成为抑制灵芝应用的瓶颈，因为在自然界中野生的灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量为1毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要。于是，人们便开始栽培灵芝，然而人工栽培灵芝从播种到收获一般需要两到三个月，占地面积大，而且灵芝的产量与质量易受环境气候及虫害的影响。同人工栽培灵芝相比，发酵法生产灵芝有效成份由于生产周期短(一般为十几天)、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。发酵法生产所存在的问题是如何提高生物量和产量以及设备的单位体积得率，从而降低成本。批培养所获得的生物量和具有生物活性的代谢物(主要是灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸)产量均较低，而补料培养正好可以弥补上述缺点，达到高密度培养，从而提高产量，提高设备的利用率。对于工业化生产而言，从摇瓶到反应器的放大十分关键的，摇瓶中的实验结果只有在生物反应器得以重现，才能使其体现应用价值。
有关灵芝深层发酵研究开始于七十年代，当时的研究侧重于如何确保灵芝菌丝体成功发酵以及如何获得较多的生物量。八十年代以来，人们开始注意如何获得其生物活性物质，其中主要集中在灵芝多糖(特别是胞外多糖)的发酵生产研究方面，如：
文献：李平作，徐柔，章克昌.灵芝胞外多糖深层发酵培养基的优化；无锡轻工大学学报1998，17(4)：26-30报道了从野生子实体中分离的灵芝批培养的方法，但该方法只报道了胞外多糖的生产情况，最大生物量与胞外多糖的产量分别是14.8克/升和2.91克/升。胞外多糖的测定方法为乙醇沉淀-干重法；
文献：王明珠，黄瑞珊，吴其威，黄为群，朱章玉.灵芝GL-2的液态发酵及形态学特性的研究；上海交通大学学报1994，28(2)：138-141报道了灵芝GL-2批培养的方法，但该方法也只报道了胞外多糖的生产，最大生物量为2.14克/升；胞外粗多糖为12.73克/升。胞外多糖的测定方法为乙醇沉淀-干重法；
文献：王淑华，孙翠焕，朱万琴，王恒新，冯健.灵芝液体深层发酵工艺研究初报；微生物学杂志1994，14(5)：29-32报道了灵芝G3-1批培养的方法，但该方法只报道了胞内多糖的生产情况，胞内多糖产量仅为0.21克/升，菌体干重为2.2克/升。胞内多糖的测定方法是乙醇提取法；
日本专利：公开特许公报特开平4-304890，5pp公开了另一种主要生理活性物质一灵芝酸的发酵生产工艺，但其未提及灵芝多糖生产，且所得的产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克干重；
还有一些专利和文献也公开和报道了各种方法，如我们已经申请了“液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺”，专利公开号为：CN1264743A，但是，此专利主要是发明了一种同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺，其实验结果均为摇瓶批培养中获得的。
专利(公开号：CN1264743A)中发明人提供了一种“液体法同时生产灵芝多糖和灵芝酸工艺”，实践证明，该方法尚有改进的余地，且该方法仅适用于在摇瓶中灵芝的批培养。
同时值得注意的是，由于灵芝多糖和灵芝酸分别为初级代谢产物和二次代谢产物，两者的发酵生产条件不一，需要加以综合考察来同时优化灵芝多糖(包括胞外和胞内多糖)及灵芝酸的生产过程。因此有关在摇瓶及生物反应器中用补料发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的研究至今未见报道。
综上所述，至今尚无成熟的补料发酵法生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺。因此，尽快开发研究一种通过补料发酵法能够同时生产灵芝多糖和灵芝酸的技术，并成功地在生物反应器中得到实施，是人们所十分期望的。
本发明的目的在于公开一种在摇瓶和生物反应器中采用补料发酵同时高效率生产灵芝多糖和灵芝酸的方法，以满足人们的需要。
本发明的构思是这样的：
发明人认为，在灵芝细胞培养过程中，在适当时机补加一定的营养物质，可促进细胞生长，提高生物量，从而提高灵芝多糖和灵芝酸的产量。在生物反应器放大过程中采用适当的条件，可重现摇瓶中的实验结果，从而为工业化经济生产灵芝多糖和灵芝酸奠定基础。
根据上述构思，发明人通过大量的实验，提出了实现本发明目的的如下所述的技术方案：
使用的微生物：
用于生产所述的灵芝多糖和灵芝酸的微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，具体的菌株如下：
67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.75的菌株；
上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.110的菌株；
日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.533的菌株；
中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.616的菌株；
中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.644的菌株；
中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.653的菌株。
上述菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)菌种目录，本发明不再赘述。
培养方法：
用上述菌属的菌种采用摇瓶补料培养法和生物反应器补料培养法，以葡萄糖或蔗糖为碳源、蛋白胨和酵母膏为氮源作为种子培养基，并加入适量的无机盐和维生素，将菌种接种到液体培养基，通过液体发酵而获得含有灵芝胞外多糖的发酵液以及含有灵芝胞内多糖和灵芝酸的灵芝菌丝体，上述培养方法对温度并无严格要求，一般在室温进行。现分别叙述如下：
1.摇瓶补料培养法：
接种50～1500毫克干重/升种子于有培养基的摇瓶中，20～35℃，80～180转/分钟回旋培养，当残余糖浓度为30～0.1克/升时，补加5～50克/升的乳糖或葡萄糖或麦芽糖，继续培养，在第10～30天结束培养，收获菌丝体和发酵液。在补料培养阶段细胞量增加，同时也有利于灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸合成；
2.生物反应器补料培养法：
接种50～1500毫克干重/升种子于有培养基的生物反应器中，20～35℃，通气速率为0.02～3.50升/升/分钟，搅拌速率10～1000转/分钟，培养液中溶解氧浓度为5％～80％，培养4～30天。与摇瓶批培养的结果相比，在生物反应器中批培养细胞量增加，同时也有利于灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸的合成；当残余糖浓度为30～0.1克/升时，补加5～60克/升的乳糖或葡萄糖或麦芽糖，在第10～30天结束培养，收获菌丝体和发酵液。在补料培养阶段细胞量增加，同时也有利于灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸合成；
培养基可以采用常规的含有碳源、氮源、无机盐和维生素等成分的培养基。其中：碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、糖蜜或土豆汁等；氮源有酵母膏、蛋白胨、酪蛋白或黄豆饼粉等；无机盐包括KH2PO4、K2HPO4和MgSO4。其中麦芽糖、蔗糖有利于胞外多糖合成，乳糖有利于胞内多糖和灵芝酸的合成。有机氮源有利于细胞吸收利用。
胞外多糖通过乙醇沉淀法获得。胞内多糖通过碱溶解菌丝体后，乙醇沉淀法获得。灵芝酸通过乙醇水溶液提取后经过初步纯化获得。以上所说的方法均为现有技术，在许多文献中已有阐述，本发明不再赘述。
采用常规的分析方法对产物进行分析测试，结果表明，所述的方法可以同时获得灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸。细胞干重可达21.89克/升(大于20克干重/升，达到高密度培养)；灵芝酸含量和产量可达2.05毫克/100毫克、367.1毫克/升，胞外、胞内多糖分别为0.87、2.49克/升(胞内含量14.65毫克/100毫克干重)，胞内和胞外多糖总量高达3.36克/升。
本发明生物量可达21.89克/升，在专利(公开号：CN1264743A)中实施例2为液体好氧发酵-液体静置培养法中生物量为20.9克/升。但本发明计算生物量的方法与专利(公开号：CN1264743A)是不同的：本发明计算生物量的方法是以细胞干重除以发酵开始时摇瓶中培养液的体积50mL，而前一专利是以细胞干重瓶除以发酵结束时摇瓶中培养液体积(一般为35～40mL)，从而使得生物量与本发明相比偏高至少20％，同时也使得胞内多糖与灵芝酸的计算结果均至少偏高20％。本发明在灵芝液体振荡培养中达到的细胞高密度，明显超过以前的文献报道的生物量。
灵芝酸含量同市售灵芝和迁仓等报道的相比，前两者采用同样测定方法分别获得的结果为1毫克/100毫克和0.46-1.0毫克/100毫克，本实施例5中灵芝酸含量和产量分别为2.05毫克/100毫克和367.1毫克/升，除了低于我们前一专利(公开号为：CN1264743A)静置培养中灵芝酸的含量(2.8毫克/100毫克)和产量(581毫克/升)外，明显高于以往的其他报道，是有关液体振荡培养的文献报道的最高值。
胞外多糖产量为0.87克/升，同其他报道相比较为接近。虽然李平作等报道灵芝胞外多糖为2.91g/L，但是，他们测定方法同本实验所采用的浓硫酸-苯酚法存在较大差别。如按他们的测定方法(乙醇沉淀-干重法)，经验证获知，其测得的多糖含量相当于浓硫酸-苯酚法测定值的8-9倍。
对于胞内多糖含量(14.65毫克/100毫克干重)和产量(2.49克/升)以及灵芝多糖总量(胞外与胞内之和，3.36克/升)均为文献报道的最高值。
综上所述，本发明获得的灵芝酸含量和产量，虽低于静置培养的含量和产量，但为所有振荡培养的文献报道最高值；胞外多糖产量同文献报导水平接近，而胞内多糖的含量与产量以及灵芝多糖的总量均为文献报道最高值。通过本方法可以在摇瓶和生物反应器中通过补料达到高密度培养，以较高产率同时获得灵芝酸和灵芝多糖这两种灵芝主要药理成分。相对于现有采用类似液体发酵手段仅生产一种灵芝胞外多糖或胞内多糖以及前一专利在摇瓶中同时生产这两种药理成分而言，本方法由于不会增加复杂附加设备且培养技术简便，如在工业上实现灵芝酸和灵芝多糖这二种高值有效成分在生物反应器中的同时高产，必将大幅度提高生产过程的经济效益，也会带来可观的社会效益。这些产品均获得人们广泛认可，具有较高的药用价值，可广泛用于医药和食品保健等行业。由此可见，本发明所述的方法，与前一专利相比，确为一种更加接近工业化生产规模，更加具有工业化前景的生产方法。以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的说明。
实施例1采用的菌种：CGMCC No.5.616；摇瓶批培养法：发酵液体培养基中含有乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母膏5克/升，KH2PO4 1克/升，MgSO4 0.5克/升，VB1 0.05克/升。发酵温度为30℃，接种33毫克菌丝体于50毫升培养基/250毫升摇瓶中培养14天。结束发酵，收获菌丝体和发酵液，并进行以下分析测定：
在15000rpm下离心分离获得细胞干重15.8克/升；发酵液中加入4倍体积的95％的乙醇，混合过夜，在10000rpm下离心沉淀得胞外灵芝多糖。经1摩尔/升NaOH溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定多糖产量为0.6克/升；
菌丝体100毫克，加入1摩尔/升NaOH溶解，浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖为10.81毫克/100毫克干重，产量为1.6克/升。
菌丝体在45℃干燥，取100毫克，加入3毫升50％乙醇提取灵芝酸两次，在4000rpm下离心，上清液50℃干燥，用2毫升水溶解，并用2毫升氯仿萃取，取氯仿相，再用5％小苏打2毫升萃取，取水相，加入2摩尔/升盐酸至pH＝3，加入氯仿，取氯仿相，挥干后用乙醇溶解后紫外比色法测定灵芝酸，计算得含量为1.16毫克/100毫克干重，产量为170毫克/升。
实施例2
其他条件同实例1，当培养液的残余糖浓度大于10克/升时(发酵第8天，此时残余糖浓度为11.22克/升)，添加15克/升的乳糖，继续培养。培养16天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为19.99克/升，0.96克/升，1.97克/升(胞内含量9.85毫克/100毫克干重)，258.0毫克/升(胞内含量1.45毫克/100毫克干重)。
实施例3
其他条件同实例1，当培养液的残余糖浓度为10～5克/升时(发酵第十天，此时残余糖浓度为6.60克/升)，添加15克/升的乳糖，继续培养。培养18天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为20.07克/升，0.80克/升，2.01克/升(胞内含量11.30毫克/100毫克干重)，334.0毫克/升(胞内含量1.79毫克/100毫克干重)。
实施例4
其他条件同实例1，当培养液的残余糖浓度小于5克/升时(发酵第12天，此时残余糖浓度为2.90克/升)，添加15克/升的乳糖，继续培养。培养18天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为19.96克/升，0.76克/升，1.78克/升(胞内含量8.90亳克/100毫克干重)，269.9毫克/升(胞内含量1.38毫克/100毫克干重)。
实施例5
生物反应器批培养法：实施例1的放大是在3.0升(New Brunswick Scientific，USA)生物反应器中进行的。起始的通气速率为0.25升/升/分钟，起始的搅拌速率为120转/分钟。接种1320毫克种子于2.0升培养基/3.0升生物反应器。其他的发酵条件同实例1。随着细胞密度的增加，为了维持溶氧浓度在20％以上，逐渐增加通气速率；为了防止细胞沉降，逐渐增加搅拌速率。最终的通气与搅拌速率分别为0.5升/升/分钟和180转/分钟。培养10天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为16.53克/升，0.61克/升，1.68克/升(胞内含量13.97毫克/100毫克干重)，330.2毫克/升(胞内含量2.05毫克/100毫克干重)。
实施例6
生物反应器补料培养法：实施例3的放大是在3.0升(New Brunswick Scientific，USA)生物反应器中进行的。发酵条件同实例5，当培养液的残余糖浓度为10～5克/升时(发酵第十天)，添加15克/升的乳糖，继续培养。培养12天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为21.89克/升，0.87克/升，2.49克/升(胞内含量14.65毫克/100毫克干重)，367.1毫克/升(胞内含量2.05毫克/100毫克干重)。
实施例7～12
采用菌种分别为CGMCC No.5.75、CGMCG No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一种；培养方法与实施例3相同，分析测试结果：细胞干重分别为：17.85克/升、16.53克/升、5.69克/升、20.07克/升、6.23克/升和5.20克/升；胞外多糖产量分别为：0.84克/升、0.56克/升、0.35克/升、0.80克/升、0.26克/升和0.33克/升；胞内多糖产量分别为：1.20克/升、1.56克/升、0.52克/升、2.01克/升、0.52克/升和0.49克/升；灵芝酸产量分别为：235.1毫克/升、221.0毫克/升、69.3毫克/升、334.0毫克/升、102.1毫克/升和48.6毫克/升。
实施例13～18
采用菌种分别为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一种；发酵培养基为葡萄糖，培养方法与实施例3相同，分析测试结果：细胞干重分别为：18.96克/升、18.92克/升、8.69克/升、19.56克/升、5.23克/升和6.20克/升；胞外多糖产量分别为：0.98克/升、1.24克/升、0.35克/升、0.90克/升、0.46克/升和0.43克/升；胞内多糖产量分别为：0.90克/升、1.26克/升、0.56克/升、1.28克/升、0.56克/升和0.61克/升；灵芝酸产量分别为：126.3毫克/升、121.0毫克/升、189.3毫克/升、234.0毫克/升、152.1毫克/升和108.6毫克/升。
实施例19～24
采用菌种分别为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一种；发酵培养基为麦芽糖，培养方法与实施例3相同，分析测试结果：细胞干重分别为：17.96克/升、16.92克/升、5.69克/升、17.56克/升、4.23克/升和11.20克/升；胞外多糖产量分别为：0.88克/升、0.94克/升、0.75克/升、0.80克/升、0.56克/升和0.68克/升；胞内多糖产量分别为：0.80克/升、0.96克/升、0.66克/升、1.18克/升、0.68克/升和0.65克/升；灵芝酸产量分别为：116.3毫克/升、131.0毫克/升、109.3毫克/升、265.0毫克/升、162.1毫克/升和168.6毫克/升。
Claims (5)
1.一种中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法，采用的微生物为灵芝属菌种，以葡萄糖或蔗糖为碳源、蛋白胨和酵母膏为氮源作为种子培养基并加入适量的无机盐和维生素，其特征在于：
接种种子于有培养基的摇瓶中，采用常规的方法进行培养，当残余糖浓度为30～0.1克/升时，补加5～60克/升的乳糖或葡萄糖或麦芽糖，继续培养，在第10～30天结束培养，收获菌丝体和发酵液，然后提取灵芝多糖和灵芝酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养是在20～35℃，80～180转/分钟回旋条件下进行的。
3.一种中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法，采用的微生物为灵芝属菌种，以葡萄糖或蔗糖为碳源、蛋白胨和酵母膏为氮源作为种子培养基并加入适量的无机盐和维生素，其特征在于：
接种种子于有培养基的生物反应器中，当残余糖浓度为30～0.1克/升时，补加5～60克/升的乳糖或葡萄糖或麦芽糖，在第10～30天结束培养，收获菌丝体和发酵液，然后提取灵芝多糖和灵芝酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，培养条件为：20～35℃，通气速率为0.02～3.50升/升/分钟，搅拌速率10～1000转/分钟，培养液中溶解氧浓度为5％～80％。
5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，采用的菌种为保藏号为CGMCCNo.5.75的菌株、保藏号为CGMCC No.5.110的菌株、保藏号为CGMCC No.5.533的菌株、保藏号为CGMCC No.5.616的菌株、保藏号为CGMCC No.5.644的菌株或保藏号为CGMCC No.5.653的菌株中的一种。
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