CN1307314C - 酶解制备灵芝多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶解制备灵芝多糖的方法，它包括如下步骤：采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝真菌发酵液，调节含有菌丝体的发酵液pH值及温度，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，再向发酵液中加入纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶及中性蛋白酶，进行酶解，再经灭酶、过滤、浓缩、醇沉及分离等步骤得到灵芝多糖，本发明巧妙地利用菌丝体自身酶系和外加的混合酶系在适宜的条件下对灵芝真菌发酵液进行酶解，酶解后灵芝粗多糖产品中灵芝多糖含量为35-60%，灵芝多糖中分子量在6000-50000之间的活性灵芝多糖占70-90%。
Description
技术领域
本发明属于真菌发酵工业领域，特别是涉及利用酶法处理灵芝深层发酵液，以提高活性灵芝多糖含量的生产方法。
背景技术
灵芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr.)karst]，又称灵芝草，属担子菌亚门、多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于“上上药”，其排位在人参之前。《神农本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。
灵芝多糖能促进蛋白质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用，它是灵芝扶正固本的主要有效成分之一。灵芝多糖主要存在于灵芝真菌子实体、菌核、菌丝体或发酵液中。分子量在6000-50000之间的灵芝多糖，其生物活性较高，灵芝多糖分子为分支结构，糖苷键以β-1，4键为主，β-1，6键为辅。灵芝菌丝体中大分子的灵芝多糖(聚合度多达数百万)与蛋白质、脂质和果胶质相互交联，结构致密。因此，如何切除与灵芝多糖交联的一部分或全部蛋白质以及果胶成分，并将灵芝多糖大分子有效地降解，从而提高分子量在6000-50000之间的活性灵芝多糖的含量，是亟待解决的一个问题。
目前，国内外相关研究主要集中在灵芝多糖的纯化提取和功能性研究方面。而以酶法特别是通过菌丝体自身酶系和外加酶系处理发酵液(含菌丝体)，用以提高活性灵芝多糖含量的研究尚无报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种酶解制备灵芝多糖的方法。通过对灵芝真菌发酵液(含菌丝体)的酶法处理，有效地提高活性灵芝多糖的含量。
本发明酶解制备灵芝多糖的方法概述如下：
(1) 发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝真菌液体深层发酵液；
(2) 菌丝体自身酶系酶解：调节步骤(1)得到的含有菌丝体的发酵液，使其pH为5～7，在30～70℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解时间30～100分钟，搅拌速度10～100转/分；
(3) 外加酶酶解：将步骤(2)中得到的发酵液分别调整温度和pH，使温度为30～65℃，pH为5～7，发酵液中加入混合酶，混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，混合酶按重量百分比组成为：纤维素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果胶酶0～70％、中性蛋白酶0～70％，酶解时间0.3～8小时，酶解过程中开启搅拌，搅拌速度10～100转/分；
(4) 灭酶：酶控制反应结束后，将发酵液升温到90～100℃，保持10～30分钟，进行灭酶；
(5) 过滤：酶处理工艺结束之后，对发酵液进行固液分离，可选用的设备有板框式压滤机或离心机等；
(6) 浓缩：将滤液浓缩至原体积的1/5～1/10，浓缩所用方法可以是单效、多效真空浓缩和冷冻浓缩；
(7) 醇沉：向浓缩滤液中加入70～100％的乙醇进行醇沉，其体积比为1∶3～4；
(8) 离心分离：沉淀物为灵芝多糖。
在菌丝体自身酶系酶解步骤中以pH 5.5～6为宜，酶解温度最好选45～50℃，酶解时间最好选60～70分钟，搅拌速度最好选20～60转/分。
在外加酶酶解步骤中加入混合酶的温度以50～55℃为宜，pH最好选5.5～6，酶解时间最好选2～2.5小时，搅拌速度最好选20～50转/分。
本发明中灵芝真菌液体深层发酵液的培养见徐锦堂编《中国药用真菌学》。
本发明的显著优点在于：
本发明在培养得到的灵芝真菌发酵液的基础上，巧妙地利用菌丝体自身酶系和外加的混合酶在适宜的条件下对真菌发酵液进行酶解，酶解后粗产品灵芝多糖中灵芝多糖含量为35-60％。灵芝多糖中分子量在6000-50000之间的活性灵芝多糖占70-90％。粗灵芝多糖产量可以达到10-17.5公斤/吨发酵液。
本发明适用于各种规模深层发酵法培养灵芝发酵液并采用酶法制备灵芝多糖的生产。
附图说明：
图1为葡聚糖凝胶层析测定方法中的蓝色葡聚糖洗脱曲线；
图2为葡聚糖凝胶层析测定方法中的洗脱特征标准曲线。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
10吨发酵液灵芝多糖酶处理方法
(1)采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝液体深层发酵液：将灵芝斜面菌种接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床150转/分，28℃培养50小时。然后将一级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，按照与一级摇瓶相同的条件进行培养。然后再以10％的接种量将二级种子转接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件：旋转式摇床180转/分，28℃培养50小时。然后再以10％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养48小时。同样将一级种子罐的菌液以10％的接种量转接入装有1吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，二级种子罐与一级种子罐的培养条件相同。最后以10％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。发酵罐培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05 Mpa，培养120小时。
(2)菌丝体自身酶系酶解：发酵液达到放罐标准后用蒸气将发酵罐内的发酵液升温到50℃，用10％NaOH调节PH到6.0，借助灵芝菌丝体自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解时间60分钟，搅拌速度30转/分；
(3)外加酶酶解：在55℃，pH为6的条件下，向经步骤(2)得到的10吨发酵液中加入纤维素酶2.5公斤，β-葡聚糖酶1公斤，果胶酶1公斤，中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间3小时，酶解过程中开启搅拌，搅拌速度30转/分；
(4)灭酶：外加酶酶解结束后，将发酵液升温到95℃，30分钟，进行灭酶；
(5)过滤：将发酵液进行板框压滤，收集滤液；
(6)浓缩：减压浓缩滤液体积到1吨；
(7)醇沉：加入3.8吨95％的乙醇，醇析12小时；
(8)离心分离：采用卧式离心机3500rpm离心60分钟，用蒸馏水溶解沉淀，后经真空干燥工艺制备，获得粗灵芝多糖干粉110公斤。其中灵芝多糖含量为45％，活性灵芝多糖(分子量在6000-50000)占灵芝多糖的80％，比例见表1。
本发明中灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌号：CICC 14005。
本例中斜面培养基组成：马铃薯(煮汁)20％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.15％，琼脂2.0％。
本例中各级种子和发酵生产所用培养基组成为：蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
本例中用苯酚硫酸法测定灵芝多糖含量，测定方法如下：
精确量取样品1克，置100毫升容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，然后再取1毫升加入100毫升容量瓶用蒸馏水定容至刻度。吸取1毫升稀释液置10毫升量瓶中并补加水至2毫升，精密加入5％苯酚试液1毫升混匀，迅速加入硫酸5.0毫升，振摇5分钟，置水浴100℃中放置15分钟后，于冷水中冷却30分钟，加水至刻度，摇匀，在490纳米波长处测定吸收度，同时做空白对照。
按照公式计算多糖含量。
P＝(0.289x-0.0131)*d*f/(1000*W)*100。
x是吸光值d供试样品溶液的稀释因子，f为换算系数0.9，W为样品重量，P为样品中多糖含量。
本例中用葡聚糖凝胶层析法测定灵芝多糖分子量，测定方法如下：
凝胶层析柱经平衡后，待洗脱液流至床面以下1-2毫米时，关闭出口，用加样器吸取一定量(约0.3毫升)葡聚糖标准溶液，自加样口加至床表面，打开出口，安装接受管，待标液透入床内，小心加入适量洗脱液，接上恒压洗脱瓶，开始层析，并分部收集，每管收集3毫升，流速0.5毫升/分钟。从每管中吸取0.5毫升，以苯酚硫酸法测定。以吸光值对收集管数作图得葡聚糖标准品洗脱曲线(见图1)，从而得到洗脱体积Ve。同样以蓝色葡聚糖测外水体积Vo，最后以Ve/Vo对分子量的对数绘制特征标准曲线(见图2)。典型的洗脱特征标准曲线为Y＝-0.95X+5.84。
称取多糖提取物样品1g，以热洗脱液溶解，保温0.5小时，冷却定容到50毫升(一定体积)。取上清液0.3-0.5毫升上层析柱进行层析分离，求得洗脱体积Ve，然后以Ve/Vo值查洗脱特征标准曲线，求出分子量。对不同分子量范围的多糖采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。
表1 灵芝多糖中活性灵芝多糖分子量分布及比例
| 分子量 | ≥50000 | 50000-30000 | 30000-10000 | 10000-6000 | ≤6000 |
| 所占比例％ | 9 | 10 | 44 | 26 | 11 |
实施例2(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为5.5，在45℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解70分钟，搅拌速度40转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为5.5的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.15公斤、β-葡聚糖酶1.2公斤、果胶酶0.9公斤、中性蛋白酶0.75公斤，酶解时间2小时，搅拌速度40转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到90℃，10分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至2吨；
在醇沉过程中，加入6吨70％的乙醇进行醇沉。
实施例3(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为5，在30℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解30分钟，搅拌速度60转/分；
在外加酶酶解过程中，在30℃，pH为6.0的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.2公斤、β-葡聚糖酶1.6公斤、果胶酶1.2公斤、中性蛋白酶1公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到100℃，30分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1吨；
在醇沉过程中，加入4吨100％的乙醇进行醇沉。
实施例4(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在70℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解100分钟，搅拌速度100转/分；
在外加酶酶解过程中，在65℃，pH为5的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.0公斤、β-葡聚糖酶1.0公斤、果胶酶1.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间0.3小时，搅拌速度100转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例5(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度10转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为7的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.25公斤、β-葡聚糖酶2.0公斤、果胶酶1.5公斤、中性蛋白酶1.25公斤，酶解时间8小时，搅拌速度10转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.2吨；
在醇沉过程中，加入4吨78％的乙醇进行醇沉。
实施例6(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.85公斤、β-葡聚糖酶0.15公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例7(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶3.8公斤、β-葡聚糖酶0.2公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例8(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶4.75公斤、β-葡聚糖酶0.25公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例9(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.4公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例10(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶3.2公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例11(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶4公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例12(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶2.4公斤、果胶酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例13(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶3.2公斤、果胶酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例14(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶4公斤、果胶酶0.5公斤、中性蛋白酶0.32公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例15(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果胶酶2.1公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例16(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在60℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解55分钟，搅拌速度10转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果胶酶2.8公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例17(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果胶酶3.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例18(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果胶酶0.3公斤、中性蛋白酶2.1公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例19(发酵液10吨)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解60分钟，搅拌速度100转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果胶酶0.4公斤、中性蛋白酶2.8公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例20(10吨发酵液)
一种酶解制备灵芝多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果胶酶0.5公斤、中性蛋白酶2.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
Claims (3)
1.一种酶解制备灵芝多糖的方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)发酵液的获得：采用灵芝斜面菌种逐级扩培获得灵芝液体深层发酵液，所述灵芝菌种的菌号：CICC 14005；
(2)菌丝体自身酶系酶解：调节步骤(1)得到的含有菌丝体的发酵液，使其pH为5～7，在30～70℃，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，酶解时间30～100分钟，搅拌速度10～100转/分；
(3)外加酶酶解：在30～65℃，pH为5～7的条件下，向经步骤(2)得到的发酵液中加入混合酶，所述混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，所述混合酶按重量百分比包括：纤维素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果胶酶0～70％和中性蛋白酶0～70％，酶解时间0.3～8小时，酶解过程中开启搅拌，搅拌速度10～100转/分；
(4)灭酶：酶控反应结束后，将发酵液升温到90～100℃，10～30分钟，进行灭酶；
(5)过滤；
(6)浓缩：将滤液浓缩至原体积的1/5～1/10；
(7)醇沉：向浓缩滤液中加入浓缩液重量3～4倍的70～100％的乙醇进行醇沉；
(8)离心分离：沉淀物为灵芝多糖。
2、根据权利要求1所述的一种酶解制备灵芝多糖的方法，其特征在于所述菌丝体自身酶系酶解步骤中pH为5.5～6，所述酶解温度为45～50℃，所述酶解时间为60～70分钟，所述搅拌速度20～60转/分。
3、根据权利要求1所述的一种酶解制备灵芝多糖的方法，其特征在于所述外加酶酶解步骤中加入混合酶的温度为50～55℃，pH为5.5～6，所述酶解时间2～2.5小时，所述搅拌速度20～50转/分。
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