CN1322141C - 酶解制备灰树花多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶解制备灰树花多糖的方法，本发明属于食用菌多糖制备领域，包括如下步骤：采用斜面菌种逐级扩培获得灰树花真菌发酵液，调节含有菌丝体的发酵液pH值及温度，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，再向发酵液中加入纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶及中性蛋白酶，进行酶解，再经灭酶、过滤、浓缩、醇沉及分离等步骤得到灰树花多糖，本发明巧妙地利用菌丝体自身酶系和外加的混合酶系在适宜的条件下对灰树花真菌发酵液进行酶解，酶解后灰树花粗多糖产品中灰树花多糖含量为35-60%，灰树花多糖中分子量在6000-50000之间的活性灰树花多糖占70-90%。
Description
技术领域
本发明属于食用菌多糖制备领域，特别是涉及利用酶法处理灰树花深层发酵液，以提高活性灰树花多糖含量的生产方法。
技术背景
灰树花(Polyporus frondosus)隶属于真菌门、担子菌亚门、非褶菌目、多孔菌科、多孔菌属。灰树花是著名的食用、药用真菌，营养丰富，鲜美可口，是“可食、可补、可药，周身是宝”的大型真菌。灰树花性平、味甘，可以用来治疗小便不利、水肿、脚气、肝硬化腹水、糖尿病、高血压和肥胖症等疾病。
灰树花中含有的功能成分灰树花多糖具有明显的抗肿瘤效果。近年来，人们对其理化性质及药理作用进行了大量研究。灰树花多糖具有明显的抗肿瘤、抗艾滋病病毒、改善免疫系统功能，调节血糖、血脂及胆固醇水平，降血压等作用，对防止癌细胞的生成和转移，对高血压、肥胖症、糖尿病、贫血症等有一定疗效。目前已上市的灰树花多糖产品有日本的MAIEXT营养滋补品、美国的Grifron系列产品，我国的保力生胶囊等。灰树花多糖具有安全有效的抗肿瘤作用的特点，其在约物、食品中具有广阔的应用前景。
灰树花多糖主要存在于灰树花真菌子实体、菌核、菌丝体或发酵液中。分子量在6000-50000之间的灰树花多糖，其生物活性较高，灰树花多糖分子为分支结构，糖苷键以β-1，4键为主，β-1，6键为辅。灰树花菌丝体中大分子的灰树花多糖(聚合度多达数百万)与蛋白质、脂质和果胶质相互交联，结构致密。因此，如何切除与灰树花多糖交联的一部分或全部蛋白质以及果胶成分，并将灰树花多糖大分子有效地降解，从而提高分子量在6000-50000之间的活性灰树花多糖的含量，是亟待解决的一个问题。
目前，国内外相关研究主要集中在灰树花多糖的纯化提取和功能性研究方面。而以酶法特别是通过菌丝体自身酶系和外加酶系处理发酵液(含菌丝体)，用以提高活性灰树花多糖含量的技术尚无报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种酶解制备灰树花多糖的方法。通过对灰树花真菌发酵液(含菌丝体)的酶法处理，有效地提高活性灰树花多糖的含量。
本发明酶解制备灰树花多糖的方法概述如下：
(1)发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得灰树花真菌液体深层发酵液；
(2)菌丝体自身酶系酶解：调节步骤(1)得到的含有菌丝体的发酵液，使其pH为5～7，在30～70℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解时间30～100分钟，搅拌速度10～100转/分；
(3)外加酶酶解：将步骤(2)中得到的发酵液分别调整温度和pH，使温度为30～65℃，pH为5～7，发酵液中加入混合酶，混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，混合酶按重量百分比组成为：纤维素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果胶酶0～70％、中性蛋自酶0～70％，酶解时间0.3～8小时，酶解过程中开启搅拌，搅拌速度10～100转/分；
(4)灭酶：酶控制反应结束后，将发酵液升温到90～100℃，保持10～30分钟，进行灭酶；
(5)过滤：酶处理工艺结束之后，对发酵液进行固液分离，可选用的设备有板框式压滤机或离心机等；
(6)浓缩：将滤液浓缩至原体积的1/5～1/10，浓缩所用方法可以是单效、多效真空浓缩和冷冻浓缩；
(7)醇沉：向浓缩滤液中加入70～100％的乙醇进行醇沉，其体积比为1∶3～4；
(8)离心分离：沉淀物为灰树花多糖。
在菌丝体自身酶系酶解步骤中以pH5.5～6为宜，酶解温度最好选45～50℃，酶解时间最好选60～70分钟，搅拌速度最好选20～60转/分。
在外加酶酶解步骤中加入混合酶的温度以50～55℃为宜，pH最好选5.5～6，酶解时间最好选2～2.5小时，搅拌速度最好选20～50转/分。
本发明中灰树花真菌液体深层发酵液的培养见徐锦堂编《中国药用真菌学》。
本发明的显著优点在于：
本发明在培养得到的灰树花真菌发酵液的基础上，巧妙地利用菌丝体自身酶系和外加的混合酶在适宜的条件下对真菌发酵液进行酶解，酶解后粗产品灰树花多糖中灰树花多糖含量为35-60％。灰树花多糖中分子量在6000-50000之间的活性灰树花多糖占70-90％。粗灰树花多糖产量可以达到10-17.5公斤/吨发酵液。
附图说明：
图1为葡聚糖凝胶层析测定方法中的蓝色葡聚糖洗脱曲线；
图2为葡聚糖凝胶层析测定方法中的洗脱特征标准曲线。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
10吨发酵液灰树花多糖酶处理方法
(1)采用斜面菌种逐级扩培获得灰树花液体深层发酵液：将灰树花斜面菌种接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床150转/分，28℃培养72小时。然后将一级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，按照与一级摇瓶相同的条件进行培养。然后再以10％的接种量将二级种子转接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件：旋转式摇床180转/分，28℃培养60小时。然后再以10％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养48小时。同样将一级种子罐的菌液以10％的接种量转接入装有1吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，二级种子罐与一级种子罐的培养条件相同。最后以10％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。发酵罐培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养120小时。
(2)菌丝体自身酶系酶解：发酵液达到放罐标准后用蒸气将发酵罐内的发酵液升温到50℃，用10％NaOH调节PH到6.0，借助灰树花菌丝体自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解时间60分钟，搅拌速度30转/分；
(3)外加酶酶解：在55℃，pH为6的条件下，向经步骤(2)得到的10吨发酵液中加入纤维素酶2.5公斤，β-葡聚糖酶1公斤，果胶酶1公斤，中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间3小时，酶解过程中开启搅拌，搅拌速度30转/分；
(4)灭酶：外加酶酶解结束后，将发酵液升温到95℃，30分钟，进行灭酶；
(5)过滤：将发酵液进行板框压滤，收集滤液；
(6)浓缩：减压浓缩滤液体积到1吨；
(7)醇沉：加入3.8吨95％的乙醇，醇析12小时；
(8)离心分离：采用卧式离心机3500rpm离心60分钟，用蒸馏水溶解沉淀，后经真空干燥工艺制备，获得粗灰树花多糖干粉110公斤。其中灰树花多糖含量为45％，活性灰树花多糖(分子量在6000-50000)占灰树花多糖的80％，比例见表1。
本发明中灰树花菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌号：CICC 14098。
本例中斜面培养基组成：马铃薯(煮汁)20％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.15％，琼脂2.0％。
本例中各级种子和发酵生产所用培养基组成为：玉米淀粉5％，酵母膏0.5％，蔗糖1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素Bl 2PPm，PH6.0。
本例中用苯酚硫酸法测定灰树花多糖含量，测定方法如下：
精确量取样品1克，置100毫升容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，然后再取1毫升加入100毫升容量瓶用蒸馏水定容至刻度。吸取1毫升稀释液置10毫升量瓶中并补加水至2毫升，精密加入5％苯酚试液1毫升混匀，迅速加入硫酸5.0毫升，振摇5分钟，置水浴100℃中放置15分钟后，于冷水中冷却30分钟，加水至刻度，摇匀，在490纳米波长处测定吸收度，同时做空白对照。
按照公式计算多糖含量。
P＝(0.289x-0.0131)*d*f/(1000*W)*100。
x是吸光值d供试样品溶液的稀释因子，f为换算系数0.9，W为样品重量，P为样品中多糖含量。
本例中用葡聚糖凝胶层析法测定灰树花多糖分子量，测定方法如下：
凝胶层析柱经平衡后，待洗脱液流至床面以下1-2毫米时，关闭出口，用加样器吸取一定量(约0.3毫升)葡聚糖标准溶液，自加样口加至床表面，打开出口，安装接受管，待标液透入床内，小心加入适量洗脱液，接上恒压洗脱瓶，开始层析，并分部收集，每管收集3毫升，流速0.5毫升/分钟。从每管中吸取0.5毫升，以苯酚硫酸法测定。以吸光值对收集管数作图得葡聚糖标准品洗脱曲线(见图1)，从而得到洗脱体积Ve。同样以蓝色葡聚糖测外水体积Vo，最后以Ve/Vo对分子量的对数绘制特征标准曲线(见图2)。典型的洗脱特征标准曲线为Y＝-0.95X+5.84。
称取多糖提取物样品1g，以热洗脱液溶解，保温0.5小时，冷却定容到50毫升(一定体积)。取上清液0.3-0.5毫升上层析柱进行层析分离，求得洗脱体积Ve，然后以Ve/Vo值查洗脱特征标准曲线，求出分子量。对不同分子量范围的多糖采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。
表1灰树花多糖中活性灰树花多糖分子量分布及比例
| 分子量 | ≥50000 | 50000-30000 | 30000-10000 | 10000-6000 | ≤6000 |
| 所占比例％ | 9 | 10 | 44 | 26 | 11 |
实施例2(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为5.5，在45℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解70分钟，搅拌速度40转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为5.5的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.15公斤、β-葡聚糖酶1.2公斤、果胶酶0.9公斤、中性蛋白酶0.75公斤，酶解时间2小时，搅拌速度40转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到90℃，10分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至2吨；
在醇沉过程中，加入6吨70％的乙醇进行醇沉。
实施例3(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为5，在30℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解30分钟，搅拌速度60转/分；
在外加酶酶解过程中，在30℃，pH为6.0的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.2公斤、β-葡聚糖酶1.6公斤、果胶酶1.2公斤、中性蛋白酶1公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到100℃，30分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1吨；
在醇沉过程中，加入4吨100％的乙醇进行醇沉。
实施例4(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在70℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解100分钟，搅拌速度100转/分；
在外加酶酶解过程中，在65℃，pH为5的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.0公斤、β-葡聚糖酶1.0公斤、果胶酶1.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间0.3小时，搅拌速度100转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例5(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度10转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为7的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.25公斤、β-葡聚糖酶2.0公斤、果胶酶1.5公斤、中性蛋白酶1.25公斤，酶解时间8小时，搅拌速度10转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.2吨；
在醇沉过程中，加入4吨78％的乙醇进行醇沉。
实施例6(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.85公斤、β-葡聚糖酶0.15公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例7(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶3.8公斤、β-葡聚糖酶0.2公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例8(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶4.75公斤、β-葡聚糖酶0.25公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例9(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解；酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶2.4公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例10(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶3.2公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例11(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶4公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例12(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶2.4公斤、果胶酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例13(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶3.2公斤、果胶酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例14(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶4公斤、果胶酶0.5公斤、中性蛋白酶0.32公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例15(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存住的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果胶酶2.1公斤、中性蛋白酶0.3公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例16(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在60℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解55分钟，搅拌速度10转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果胶酶2.8公斤、中性蛋白酶0.4公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例17(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果胶酶3.5公斤、中性蛋白酶0.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例18(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.3公斤、β-葡聚糖酶0.3公斤、果胶酶0.3公斤、中性蛋白酶2.1公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例19(发酵液10吨)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为7，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解60分钟，搅拌速度100转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.4公斤、β-葡聚糖酶0.4公斤、果胶酶0.4公斤、中性蛋白酶2.8公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
实施例20(10吨发酵液)
一种酶解制备灰树花多糖的方法，它的步骤同实施例1：
在菌丝体自身酶系酶解过程中，调节发酵液，使其pH为6，在50℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解65分钟，搅拌速度50转/分；
在外加酶酶解过程中，在50℃，pH为6的条件下，向发酵液中加入混合酶：纤维素酶0.5公斤、β-葡聚糖酶0.5公斤、果胶酶0.5公斤、中性蛋白酶2.5公斤，酶解时间2.5小时，搅拌速度50转/分；
在灭酶过程中，将发酵液升温到95℃，20分钟，进行灭酶；
在浓缩过程中，将滤液浓缩至1.5吨；
在醇沉过程中，加入4.5吨75％的乙醇进行醇沉。
Claims (4)
1、一种酶解制备灰树花(Polyporus frondosus)多糖的方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得灰树花液体深层发酵液：
(2)菌丝体自身酶系酶解：调节步骤(1)得到的含有菌丝体的发酵液，使其pH为5～7，在30～70℃，借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，酶解时间30～100分钟；
(3)外加酶酶解：在30～65℃，pH为5～7的条件下，向经步骤(2)得到的发酵液中加入混合酶，所述混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，所述混合酶按重量百分比包括：纤维素酶5～95％、β-葡聚糖酶5～80％、果胶酶0～70％和中性蛋白酶0～70％，酶解时间0.3～8小时；
(4)灭酶：酶控反应结束后，将发酵液升温到90～100℃，10～30分钟，进行灭酶；
(5)过滤；
(6)浓缩：将滤液浓缩至原体积的1/5～1/10；
(7)醇沉：向浓缩滤液中加入浓度为70～100％的乙醇进行醇沉，浓缩滤液与乙醇体积比为1∶3～4；
(8)离心分离：沉淀物为灰树花多糖。
2、根据权利要求1所述的一种酶解制备灰树花多糖的方法，其特征在于所述菌丝体自身酶系酶解步骤中pH为5.5～6，酶解温度为45～50℃，酶解时间为60～70分钟，搅拌速度20～60转/分。
3、根据权利要求1所述的一种酶解制备灰树花多糖的方法，其特征在于所述外加酶酶解步骤中加入混合酶的温度为50～55℃，pH为5.5～6，所述酶解时间2～2.5小时，搅拌速度20～50转/分。
4、根据权利要求1所述的一种酶解制备灰树花多糖的方法，其特征在于所述外加酶酶解步骤中加入混合酶的温度为50℃，pH为6，所述酶解时间2.5小时，所述搅拌速度50转/分。
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