CN109429892A - 一种桑黄富硒菌粉 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桑黄富硒菌粉，具体涉及一种经过菌种的平面培养、菌种的液体扩增、固体发酵而制成的桑黄富硒菌粉。本发明制备工艺简便、可行，适合大生产。

Description

一种桑黄富硒菌粉

技术领域

本发明涉及一种桑黄富硒菌粉，具体涉及一种桑黄富硒菌粉的制备方法及用途，属于发酵食品领域。

背景技术

桑黄是一种具有很高药用价值的大型真菌，因其确切的疗效和较高的药用价值而被誉为“森林黄金”。桑黄因寄主不同，可分为桑树桑黄、杨树桑黄、松树桑黄等，但经学者鉴定桑树桑黄才是正品，其子实体颜色鲜黄，质较重。20世纪90年代，日本和韩国学者早已发现桑黄的神奇疗效，对桑黄进行了开发利用，小规模的人工栽培已经相对成熟。在当时关于桑黄的药品和保健品已经在市场流通，售价昂贵，而我国对于桑黄的研究开发则相对较慢，并且国内桑黄品种杂乱，没有有效的鉴定，种源得不到保证。由于桑黄生存环境独特，且生长缓慢，再加上价格昂贵，野生桑黄被大规模的无序采摘，因此我们必须从现代的技术出发，从液体培养、菌丝体培养等技术代替子实体的栽培技术，从发展人工桑黄出发，改革技术，增大产出来满足社会的需求。

目前，国内外研究对桑黄固体培养基多为碎木屑、麸皮等，粗粮也仅仅涉及到玉米、大麦、小麦等，种类单一，且报道较少，研究不彻底。本文针对桑黄，在固体培养基中加入了桑树枝提取液以及多种粗粮，使营养更多元化，且桑枝液中所含的生长因子类物质更贴合桑黄的生长特性，合理而科学。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑黄富硒菌粉的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种桑黄富硒菌粉，是在固体培养基中加入了桑树枝提取液以及多种粗粮经发酵而成，具体的说是经过菌种的平面培养、菌种的液体扩增、固体发酵而制成。

该桑黄富硒菌粉采用以下步骤：

(1)菌种的平面培养：碳源为葡萄糖，氮源为麸皮，C/N比值为10～30：1，避光培养，富硒物为亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量为0.01～0.05％；

(2)菌种的液体扩增：天数为7d，温度为28℃，接种量为2～10％，装液量为3000mL，桑枝添加量为1～10g/20mL，亚硒酸钠添加量为0.00002～0.0002％；

(3)固体发酵：30～80％玉米、20～60％荞麦及10～40％小米混合组成培养基，装袋量为250g，天数为15.50d，温度为28℃，亚硒酸钠添加量为20～100mg/kg。

该桑黄富硒菌粉采用以下步骤：

(1)菌种的平面培养：碳源为葡萄糖，氮源为麸皮，C/N比值为20：1，避光培养，富硒物为亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量为0.03％；

(2)菌种的液体扩增：天数为7d，温度为28℃，接种量为5％，装液量为3000mL，桑枝添加量为2g/20mL，亚硒酸钠添加量为0.0001％；

(3)固体发酵：培养基为：50％玉米、30％荞麦及20％小米，装袋量为250g，天数为15.50d，温度为28℃，亚硒酸钠添加量为60mg/kg。

经检测，本发明桑黄富硒菌粉比粮食发酵前淀粉由22.15％减少为9.22％；蛋白质由 10.01g/100g减少为9.43g/100g；多肽由1.54％增加为2.08％；发酵后多肽分子量减小。

本发明桑黄富硒菌粉全部通过四号筛，水分不超过9.0％，休止角在30°～35°之间，总灰分和酸不溶性灰分均不超过5％，水溶性浸出物含量不少于15％，醇溶性浸出物含量不少于10％，多糖含量不少于90mg/g，黄酮含量不少于0.5mg/g，三萜含量不少于8.5mg/g，有机硒含量不少于35μg/g，硒转化率不低于95％，砷的含量不超过1.0mg/kg，镉、汞的含量不超过0.1mg/kg，铅的含量不超过2.0mg/kg。

本发明桑黄富硒菌粉的制备方法研究如下：

1.1培养基的制备

将马铃薯洗净去皮,切成1cm³的小块，称取200g，置于不锈钢锅中，加水1000mL，煮沸后，保持微沸20分钟，以能被玻璃棒戳破为度，用八层纱布过滤，滤液置于烧杯中，称取葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，溶解于滤液中，置不锈钢锅中继续煎煮，加入琼脂20g并用玻璃棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，再加入2片VB₁，稍冷却后加水补足至1000mL，搅拌均匀后，倒入锥形瓶中，盖好棉塞，置立式压力蒸汽灭菌器中，121℃下灭菌30min，稍冷却，放置于接种台的紫外灯下，灭菌备用。

1.2平面培养基的制备

取直径100mm的玻璃培养皿，洗净烘干后，盖好上盖，放入立式压力蒸汽灭菌器中，121℃下灭菌30min，缓慢放气，取出培养皿放置于接种台的紫外灯下，冷却，待1.1项下培养基冷却至45℃左右时，点燃酒精灯，摇匀锥形瓶，于酒精灯下倒入培养皿中约20mL 培养基，抖平培养基，置于桌面冷却凝固后，备用。

1.3菌种的接种

取冷藏的桑黄菌种置于接种台的紫外灯下，放置2h，进行活化，待接近室温时，将接种铲和接种钯于121℃下灭菌30min，关闭紫外灯，点燃3个酒精灯，并打开抽风机，用酒精擦拭手部和接种工具进行消毒，消毒后将接种铲和接种钯在酒精灯上灼烧进行灭菌，左手持活化后的菌种，右手先持接种钯横切菌丝，再用接种铲竖切菌丝，切成绿豆粒大小的菌块，切好后取1块于酒精灯上方放置于空白培养皿中，盖上上盖，置于接种台面即接种完毕。

1.4碳源的筛选

固定温度28℃，避光培养10d，考察不同碳源，葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉对桑黄菌丝生长的影响。以菌丝生长情况和菌丝生长速度为依据筛选最佳碳源，下同。结果见表1。

表1不同碳源下桑黄菌丝生长情况

注：“++++”表示菌丝浓密茂盛，原基突起高，黄色；“+++”表示菌丝较旺盛，原基突起小，菌丝淡黄；“++”表示菌丝稍稀疏，原基无突起，白色；“+”表示菌丝稀疏，原基无突起，白色。下同。

结果表明，单糖、二糖、多糖均能促进桑黄菌丝生长，对菌丝生长速度的影响从高到低依为葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、可溶性淀粉、乳糖。可以看出，六碳糖好于五碳糖，单糖好于二糖和多糖。葡萄糖作为碳源，菌丝生长最为旺盛，菌落圆整，色黄。因此，确定最佳碳源为葡萄糖。

1.5氮源的筛选

固定温度28℃，避光培养10d，考察不同氮源，蛋白胨、硫酸铵、尿素、麸皮、酵母粉对桑黄菌丝生长的影响。结果见表2。

表2不同氮源下桑黄菌丝生长情况

结果表明，5种氮源对菌丝生长速度的影响从高到低依为麸皮、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵。可以看出，有机氮源优于无机氮源，而尿素对桑黄菌丝生长有很强的毒性作用，菌丝完全不生长。因此，确定最佳氮源为麸皮。

1.6碳氮比的筛选

固定温度28℃，避光培养10d，考察培养基中不同碳氮比，不加氮源、10：1、20： 1、30：1、40：1、50：1对桑黄菌丝生长的影响，葡萄糖含量不变，仅添加不同比例的蛋白胨。结果见表3。

表3不同C/N比下桑黄菌丝生长情况

结果表明，没有氮源的添加，菌丝长势也较好，当添加氮源时，可能营养更全面，长势更好。起初随着C/N比值的增加，菌丝长势越来越好；C/N为20∶1时，菌丝长势最优，边缘整齐，菌丝致密；超过此比例时，菌丝长势变差，边缘长势不齐，菌丝稀疏，生长速度也减慢。因此，确定最适C/N为20∶1。

1.7光照条件的筛选

固定温度28℃，培养10d，考察不同光照条件，连续黑暗、连续光照、光暗交替对桑黄菌丝生长的影响。结果见表4。

表4不同光照条件下桑黄菌丝生长情况

结果表明，菌丝生长过程中对光照条件的改变比较敏感，频繁的改变生长状态，会影响菌丝的生长，对菌丝生长条件不做改变，稳定培养，长势反而更好，连续黑暗条件长势最优，因此，确定最佳光照条件为连续黑暗。

1.8硒元素种类的筛选

固定温度28℃，硒元素添加量为0.03％，避光培养10d，考察不同硒元素种类，硒酸钠、亚硒酸钠对桑黄菌丝生长的影响。结果见表5。

表5不同硒元素种类下桑黄菌丝生长情况

结果表明，添加亚硒酸钠的桑黄菌丝长势明显好于硒酸钠，而且资料显示硒酸钠的毒性更大，菌丝生长一段时间后仍不能适应而停止生长。因此，确定最佳硒元素种类为亚硒酸钠。

1.9硒浓度的筛选

固定温度28℃，避光培养10d，考察不同浓度的亚硒酸钠，0％、0.01％、0.03％、0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、1％对桑黄菌丝生长的影响。结果见表6。

表6不同硒浓度下桑黄菌丝生长情况

结果表明，刚加入亚硒酸钠时，桑黄菌丝生长受到抑制，并且随着硒浓度的增加，菌丝长势先增加后减小，长势逐渐变差，几乎萌发之后就不再生长。综合菌丝长势图示、菌丝生长天数和生长速度，0.03％的硒浓度下，桑黄菌丝圆整，长势均匀，而且生长速度最快。因此，确定最佳硒浓度为0.03％。

2桑黄液体发酵培养的研究

2.2方法与结果

取液体培养基3000mL，装入5000mL的锥形瓶，灭菌后，接种液体菌种，于相应温度下培养，以菌丝干重为指标，考察培养天数、培养温度、培养基起始pH、接种量、装液量、桑枝添加量、硒浓度对桑黄液体发酵培养的影响。

2.2.1培养天数的筛选

固定温度28℃，接种量5％，培养基pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同天数对桑黄生长的影响，以菌丝干重量为指标筛选最佳培养天数，下同。结果见附图1。

结果表明，桑黄菌丝干重随着培养天数的增加而增加，当第7d时达到最大，趋于平稳，超过第8d后，菌丝干重减少，可能是因为培养时间过长，菌丝增多，菌丝代谢物变多，影响菌丝正常生长而造成，7d培养的菌丝量与8d培养相差不大，结合成本综合考虑，确定最佳培养天数为7d。

2.2.2培养温度的筛选

固定天数7d，接种量5％，培养基pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同温度对桑黄生长的影响。结果见附图2。

结果表明，随着温度的提升，菌丝干重逐渐增加，当温度达到28℃时，菌丝干重最大，当温度继续提升，菌丝干重随之减少，说明温度低或高都会影响桑黄菌丝的生长代谢，温度过高菌丝代谢加速，温度过低菌丝活力不高。因此，确定最佳培养温度为28℃。

2.2.3培养基起始pH的筛选

固定天数7d，温度28℃，接种量5％，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同培养基起始pH对桑黄生长的影响。结果见附图3。

结果表明，随着pH的增大，菌丝干重逐渐增加，当pH达到6.5时，菌丝干重达到最高，当pH继续升高时，菌丝干重减少，说明pH会影响桑黄菌丝的生长，而培养基的自然pH为5.6，与pH为6.5时的菌丝干重相差不大，因此，确定培养基不需要调节pH，自然pH为最佳。

2.2.4接种量的筛选

固定天数7d，培养28℃，培养基pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同接种量对桑黄生长的影响。结果见附图4。

结果表明，菌丝干重随着接种量的增大而增大，而且接种量越大，增长趋势越小，最终基本平稳，菌种起初阶段菌丝越多萌发越快，此后长势相差不大，综合经济角度双重考虑，确定最佳接种量为5％。

2.2.5装液量的筛选

固定天数7d，温度28℃，接种量5％，培养基pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同装液量对桑黄生长的影响。结果见附图5。

结果表明，在相同培养条件下，装液量体积越小，菌丝萌发越快，会迅速布满培养液中，随着装液量越大，菌丝干重反而下降，装液量过少，效率不高，装液量过大，培养液容易溅到锥形瓶壁上，造成污染。因此，确定最佳装液量为3000mL。

2.2.6桑枝添加量的筛选

改变2.1.1项下桑枝的添加量，固定天数7d，温度28℃，接种量5％，培养基pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察桑枝片不同添加量对桑黄生长的影响。结果见附图6。

结果表明，随着桑枝添加量越多，菌丝干重越大，当桑枝添加量达到2g/20mL时，菌丝干重最大，随后菌丝干重稳定，基本保持不变，说明2g/20mL的桑枝量其中包含的生长物质已经满足桑黄的正常生长所需，桑枝量过大对桑黄菌丝生长意义不大。因此，确定桑枝最佳添加量为2g/20mL。

2.2.7硒浓度的筛选

改变2.1.1项下亚硒酸钠的添加量，固定天数7d，温度28℃，接种量5％，培养基 pH自然，置于磁力搅拌器上避光培养，考察不同亚硒酸钠浓度对桑黄生长的影响。结果见附图7。

结果表明，随着亚硒酸钠浓度的提升，菌丝干重减少，当达到1％时，桑黄菌丝几乎不再生长，刚加入亚硒酸钠时，菌丝干重大于不加入亚硒酸钠，说明低浓度促进桑黄菌丝的生长，高浓度抑制桑黄菌种的生长。因此，确定最佳硒浓度为0.0001％。

3桑黄固体发酵培养的研究

3.2桑黄固体发酵单因素考察

取液体富硒菌种，接种30mL于固体培养基中，于相应温度下培养，以封面时间、满袋时间和菌粮粉多糖含量为指标，考察培养基、装袋量、培养天数、培养温度、亚硒酸钠浓度对桑黄固体发酵培养的影响。

多糖含量测定方法：采用硫酸-苯酚法。

3.2.1培养基的筛选

改变3.1.1项下固体培养基中的粮食种类A(荞麦)、B(小米)、C(玉米)、D(鹰嘴豆)、E(高粱)、F(燕麦)、G(60％玉米+40％小米)、H(60％玉米+40％荞麦)、I(60％小米 +40％荞麦)、J(50％玉米+30％荞麦+20％小米)，固定温度28℃，装袋量250g，避光培养15d，以封面时间、满袋时间和菌粮粉多糖含量为指标，考察不同培养基对桑黄固体发酵培养的影响。结果见表7。

表7培养基对桑黄固体发酵培养的影响

结果表明，单种粮食前期长势依次为A＞B＞C＞F＞D＞E，后期长势差异较大，鹰嘴豆和高粱长势弱，15d内没有长满菌袋；从多糖含量上明显看出A＞C＞B＞F＞D＞E，荞麦最佳；组合粮食比单种粮食长势好，各组合粮食之间的菌丝长势差异不大，但多糖含量明显不同，可见不同配比粮食中造就的C/N比值对桑黄菌丝的生长尤为重要。综合考虑桑黄菌丝长势，粮食配比以及桑黄菌粮粉多糖含量，确定组合粮食J为最佳培养基，即50％玉米+30％荞麦+20％小米。

3.2.2装袋量的筛选

改变装袋量，固定固体培养基，温度28℃，避光培养15d，以封面时间、满袋时间、干重比和菌粮粉多糖含量为指标，考察不同装袋量对桑黄固体发酵培养的影响。结果见表8。

表8装袋量对桑黄固体发酵培养的影响

结果表明，菌丝的长势随着装袋量的增加而变弱，可能是由于装量越大，菌袋中含氧量越小，影响菌丝生长，尤其上部长满后，下部缺氧，阻碍菌丝的生长；随装袋量的增加，干重比逐渐增大，说明装袋量越小，烘干后所剩的干粮食越少，被菌丝转化利用的粮食越多；多糖的含量基本上呈下降趋势，装袋量为200g时，多糖含量小于250g，可能是因为培养相同天数时，装袋量200g的长势更好，并且超过一定天数时，分泌物增多，代谢加重，反而使多糖含量减少，而且200g的装袋量效率不高，故此确定最佳装袋量为 250g。

3.2.3培养天数的筛选

改变培养天数，固定固体培养基，温度28℃，装袋量250g，避光培养，以封面时间、满袋时间和菌丝多糖含量为指标，考察不同培养天数对桑黄固体发酵培养的影响。结果见表9。

表9培养天数对桑黄固体发酵培养的影响

结果表明，相同培养条件下，菌丝生长情况随着天数的增大而增大，第15d时长势最好，当超过15d的培养天数时，多糖含量反而减少，是因为菌丝生长时间过长，代谢物增多影响正常生长所致，故此确定最佳培养天数为15d。

3.2.4培养温度的筛选

改变培养温度，固定固体培养基，装袋量250g，避光培养15d，以封面时间、满袋时间和菌丝多糖含量为指标，考察不同培养温度对桑黄固体发酵培养的影响。结果见10。

表10培养温度对桑黄固体发酵培养的影响

结果表明，菌丝在26～30℃温度范围内生长良好，随着温度提升菌丝生长速度加快，但温度过高，加速了菌丝的代谢作用，消耗大于产出，因此多糖含量会减少；温度过低时，菌丝生长会受到抑制，长势缓慢，多糖含量较低，故此，确定最佳培养温度为28℃。

3.2.5硒浓度的筛选

改变3.1.1项下固体培养基中亚硒酸钠添加量，固定温度28℃，装袋量250g，避光培养15d，以封面时间、满袋时间和菌丝多糖含量为指标，考察不同亚硒酸钠浓度对桑黄固体发酵培养的影响。结果见表11。

表11亚硒酸钠浓度对桑黄固体发酵培养的影响

结果表明，刚加入亚硒酸钠时，桑黄菌丝生长受到一定程度的抑制，随着亚硒酸钠浓度的提升，菌丝生长长势逐渐变好，所含有效成分多糖含量也逐渐提升，但超过一定限度时减少；封袋时间和满袋时间一直随着亚硒酸钠浓度的提升而增加，说明桑黄对外加的无机硒亚硒酸钠还是需要一段的适应期，可能再培养一代时，这种情况会有所改善；亚硒酸钠浓度在60mg/kg和80mg/kg时，菌丝生长效果较好且多糖含量高，但考虑到亚硒酸钠浓度在60mg/kg得到的培养物中，所含硒元素在10g内不会超过人体一日最大服用量，故此确定最佳亚硒酸钠浓度为60mg/kg。

4发酵前后淀粉含量的变化

精密称定组合粮食、菌粮粉(粉碎，过四号筛)各20g，分别置于1000mL旋转蒸发仪中，加入30倍水，沸水浴提取2次，1h/次，抽滤洗涤，合并滤液，浓缩至200mL，放冷后加乙醇至含醇量60％，静置过夜，4500r/min离心10min后，抽滤，上清液备用，沉淀60℃下干燥至恒重，即淀粉含量，结果见表12。

表12发酵前后淀粉的含量变化

结果表明，组合粮食经桑黄菌种发酵之后，淀粉含量明显下降，消耗了约58％，佐证了桑黄菌种对粮食的发酵作用，对其中所含的大分子物质淀粉进行了生物利用，且利用效率较高。

3发酵前后蛋白质含量的变化

3.1样品前处理

清洗消化管，然后烘干，精密称取样品0.15g，硫酸铜0.4g，硫酸钾6g于消化管中，加入浓硫酸10mL，水5mL，保鲜膜封口静置过夜，放到消解仪上开始消解，按表3-4进行梯度消化，以样品澄清呈蓝绿色后，再消化至少0.5h为宜。消化完成后，取下消化管冷却，彻底冷却后上机开始测试。

表13梯度消化数据

3.2.2样品测定

打开自来水，检查试剂，依次点击开机、自动测试、确认、设置参数(稀释水5mL，硼酸15mL，碱60mL，淋洗10mL，蒸馏5分钟)，参数设定好，点击确认，对5个空管测试，进行预热达到最稳定的状态，即可测样品空白，然后继续测样，处理好的样品用盐酸标准溶液滴定，结果见表14。

表14发酵前后蛋白质的含量变化

结果表明，发酵前后蛋白质含量有不同程度的减少，依次为荞麦、组合粮食、玉米、小米，蛋白质作为营养物质被利用进行代谢，合成自身所需的物质，佐证了桑黄菌种对粮食的发酵作用。

4发酵前后多肽含量和分子量的变化

4.1福林酚比色法

4.1.1试剂的配制

福林酚试液：称取钼酸钠2.5g，钨酸钠10g，85％磷酸5mL，盐酸10mL置于200mL 圆底烧瓶中，水70mL，加热回流10h，自然冷却后，加硫酸锂15g、水5mL，溴1滴煮沸 15min至溴除尽，自然冷却，水定容至100mL，滤过置棕色瓶中，于冰箱中保存，即得。使用之前，加蒸馏水稀释16倍。

碱性铜试剂：甲液：称取碳酸钠50g，氢氧化钠10g，加水溶解，即得；乙液：称取酒石酸钾钠0.5g，硫酸铜0.25g，分别用水溶解，两液混合，即得。临用时，甲乙液混配定容至500mL，现用现配。

4.1.2菌粮粉多肽供试品溶液的制备：

精密称定菌粮粉0.5g，置于具塞锥形瓶中，水30mL，沸水浴提取30min，抽滤，放冷，滤液置50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

4.1.3对照品溶液的制备

精密称定牛血清白蛋白15.08mg于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得。

4.1.4标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分别置于10mL的试管中，加水至1.0mL，加入1.0mL的碱性铜试剂，全部摇匀，再加福林酚试液4mL，混匀后，55℃水浴保温5min，冰水冷却10min，以相应试剂为空白，650nm下测定吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见附图8。回归方程Y＝2.4866X+0.0366 (r＝0.9957)，表明多肽含量在0.05～0.3mg/mL浓度范围内线性范围良好。

4.1.5多肽含量的测定

取一定体积的供试品溶液，按上述方法测定，吸光度代入回归方程，计算总肽浓度，平行操作5次，结果见表15。

表15发酵前后多肽的含量变化

结果表明，桑黄富硒菌粮粉中的多肽含量明显的多于混合粮食，提高了大约0.5％，说明桑黄菌种在发酵过程中，对粮食中蛋白质进行了生物转化，合成了自身所需的多肽。

4.2紫外光谱法

精密称定菌粮粉20g，加水600mL，沸水浴加热提取30min，抽滤后，浓缩至200mL，得到多肽溶液，备用。采用1.6cm直径，柱高50cm的玻璃珠，装柱30cm的DA201-C的大孔树脂，多肽溶液取20mL，稀释至100mL上柱。利用梯度洗脱分段(水液、25％乙醇、 50％乙醇、75％乙醇)进行收集，每组收集30次，7mL/次，然后按照福林酚比色法对多肽的吸光度进行测定。

结果表明，梯度洗脱后的多肽溶液呈现良好的趋势，可以看出，水洗脱液吸光度小于0.2，说明供试品溶液中多肽基本被DA201-C的大孔树脂吸附；其中吸光度A_{25％乙醇洗脱液}＞A_{50％乙醇洗脱液}＞A_{75％乙醇洗脱液}，说明小分子多肽含量最多，中等分子多肽次之，大分子多肽最少，说明桑黄发酵使大分子蛋白或多肽转化成了小分子肽。

4.3高效凝胶色谱法

4.3.1试剂的配制

PBS溶液(pH＝6.7)：加入1.74g磷酸二氢钾，2.7g磷酸氢二钾，1.7g氯化钠，定容至1L，即得0.1mol/L的PBS溶液。

4.3.2色谱条件

色谱柱:TSK-gel G2000SWXL(300mm×7.8mm)凝胶柱；流动相：0.1mol/L的PBS溶液；检测波长：280nm；流速：0.5mL/min；柱温：25℃。

4.3.3供试品溶液的制备

按4.2项下，精密称取菌粮粉20g，制备多肽溶液，并梯度洗脱分段(水液、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇)进行收集，每组洗脱液为200mL，备用。

4.3.4对照品溶液的制备

取牛血清白蛋白、胰蛋白酶抑制剂、人血管紧张素Ⅱ、乙氨酰乙氨酰乙氨酸，用流动相配制成1mg/mL的混合对照品溶液，用孔径为0.22um滤膜过滤后进样。

4.3.5分子量校正曲线的制备

将对照品溶液过孔径0.22um滤膜后进样，得到混合标准品的色谱图，结果见附图9，各标准品出峰情况见表16。

表16各标准品出峰情况

根据表中数据，以保留时间为横坐标，相对分子量对数值为纵坐标，绘制分子量校正曲线，得到回归方程，结果见附图10。

结果表明，分子量在189Da到66430Da范围内线性关系良好，回归方程为 Y＝-0.1907X+7.307,(r＝0.9974)。

用高效凝胶过滤色谱法对空白粮食和富硒菌粮粉中多肽的相对分子质量分布进行了研究，根据回归方程计算相对分子质量，得到不同组分不同分子量段下的分布情况。结果表明，仅粮食中含有大于66430Da的大分子物质蛋白质，其中，1045.5Da～189.1Da仅占11.36％；经发酵后的菌粮粉，不含有大于66430Da的大分子蛋白，6511Da～189.1Da 之间的多肽及小分子肽含量达到70.86％，并且过DA201-C大孔树脂柱，经梯度洗脱后，对不同分子量的肽进行了分离，25％醇中6511Da～189.1Da之间的多肽及小分子肽含量占 79.27％，50％醇中占65.87％，75％醇中占68.26％，验证了发酵后多肽物质含量的提升，大分子蛋白、多肽转化成了小分子肽，有利于人体对有效成分的吸收，效率增加。

按上述生产方法得到的桑黄富硒菌粉的应用，包括但不限于下述应用：根据所生产的桑黄富硒菌粉的营养特性、功能特性和加工特性，以桑黄富硒菌粉作为基本素材，可以开发出许多优质、营养、健康的食品。

附图说明

图1为培养天数对桑黄液体发酵培养的影响。

图2为培养温度对桑黄液体发酵培养的影响。

图3为培养基起始pH对桑黄液体发酵培养的影响。

图4为接种量对桑黄液体发酵培养的影响。

图5为装液量对桑黄液体发酵培养的影响。

图6为桑枝添加量对桑黄液体发酵培养的影响。

图7为亚硒酸钠浓度对桑黄液体发酵培养的影响。

图8为牛血清白蛋白标准曲线。

图9为分子量校正曲线。

图10为分子量校正曲线回归方程。

具体实施方式

下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：

实施例1桑黄富硒菌粉的制备方法

(1)菌种的平面培养：碳源为葡萄糖，氮源为麸皮，C/N比值为20：1，避光培养，富硒物为亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量为0.03％；

(2)菌种的液体扩增：天数为7d，温度为28℃，接种量为5％，装液量为3000mL，桑枝添加量为2g/20mL，亚硒酸钠添加量为0.0001％；

(3)固体发酵：培养基为：50％玉米、30％荞麦及20％小米，装袋量为250g，天数为15.50d，温度为28℃，亚硒酸钠添加量为60mg/kg。

实施例2桑黄富硒菌粉

取实施例1所述的桑黄富硒菌粉，经检测：桑黄富硒菌粉比粮食发酵前淀粉由22.15％减少为9.22％；蛋白质由10.01g/100g减少为9.43g/100g；多肽由1.54％增加为2.08％；发酵后多肽分子量减小。

Claims (6)

1.一种桑黄富硒菌粉，其特征在于是在固体培养基中加入了桑树枝提取液以及多种粗粮经发酵而成，具体的说是经过菌种的平面培养、菌种的液体扩增、固体发酵而制成。

2.根据权利要求1所述的桑黄富硒菌粉，其特征在于采用以下步骤：

（1）菌种的平面培养：碳源为葡萄糖，氮源为麸皮，C/N比值为10～30：1，避光培养，富硒物为亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量为0.01～0.05%；

（2）菌种的液体扩增：天数为7d，温度为28℃，接种量为2～10%，装液量为3000mL，桑枝添加量为1～10g/20mL，亚硒酸钠添加量为0.00002～0.0002%；

（3）固体发酵：30～80%玉米、20～60%荞麦及10～40%小米混合组成培养基，装袋量为250g，天数为15.50d，温度为28℃，亚硒酸钠添加量为20～100mg/kg。

3.根据权利要求2所述的桑黄富硒菌粉，其特征在于采用以下步骤：

（1）菌种的平面培养：碳源为葡萄糖，氮源为麸皮，C/N比值为20：1，避光培养，富硒物为亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量为0.03%；

（2）菌种的液体扩增：天数为7d，温度为28℃，接种量为5%，装液量为3000mL，桑枝添加量为2g/20mL，亚硒酸钠添加量为0.0001%；

（3）固体发酵：培养基为：50%玉米、30%荞麦及20%小米，装袋量为250g，天数为15.50d，温度为28℃，亚硒酸钠添加量为60mg/kg。

4.根据权利要求1或2所述的桑黄富硒菌粉，其特征在于桑黄富硒菌粉比粮食发酵前淀粉由22.15%减少为9.22%；蛋白质由10.01g/100g减少为9.43g/100g；多肽由1.54%增加为2.08%；发酵后多肽分子量减小。

5.根据权利要求1或2所述的桑黄富硒菌粉，其特征在于桑黄富硒菌粉全部通过四号筛，水分不超过9.0%，休止角在30°～35°之间，总灰分和酸不溶性灰分均不超过5%，水溶性浸出物含量不少于15%，醇溶性浸出物含量不少于10%，多糖含量不少于90mg/g，黄酮含量不少于0.5mg/g，三萜含量不少于8.5mg/g，有机硒含量不少于35μg/g，硒转化率不低于95%，砷的含量不超过1.0mg/kg，镉、汞的含量不超过0.1mg/kg，铅的含量不超过2.0mg/kg。

6.权利要求1或2所述的桑黄富硒菌粉在制备用于抗氧化、提高人体免疫等药物中的应用。