CN104087633A - 基于固体发酵的青稞中多糖含量的提高方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于固体发酵方法提高青稞多糖含量方法。该工艺涉及生物工程技术领域，以灵芝为发酵菌株、青稞为主要基质，灵芝菌株通过液体发酵后进一步在青稞基质中固体发酵，从而使得青稞中的多糖含量增加、易于分离。青稞充分吸水后，接入10％的灵芝液体菌种，25‐30℃条件下固体发酵7‐10天；发酵后的青稞基质粉碎后，加10倍量的水提取，提取液减压浓缩后，加入乙醇沉淀，上清液8000转离心分离或静置2小时后过滤分离，残渣即为多糖。采用该方法固体发酵后多糖含量比原来青稞中多糖的含量提高了2倍以上，且易于提取分离；所得多糖兼有青稞多糖和灵芝多糖的活性成分，可用于各类食品添加剂、保健食品、药物的开发等领域。

Description

基于固体发酵的青稞中多糖含量的提高方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的青稞深加工方法，具体是一种以青稞籽粒为原料利用生物转化原理提高青稞中β‐葡聚糖含量的制备方法。

背景技术

青稞(HordeumvulgareVar.Muda)，英文名hulless barley，是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。青稞分为白青稞，黑青稞，墨绿色青稞等种类。青藏高原是野生大麦和青稞栽培的起源地也是优质青稞的丰产地。在粮食作物中，青稞具有高蛋白质、高纤维、高维生素、低脂肪、低糖等特点。据检测青稞β‐葡聚糖平均含量为6.57％，优良品种青稞可达8.6％，仅比燕麦低0.1百分点，是小麦平均含量的50倍。正是由于青稞中可溶性膳食纤维含量高，特别是β‐葡聚糖含量高，青稞作为营养保健品的重要地位越来越受到人们的重视。(张峰，杨勇，赵国华等.青稞β‐葡聚糖研究进展.粮食与油脂，2003(12)：3‐5.AhmadA，AnjumFM，ZahoorT，NawazH，DinA.hysicochemical andfunctional properties of barleyβ‐glucan as affected by different extraction procedures.International Journal of Food Science&Technology，2009，44(1)：181‐187.)

β‐葡聚糖是谷物胚乳和糊粉层细胞壁的一种非淀粉多糖，是一种分子量小于纤维素的复合的葡萄糖聚合糖。β‐葡聚糖有两种同分异构体：β‐D‐(1→4)葡聚糖和β‐D‐(1→3)葡聚糖，被认为是最具生理活性的一种多糖，主要存在于皮大麦、青稞(裸大麦)和燕麦的糊粉层和胚乳细胞壁中(Miller S Sand Fulcher RG.Distributionof(1→3)，(1→4)β‐D‐glucan in kernels of oats andbarley using microspectr of luorometry.Cereal Chemistry.1994，(71)：64‐68.MusattoSI，DragoneGand Roberto IC.Brewers’spentgrain：generation，characteristics and potential application.Journal of Cereal Science.2006，43(1)：1‐14)。经过生物转化后的青稞中β‐葡聚糖的含量更高，更有利提取与分离。20世纪60年代，研究逐渐发现β‐葡聚糖具有降血脂、降胆固醇和预防心血管疾病的作用，随后β‐葡聚糖的调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤的作用也陆续被发现，引起了全世界的广泛关注。愈来愈多的医疗研究已证实β‐葡聚糖对肿瘤、肝炎、糖尿病等疑难病都有良好的治疗效果。目前，生物医学界普遍认为β‐葡聚糖具有清肠、调节血糖、降低胆固醇、提高免疫力等四大生理作用(BaikBK，UllrichSE.Barley for food：characteristics，improvement，and renewed interest.Journal of Cereal Science，2008，48(2)：233‐242.BrennanCS，Cleary LJ.The potential use of cereal(1→3，1→4)‐β‐d‐glucans as functional food ingredients.Journal ofCereal Science，2005，42(1)：1‐13)西藏自治区农牧科学院在对西藏75个青稞品种研究后发现，西藏青稞β‐葡聚糖含量在3.66％‐8.62％之间，平均含量为5.25％，在谷类作物中含量最高，远远高于皮大麦、小麦和燕麦，“藏青25”的青稞新品种β‐葡聚糖含量高达8.62％，是目前世界上含β‐葡聚糖最高的麦类作物(江春艳，严冬，谭进等.青稞的研究进展及应用现状.西藏科技，2010，(2)：14‐16.洛桑旦达，强小林.青稞特有营养成份分析与开发利用现状调查研究报告.西藏科技.2001，(8)：55‐64)。

固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的固态基质中进行的发酵过程。其优势有以下几点：首先，固体发酵使用的培养条件相对粗放，而且培养基只需要比较简单的前期处理；其次，工业生产的资金投入比较小，尤其在工业生产前期投入少，利于规模化生产；另外，固体发酵的产品性能较好、而且工业生产时环境污染比较小，更有利于生物循环(Barrios‐GonzálezJ.Solid‐statefermentation：Physiology of solid medium，its molecular basis andapplications.Process Biochemistry.2012，47(2)：175‐185)。如今，固体发酵被广泛应用于来生产许多低成本高附加值的产品。灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，自古以来就是我国名贵药用真菌。卫生部2001年发布的“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，有三种灵芝科真菌：赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)。在实际被开发利用的灵芝种类中，有些种类(如赤芝Ganoderma lucidum等)已经被人工栽培，作为制药或保健食品的生产原料出口国外或用于国内市场；有些种类(如薄盖灵芝Ganoderma capense)已被用于液体深层培养，获得菌丝体及其代谢产物生产保健食品、药品(ZhouXW，SuKQ，ZhangYM.Applied modernbiotechnology for cultivation of Ganoderma and development of their products.ApplliedMicrobiology and Biotechnology.2012，93：941‐963)。目前以玉米、小麦、大豆等农作物的种子为基质，以灵芝(Ganoderma lucidum)为菌株构建生物转化体系生产各类活性物质在国内外已经有不少的报道(高文庚.以玉米为基质的灵芝固体发酵条件优化.中国农学通报。2007，23(7)422‐422。AsgherM，SharifY，and BhattiH.Enhanced production of ligninolytic enzymes byGanodermalucidum IBL‐06using ligno cellulosic agricultural wastes.International Journal ofChemical Reactor Engineering.2010，8：59.MurugesanK，NamIH，KimYM，and ChangYS.Decolorization of reactive dyes by a thermostable laccase produced by Ganoderma lucidum insolid state culture.Enzyme and Microbial Technology.2007，40：1662‐1672.)，但尚未见以青稞为基质针对提高多糖含量进行研究的相关报道。

β‐葡聚糖是大麦品质的一个重要指标，以食用为主的西藏青稞含有大量的β‐葡聚糖，其具有降低胆固醇、降血脂、调节血糖的保健功能，已被越来越多的研究者和消费者所接受和认可。利用生物转化原理获得的青稞发酵基质中的β‐葡聚糖易被分离、纯化，且兼具有灵芝β‐葡聚糖和青稞β‐葡聚糖的功效，因此可广泛应用于保健食品、药品等领域的产品加工。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103689550A公开(公告)日2014.04.02，公开了一种灵芝功能性食品及其制备方法。该工艺涉及生物工程技术领域，以玉米和小麦为主要原料采用菌种液体深层培养和固体发酵技术制备灵芝功能性食品。玉米和小麦浸泡，使含水率达到40～80％，灭菌后接入5～30％灵芝种子液，用保鲜膜密封发酵，发酵物经过烘干和粉碎、即为灵芝功能性食品。该制品灵芝三萜含量0.8～3.9mg/g，蛋白质0.9～8mg/g，可溶性糖<50mg/g，多糖1～15mg/g。但该技术的缺陷和不足在于灵芝液体菌种的制作使用了多种农副产品(如豆饼粉、玉米浆、麸皮等)作为培养基，这些用于培养基制作的农副产品中碳源和氮源的比例(碳氮比C/N)不清楚，且由于受大豆、玉米、小麦品种的影响，以及各自加工工艺的影响，各批次材料(豆饼粉、玉米浆、麸皮)的差异难以控制，因此用于规模化固体发酵的菌种制作，会使得菌种质量的难以控制。从而降低了后续固体发酵的可控性和发酵产品的质量。此外，灵芝固体发酵中有多种代谢产物，针对不同代谢产物固体发酵的工艺是有区别的，没有一个固定的工艺适合各种代谢产物的生产，各种代谢产之间可能存在着此消彼长的关系(Zhou XW，Su KQ，Zhang YM.Applied modern biotechnology for cultivation ofGanoderma and development of their products.Appllied Microbiology and Biotechnology.2012，93：941‐963)。所以该技术存在的另外一个明显的不足在于灵芝固体发酵到底是针对哪一种目标物而设计的和实施的并不清楚。

中国专利文献号CN103695226A公开(公告)日2014.04.02，公开了一种灵芝果酒及其制备方法，该工艺涉及生物工程技术领域，以玉米、小麦和大米为主要原料采用固体发酵技术和酿酒工艺制得灵芝酒。玉米和小麦浸泡，使含水率达到40～80％，灭菌后接入5～30％灵芝种子液，用保鲜膜密封发酵，加入30～70％灵芝发酵物重量的大米煮成的米饭，和大米重量1～5％的酒曲，2～5倍的水，经过10～30℃，10～50天发酵，发酵液经过过滤、勾兑获得灵芝果酒。该酒酒精度8～30％，灵芝三萜含量50～500mg/L，蛋白质60～500mg/L，还原糖<2.0％，多糖100～800mg/L，色质米黄色至褐色。但该技术的缺陷和不足在于在发酵的过程中加入大米煮成的米饭和酒曲，灵芝的固体发酵是一个好氧发酵的过程，而酒曲和米饭的发酵是一个厌氧发酵的过程，所以在灵芝固体发酵的基质中加入米饭和酒曲进一步发酵缺乏科学依据，存在着明显的技术缺陷；此外，酒曲中存在着多种微生物，包括细菌和真菌(荣瑞金,李祖明,王德良，白志辉,李鸿玉,荣瑞芬,叶磊.中国酒曲微生物研究进展.中国酿造.2009,(6):5‐8),酒曲中的这些微生物是否能够和灵芝菌共同发酵，以及他们代谢产物之间的关系，目前还没有相关的报道和确切的证据。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于固体发酵的青稞多糖含量的提高方法，既兼顾青稞功效成分的改善和保留，又能增加了灵芝β‐葡聚糖的成分，明显改善青稞中β‐葡聚糖的含量和产品的功效。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明通过将青稞籽粒接入灵芝液体菌种并固体发酵得到青稞发酵基质；然后将青稞发酵基质干燥、粉碎后经乙醇提取得到的沉淀物即为多糖。

所述的青稞籽粒优选为经过挑选的优质种子，经过清洗浸泡后灭菌处理。

所述的清洗浸泡是指：浸泡温度为30℃，固体发酵温度为28℃，在此条件下，固体发酵的青稞籽粒菌丝体浓密，β‐葡聚糖含量较高。如果要在较短段时间获得较高的β‐葡聚糖含量，可以选择浸泡温度为40℃，固体发酵培养温度为30℃，此条件下，发酵时间可缩短，β‐葡聚糖含量也会保持较高，但青稞籽粒的涨破率会增加，增加了培养过程中污染的概率。通过上述方法，能够提高青稞中β‐葡聚糖含量至青稞籽粒的2倍以上，取得了预料不到的效果。

所述的固体发酵包括如下两个步骤：①接种，是指在无菌条件下，将灵芝液体菌种按照5％‐10％的量(v/v)接入已经灭菌的青稞籽粒中；②培养，是指温度为25‐30℃，相对湿度为85‐95％的环境下培养8‐10d。

所述的灵芝是指：我国卫生部2001年发布的《可用于保健食品的真菌菌种名单》中的灵芝(Ganoderma lucidum)。

所述的灵芝液体菌种是指：经过复壮、液体培养后获得的悬浮在培养液中的灵芝菌丝体和培养液的复合体。

所述的干燥包括：①把发酵后的青稞基质放入风速2.5‐4m/s、风温50～55℃的电热鼓风干燥装置中干燥3‐4.5小时，使物料含水量降低到15％‐20％；②把经过上述①处理的青稞基质放入微波炉干燥和杀菌装置中，微波干燥和杀菌装置的干燥功率为0.2‐0.3W/g，频率为2450MHz±50MHz，铺放厚度1.5‐2.5cm，风速40～45m/min，干燥和杀菌的时间为20～30min，使物料含水量降低到10％‐12％。

所述的粉碎是指：利用粉碎机械将青稞发酵基质打碎，并过30～50目筛网。

所述的乙醇提取包括以下步骤：

①粉碎后的青稞发酵基质用75％(v/v)乙醇，60℃水浴1h，用于去除脂、单糖、低聚糖等物质；

②去脂后的残渣加10倍量(v/v)的清水浸泡1小时后，超声处理10‐15min后于95℃水浴提取2‐4h；

③渣滤进行第二次浸提；再过滤，滤渣进行第三次浸提；合并三次浸提液。

④减压浓缩，55℃旋转蒸发，滤液浓度相当于原浸提液1/3‐1/5体积时，进入乙醇沉淀环节。

⑤在搅拌状态下，以流速(每min1/10水提物的体积)加入2倍量体积的95％以上(v/v)乙醇，并置于冷冻环境下过夜；

⑥采用5000‐10000转离心分离或静置2小时后过滤分离，所得滤渣即为提取的粗多糖。

步骤①中，醇提1h后的产物优选经过滤，滤渣用75％乙醇洗涤2次。

步骤②中，浸泡1小时后的混合液体优选经超声处理10min后于95℃水浴提取4h，提取液透析至不再有还原糖反应。

步骤④中，滤液浓度优选为在55℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/3‐1/5。

步骤⑤中，所述的冷冻环境为4℃。

步骤⑥中，离心分离的速度优选为8000r/min，离心处理20min，所得沉淀用无水乙醇洗涤2或3次，冷冻干燥即得菌质多糖粗品。

技术效果

与现有技术相比，本发明采用生物转化方法，利用灵芝菌丝分泌的相关酶转化青稞中的纤维素、半纤维素等物质称为β‐葡聚糖，使得生成的发酵基质中的β‐葡聚糖含量比普通青稞提高了两倍以上。

本发明中青稞发酵之前对青稞的温水浸泡，增加了发酵基质中营养成分(CN103461861A；曾亚文,杨涛,普晓英,等.大麦籽粒中γ氨基丁酸、总黄酮和生物碱含量在发芽过程中的变化.麦类作物学报,2012,32(1):135‐139.)，更有利于灵芝菌丝生长的营养需求，使得发酵时间缩短到了10天以内(相比CN201210366380.1发酵时间为5‐20天)；此外，发酵后的青稞基质糊粉层和胚乳细胞壁发生了变化，更利于多糖的提取，节省了能耗，减少了工艺时间和人力成本。

本发明中对青稞发酵基质的干燥中，采用的微波干燥与杀菌的工序，工艺简单、时间短(20‐30min)，能够有效抑制发酵结束后杂菌的进一步滋生，确保进一步提取多糖(或作其它用途)时原材料的质量。

附图说明

图1为本发明流程示意图。

图2为实施例中固体发酵完成后的谷物‐灵芝菌丝体基质示意图；

图中：A玉米‐灵芝发酵菌质、B小麦‐灵芝发酵菌质、C青稞‐灵芝发酵菌质。

图3是发酵基质多糖的提取工艺示意图。

图4为实施例中葡萄糖的标准曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

灵芝液体菌种的制作

1.培养基的制作：

1)PDA固体培养基制作

配制方法：去皮马铃薯200g用700～800mL蒸馏水煮30～40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g、KH₂PO₄5g、MgSO4·7H₂O3g、VitaminB₁0.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‐7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板，4℃保存。

2)灵芝预培养培养基制作

配制方法：称取蔗糖35g、蛋白胨(NIHONSEIYAKU公司)5g、酵母粉(MERCK公司)25g、KH₂PO₄·H₂O1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、VitaminB₁0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，4℃保藏。

2.预培养：由试管斜面或培养皿平板固体培养基上的灵芝菌丝接至PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养7d。用接种铲将0.9～1.1cm²的平板菌种接至装有20～40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中，并捣碎。静置2‐3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4‐6d。

所述的灵芝菌丝取自市售的灵芝(Ganoderma lucidum)，菌株编号GIM5.8，购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

2.扩大培养：将150mL三角瓶中的培养物转入500mL或1L三角瓶中(前者加入100mL，后者加入200mL液体灵芝预培养培养基)放入28℃恒温振荡器中120rpm培养5‐7d，备用。

3.产物

培养5‐7d后培养液清凉透明、菌丝球浓密，且均匀地悬浮在培养液中，培养结束。获得的菌丝球悬浮液可用于固体发酵的液体菌种。

实施例2

谷物‐灵芝的固体发酵

1.挑选：分别选取小麦、青稞和玉米作为固体发酵的基质，采取目测的方法，根据颜色、体积质量，尽量选取透亮、饱满、质量相近的谷物(小麦、青稞和玉米)种子，剔除干瘪、不饱满、有褶皱、残缺、发霉或有病虫害的种子。

2.清洗：使用清水冲洗数min。

3.浸泡：将清洗过的谷物种子置于合适的培养器皿(如不锈钢缸、槽等)，加入热水，种子和水的质量体积比为1：5～1：10，在前期预实验的基础上确定浸泡温度在30℃～40℃，浸泡时间分别为24～36h不等，当单个谷物籽粒充分吸水后(用手指能够轻松捏开时)，浸泡结束。

4.固体发酵(25℃～30℃，8～10d)

4.1)固体发酵的培养基制作

固体发酵基础培养基：把浸泡后的谷物(小麦、青稞和玉米)籽粒置于普通铁锅中煮沸15～20min，至手指捏开麦粒时里面没有“白心”为度，捞出沥干，含水量掌握在55～65％，再与配料(葡萄糖2.5％，KH₂PO₄0.375％，MgSO₄.7H₂O0.25％，CaCO₃1％)混合拌匀、装瓶，灭菌后即可接入液体种。

每种谷物接种6瓶，瓶内培养基的装量至瓶肩为度。

4.2)接种

接种前30min打开超净工作台内紫外灯，并开启风机；30min后关闭紫外灯，开启风机，稍后在无菌条件下打开瓶盖，在灭菌后的固体发酵培养基中用消毒后的玻璃棒在中间打一小洞，将已经准备好的灵芝液体菌种，用移液器按照发酵基质总量的5％和10％接入灵芝液体菌种，封盖后送入培养箱内培养。

4.3)培养

在25℃‐30℃条件下培养，菌丝体封口后，将瓶子倒置培养；8‐10d待菌丝长满瓶后结束培养。

5、接种量和接种方法对菌丝生长的影响：

观察表明：5％接种量和10％的接种量，菌丝生长速度差异较大。前者菌丝分布不匀，菌丝细弱，吃料定植缓慢，封口时间慢，试验结束时仍未长满，内部菌丝稀疏；后者液体菌种可以迅速分布开来，菌丝生长旺盛，内部菌丝浓密(见图2)。

观察结果显示：用10％接种量，小麦、玉米、青稞基质发酵封口的时间分别为：4d、4d和3d；长满瓶的时间分别为：9d、8d和7d。发酵完成后的灵芝‐谷物发酵基质如图2所示。

鉴于上述实验，分析认为10％接种量较为合适。虽然以小麦、玉米、青稞三种作物分别为固体发酵基质时，固体发酵的封口时间和满屏时间差异不是特别明显，但是我们依然可以看出以青稞为发酵基质时，封口时间和满瓶时间都早于以小麦和玉米为基质。

实施例3

谷物‐灵芝发酵基质中粗多糖的提取

1.干燥与二次杀菌

将谷物(小麦、青稞、玉米)‐灵芝发酵的基质从瓶子中掏出后，采用上海弘圆微波设备制造有限公司生产的箱式微波干燥杀菌机，微波干燥和杀菌装置的干燥功率为0.2‐0.3W/g，频率为2450MHz±50MHz，铺放厚度1.5‐2.5cm，风速40～45m/min，干燥和杀菌的时间为20～30min，使物料含水量降低到10％‐12％。

2.粉碎

干燥后的发酵基质采用小型食品粉碎机粉碎，过30～50目不锈钢筛网。

3.提取

3.1)前处理：称取一定量的粉碎后的固体菌质，加入适量的75％乙醇60℃水浴醇提1h去除脂、单糖、低聚糖等物质，过滤，滤渣用75％乙醇洗涤2次后备用。

3.2)提取：称取一定量的处理后的残渣加10倍蒸馏水，超声处理10min后于95℃水浴提取4h，提取液透析至不再有还原糖反应。

3.3)减压浓缩：是指透析液在55‐60℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/3‐1/5.

3.4)乙醇沉淀：在搅拌状态下，以流速(每min1/10水提物的体积)加入2倍量无水乙醇于浓缩后的透析液中，4℃过夜。

3.5)分离：透析液分装入8000r/min离心20min。沉淀用无水乙醇洗涤2或3次，冷冻干燥即得菌质多糖粗品。

4.结果

分别获得三种粗多糖样品，即小麦‐灵芝、青稞‐灵芝和玉米灵芝的粗多糖产品。

实施例4

苯酚硫酸法测定β‐葡聚糖含量

采用实施例3中收集的粗多糖样品进行下列实验。

1.标准曲线的绘制

精密称取一定重量的样品，于105℃干燥至恒重；准确称取已干燥恒重的葡萄糖0.5000g，加水溶解，定容至50mL，作为葡萄糖标准储备液(此溶液1mL含10.0mg葡萄糖)。准确吸取葡萄糖标准储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，作为葡萄糖标准使用液(此溶液1mL含0.10mg葡萄糖)。

准确吸取葡萄糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(相当于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.l0mg)分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.待测样品溶液的制备：

2.1)样品提取：准确称取三种待测样品2.0g(精准至0.0001g)混匀，置于100mL容量瓶中，加水80mL，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后补水定容至100mL，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖。

2.2)沉淀粗多糖：准确吸取①中终滤液5.0mL以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用80％(体积分数)乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3～4次。残渣用水溶解并定容至5.0mL，混匀后，供沉淀葡聚糖。

2.3)沉淀葡聚糖：准确吸取②中终溶液2mL置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL、铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10％(体积分数)硫酸溶液2.0mL溶解并转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度定容，混匀。此溶液为样品测定液。

3.葡聚糖糖含量测定：准确吸取样品测定液2.0mL置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却至室温，用分光光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。依据标准曲线计算样品中葡萄糖含量。同时做样品空白实验。

4.测定结果

4.1)回归方程：按照王亚光《保健食品功效成分检测方法》(中国轻工业出版社，2002)报道的方法，以葡萄糖糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，见图3；葡萄糖标准曲线见图4。葡萄糖含量和吸光度值经回归处理，回归方程为Y＝34.9768+0.04756X，R²＝0.99862(n＝7)。糖浓度在0～1.0mg/mL范围内线性较好。

4.2)样品中β‐葡聚糖含量测定样品中葡萄糖含量测定的结果如表1所示。进一步对基质发酵前后多糖含量的变化进行方差分析，分析结果见表2。

表1谷物发酵前后多糖含量的变化

表2谷物发酵前后吸光度的方差分析

由表1可以看出，以青稞为固体发酵基质时，菌质多糖含量明显高于其他发酵基质。表2方差分析结果可知发酵前后多糖含量达到差异极显著(P<0.01)的水平，由此可以推断以青稞为基质，经过灵芝菌丝的固体发酵后，能显著提高基质中多糖的含量。

青稞作为固体发酵基质时，培养基组织状态疏松，透气性好，利于菌体生长。青稞目前的主要使用区域仍在藏区，我国藏民主要将青稞制成糌粑，口感较粗糙，不易被人体吸收，如果通过生物转化的方法增加青稞中活性成分的含量和种类，同时改善口感、使得各类成分易于吸收，其利用空间将会进一步被拓宽。

Claims (10)

1.一种基于固体发酵的青稞多糖含量的提高方法，其特征在于，通过将经过清洗浸泡后灭菌处理的青稞籽粒接入灵芝(Ganoderma lucidum)液体菌种并固体发酵得到青稞发酵基质；然后将青稞发酵基质干燥、粉碎后经乙醇提取得到的沉淀物即为多糖；

所述的清洗浸泡是指：浸泡温度为30℃～40℃，固体发酵温度为28℃～30℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的固体发酵包括：

①接种，是指在无菌条件下，将灵芝液体菌种按照5％‐10％的量(v/v)接入已经灭菌的青稞籽粒中；

②培养，是指温度为25‐30℃，相对湿度为85‐95％的环境下培养8～10d。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的清洗浸泡是指：当浸泡温度为30℃时，固体发酵温度为28℃；当浸泡温度为40℃时，固体发酵温度为30℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的灵芝液体菌种是指：经过复壮、液体培养后获得的悬浮在培养液中的灵芝菌丝体和培养液的复合体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的复壮是指：由试管斜面或培养皿平板固体培养基上的灵芝菌丝接至PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养7d。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的PDA固体培养基通过以下方式配制得到：去皮马铃薯200g用700～800mL蒸馏水煮30～40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g、KH2PO45g、MgSO4·7H2O3g、Vitamin B10.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‐7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×105Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板，4℃保存。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的液体培养是指：用接种铲将平板菌种接至装有20～40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中捣碎，静置2～3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4～6d。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的灵芝预培养培养基通过以下方式配置得到：称取蔗糖35g、蛋白胨5g、酵母粉25g、KH₂PO₄·H₂O1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、VitaminB₁0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，4℃保藏。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的干燥包括：

①把发酵后的青稞基质放入风速2.5～4m/s、风温50～55℃的电热鼓风干燥装置中干燥3～4.5小时；

②把经过上述①处理的青稞基质放入微波炉干燥和杀菌装置中，微波干燥和杀菌装置的干燥功率为0.2～0.3W/g，频率为2450±50MHz，铺放厚度1.5～2.5cm，风速40～45m/min，干燥和杀菌的时间为20～30min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的乙醇提取包括以下步骤：

①粉碎后的青稞发酵基质用75％(v/v)乙醇，60℃水浴1h；

②去脂后的残渣加10倍量的清水浸泡1小时后，加热至微沸浸提，温度90～100℃，保持60～90min；

③渣滤进行第二次浸提；再过滤，滤渣进行第三次浸提；合并三次浸提液；

④减压浓缩，55℃旋转蒸发，滤液浓度相当于原浸提液1/3～1/5体积时，进入乙醇沉淀环节；

⑤在搅拌状态下，以流速为每min1/10水提物的体积下加入2倍量体积的95％以上(v/v)乙醇，并置于冷冻环境下过夜；

⑥采用8000转离心分离或静置2小时后过滤分离，所得滤渣即为提取的粗多糖。