发明内容
本发明的目的是提供一种灵芝孢子多糖的精制工艺。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
一种灵芝孢子多糖的精制工艺,该工艺包括以下步骤:
a、灵芝孢子除杂、破壁粉碎,脱脂;
b、温浸法水提取:取脱脂后的灵芝孢子药渣加10-20倍量水,70-90℃,提取1-3次,每次0.5-2.5小时,合并提取液,静置,过滤,滤液浓缩;
c、醇沉:用85-95%乙醇沉淀,至含醇量75-85%,静置,分离沉淀物,用85-100%乙醇洗,干燥,得粗多糖;
d、精制:取粗多糖加适量水溶解,调节pH至7.5-8.5,离心去除沉淀,上清液加H2O2脱色,sevag法脱蛋白,透析,加95%乙醇至含醇量为70-90%醇沉,沉淀依次用无水乙醇和丙酮洗涤2-3次,真空干燥,得灵芝孢子多糖精制品。
所述的灵芝孢子多糖的精制工艺,该工艺优选包括以下步骤:
a、灵芝孢子除杂、破壁粉碎,制粒,干燥,用CO2超临界萃取法提取灵芝孢子油进行脱脂:
b、温浸法水提取:取脱脂后的灵芝孢子药渣加10倍量水,90℃,提取3次,每次1.5小时,合并提取液,静置,过滤,浓缩;
c、醇沉:用95%乙醇沉淀,至含醇量80%,静置,分离沉淀物,用95%乙醇洗,干燥,得粗多糖;
d、精制:取粗多糖加适量水溶解,调节pH至7.8,离心去除沉淀,上清液加H2O2脱色,sevag法脱蛋白,透析,85%醇沉,沉淀依次用无水乙醇和丙酮洗涤3次,真空干燥,得灵芝孢子多糖精制品。
所述的灵芝孢子多糖的精制工艺,该工艺灵芝孢子脱脂的方法采用CO2超临界萃取法提取灵芝孢子油,其工艺参数是:萃取温度为35~65℃,萃取压力为20~35MPa,萃取时间为2~7小时,CO2流量0.5-1m3/h。
本发明有益效果:
本发明提供的精制工艺采用温浸法提取多糖,对多糖破坏较少,并采用H2O2脱色,sevag法脱蛋白,醇沉等工艺制备灵芝孢子多糖精制品,具有成本低、效果好的优点。
供试品说明:批号为20040101,20040102,20040103的供试品为按照实施例1制备的粗多糖(步骤a-c);批号为20040101p,20040102p,20040103p的供试品为按照实施例1制备的精制品多糖(步骤a-d)。
一、灵芝孢子多糖精制工艺研究
多糖精制的常规方法包括脱色素、除蛋白、醇沉、脱水干燥等步骤,操作比较繁琐。文献有报道采用金属络合物法、季铵盐沉淀法等沉淀法将多糖沉淀下来,色素和蛋白则留在溶剂中,这样可以省去脱色素和除蛋白步骤。但本品精制过程中采用这两种方法时均不能使灵芝孢子多糖沉淀。因此,仍采用常规方法精制多糖。
1 脱色素
1.1活性炭脱色法
取本品三批(批号:20040101,20040102,20040103)供试品各5g,加水150ml,煮沸5min,完全溶解,加0.2%活性炭脱色后,趁热抽滤,然后用50ml的热水洗涤滤渣,合并滤液。
1.2 H2O2脱色法
取本品三批供试品(批号:20040101,20040102,20040103)各10g,加水400ml,加热使完全溶解,加氨水调pH至7.8,有沉淀产生,继续滴加氨水至不再产生沉淀,此时溶液pH维持在7.8,4000rpm离心。取沉淀加0.2mol/L盐酸溶解(沉淀在水中能够溶解,尤其在酸中易于溶解),加考马斯亮蓝试剂显蓝色,证明为蛋白质;取上清液加30%H2O2 60ml(糖溶液体积的15%),于40℃保温4h,溶液由褐色转为淡黄色透明液,放冷至室温。
2 除蛋白
除蛋白方法比较了Sevag法和TCA(三氯醋酸)法。采用TCA法时没有蛋白沉淀析出。灵芝孢子多糖溶液以H2O2脱色前,用氨水调pH7.8已能除去绝大多数蛋白质,进一步除蛋白宜采用Sevag法。
Sevag法:取脱色素后的糖溶液,加入等体积的氯仿-正丁醇(4∶1)振摇,放置过夜,弃去下层凝胶样物质,取上层溶液同法处理,直至下层溶液不再出现凝胶样物质。将除完蛋白的糖溶液置透析袋中流水透析24h,蒸馏水透析过夜。将保留液(透析内液)浓缩至原体积的1/3,得浓缩后的糖溶液。
3醇沉、脱水干燥
取浓缩后的糖溶液,加入6倍体积的无水乙醇沉淀多糖,放置冰箱过夜,经4号砂芯漏斗过滤,沉淀依次用无水乙醇和丙酮洗涤3次,真空干燥,得白色灵芝孢子多糖精制品,称重,计算得率。
三批灵芝孢子多糖原料(批号:20040101,20040102,20040103)经活性炭脱色、Sevag法除蛋白、醇沉、脱水干燥得到淡黄色灵芝孢子多糖精制品,得率分别为39.67%,43.09%,46.10%。而以H2O2脱色、Sevag法除蛋白、醇沉、脱水干燥得到类白色灵芝孢子多糖精制品(批号:20040101p,20040102p,20040103p),得率分别为63.67%,59.09%,67.70%。
将同一批灵芝孢子多糖原料(批号:20040101)分别采用活性炭与H2O2脱色制得的多糖精制品,采用高效凝胶色谱法(高效液相色谱仪:HP1050,美国;色谱柱:ShodexOhpak SB-805 HQ,300mm×8mm,日本昭和电工;流动相:重蒸水;流速:0.6ml/min;蒸发光散射检测器(ELSD):SEDEX 75,法国;ELSD检测器漂移管温度:50℃;ELSD检测器压力:3.5bar;ELSD检测器gain值:7;色谱工作站:江申JS-3050型色谱工作站(带GPC软件);Dextran标准分子量多糖:Fluka公司。取制得的灵芝孢子多糖精制品加水溶解,制成5mg/ml溶液,高速离心后取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,取20μl注入色谱柱,记录色谱图)比较两种多糖精制品的色谱图,见图1,观察到二者组分基本一致,说明H2O2脱色不会破坏灵芝孢子多糖的结构。活性炭脱色首先过滤非常困难,其次脱色不完全,且多糖损失大。灵芝孢子多糖脱色素方法最终采用H2O2脱色法。
4蛋白质检查
4.1考马斯亮蓝法
取灵芝孢子多糖精制品各0.5g置10ml量瓶中,加水充分溶解,加水稀释至刻度,摇匀。滤纸过滤,取续滤液60μl;另取1mg/ml牛血清白蛋白30μl并加水30μl作为对照液,各加考马斯亮蓝试液3ml,分别混匀后室温放置15min,于595nm处比色测定。比较样品液与对照液的吸光度。三批精制品(批号:20040101p,20040102p,20040103p)中蛋白质的含量均不超过1%。结果见表1。
表1蛋白质检查结果
待测物 |
牛血清蛋白 |
20040101p |
20040102p |
20040103p |
浓度(μg/μl)取样量(μl)吸光度蛋白质(%) |
1.02300.445 |
49.92600.3580.82 |
50.01600.3700.85 |
50.23600.3720.85 |
4.2 UV法
取灵芝孢子多糖精制品适量,加水制成1mg/ml的溶液,于200~400nm进行紫外扫描,三批精制品(批号:20040101p,20040102p,20040103p)均未发现有核酸(260nm)及蛋白质(280nm)特征吸收峰。
二、药效学试验
(一)对照品灵芝孢子多糖对动物移植性肿瘤的抑制作用
1试验材料
1.1受试药物:对照品灵芝孢子多糖(简称1号),采用专利03131837.1公开的提取方法制备,具体步骤为:将灵芝孢子粉加入蒸馏水,加入量使灵芝孢子成形为准,混匀,制成颗粒,自然干燥,用CO2超临界萃取法去除其中的油脂类物质,称取脱脂灵芝孢子10Kg,装入提取罐中,加150Kg水,浸泡2小时,加热至沸,保持回流4小时,提取液离心,澄清过滤液浓缩至5Kg,加入3倍重量95%乙醇,静置24小时,使多糖沉淀,过滤,烘干,得灵芝孢子多糖。
1.2动物:ICR种小白鼠,18-22g,雌雄各半,由中国药科大学动物室提供。合格证号:SCXK(苏)2002-0011。饲料为颗粒饲料,由中国药科大学动物室供给。饲养条件:空调房间,温度18-24℃,相对湿度70%。
1.3阳性药:环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司。规格:200mg/瓶,批号:06060121。
2实验研究的主要内容
2.1 1号口服灌胃给药对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。
2.2 1号口服灌胃给药对小鼠移植瘤S180的抑制作用。
3实验方法和步骤
3.1 1号口服灌胃给药对小鼠移植瘤Heps的抑制作用
3.1.1给药途径:口服灌胃(ip)
3.1.2给药周期:按移植性肿瘤研究方法接种Heps实体型,接种24小时后给药,ip给药,隔天一次,共给药4次,停药后第2天处死解剖小鼠。
3.1.3剂量设置:共设4组,分别为:
空白对照组(生理盐水)
1号:160mg/kg
1号:40mg/kg
CTX:20mg/kg
3.1.4实验方法:取上述规格小鼠40只按移植性肿瘤研究方法接种Heps实体型,接种后24小时称鼠重,并随机分为4组,每组10只,雌雄各半,空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药,ip给药,每天一次,共给药7次,于停药后第2天小鼠称重,处死荷瘤小鼠并分离瘤块,称瘤重,所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.1.5实验结果:
结果见表2,结果表明,与空白对照组相比,1号(160mg/kg,40mg/kg)组可显著地抑制Heps的肿瘤生长作用(P<0.01,P<0.05)。
表2 1号ip对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n=10)
组别 |
剂量(mg/kg) |
体重(g) |
瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
给药前 |
给药后 |
对照组1号CTX | 1604030 |
20.2±1.4020.5±1.2720.6±1.4320.1±1.30 |
27.8±2.4423.0±2.24**23.89±1.27**24.3±2.41** |
1.61±0.511.02±0.30**1.28±0.350.43±0.15** | 36.5820.7764.60 |
*P<0.05 **P<0.01与空白对照组比较。
3.2 1号口服灌胃(ip)对小鼠移植瘤S180的抑制作用
3.2.1给药途径:口服灌胃(ip)
3.2.2给药周期:按移植性肿瘤研究法接种S180实体型,接种24小时后给药,ip给药,每天一次,共给药7次,停药后第2天处死解剖小鼠。
3.2.3剂量设置:共设4组,分别为:
空白对照组(生理盐水)
1号:160mg/kg
1号:40mg/kg
CTX 20mg/kg
3.2.4实验方法:取上述规格小鼠40只按移植性肿瘤研究法接种S180实体型,接种后24小时称鼠重,并随机分为4组,每组10只,雌雄各半,空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药,ip给药,每天一次,共给药7次,于停药后第2天小鼠称重,处死荷瘤小鼠并分离瘤块,称瘤重,所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.2.5实验结果:
结果见表3,结果表明,与空白对照组相比,1号(160mg/kg,40mg/kg)组均可显著地抑制S180的肿瘤生长作用(P<0.01,P<0.05)。
表3 1号ip对小鼠移植瘤S
180的抑制作用(X±SD)(n=10)
组别 |
剂量(mg/kg) |
体重(g) |
瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
给药前 |
给药后 |
对照组1号CTX | 1604030 |
20.1±1.3720.5±1.3520.6±0.9720.1±0.94 |
27.1±2.1324.1±1.90**26.0±1.7624.3±1.68** |
1.43±0.230.95±0.37**0.84±0.21*0.51±0.18** | 33.5521.4965.81 |
*P<0.05 **P<0.01与空白对照组比较
(二)本发明灵芝孢子多糖对动物移植性肿瘤的抑制作用
1试验材料
1.1受试药物:本发明灵芝孢子多糖(按实施例1制备,简称2号)。
1.2动物:ICR种小白鼠,18-22g,雌雄各半,由中国药科大学动物室提供。合格证号:SCXK(苏)2002-0011。饲料为颗粒饲料,由中国药科大学动物室供给;饲养条件:空调房间,温度18-24℃,相对湿度70%。
1.3阳性药:环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司。规格:200mg/瓶,批号:06060121。
2实验研究的主要内容
2.1 2号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。
2.2 2号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用。
3实验方法和步骤
3.1 2号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用
3.1.1给药途径:2号尾静脉注射(iv)
3.1.2给药周期:按移植性肿瘤研究法 接种Heps实体型,接种24小时后给药,iv给药,隔天一次,共给药4次,停药后第2天处死解剖小鼠。
3.1.3剂量设置:共设4组,分别为:
空白对照组(生理盐水)
2号:3mg/kg
2号:1m/kg
CTX:30mg/kg
3.1.4给药体积:0.4ml/20g
3.1.5实验方法:取上述规格小鼠40只按移植性肿瘤研究方法接种Heps实体型,接种后24小时称鼠重,并随机分为4组,每组10只,雌雄各半,空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药,iv给药,每天一次,共给药4次,于停药后第2天小鼠称重,处死荷瘤小鼠并分离瘤块,称瘤重,所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.1.5实验结果:
结果见表4,结果表明,与空白对照组相比,2号(3mg/kg,1mg/kg)组iv给药可显著地抑制Heps的肿瘤生长作用(P<0.01,P<0.05),同时对实验小鼠的体重有减低作用,但与阳性药CTX组相比,影响很小,且效果明显优于1号(160mg/kg,40mg/kg)ip给药。
表4 2号iv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n=10)
组别 |
剂量(mg/kg) |
体重(g) |
瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
给药前 |
给药后 |
对照组2号CTX | 3130 |
20.2±1.4020.1±1.2920.0±1.7620.1±1.30 |
27.8±2.4423.6±1.90**24.8±2.62*24.3±2.41** |
1.61±0.510.80±0.22**1.12±0.37*0.43±0.15** | 50.5030.4464.60 |
*P<0.05 **P<0.01与空白对照组比较
3.2 2号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用
3.2.1给药途径:尾静脉注射(iv)
3.2.2给药周期:按移植性肿瘤研究法接S180实体型,接种24小时后给药,iv给药,隔天一次,共给药4次,停药后第2天处死解剖小鼠。
3.2.3剂量设置:共设4组,分别为:
空白对照组(生理盐水)
2号:3mg/kg
2号:1mg/kg
CTX 30mg/kg
3.2.4给药体积:0.4ml/20g
3.2.5实验方法:取上述规格小鼠40只按移植性肿瘤研究法接种S180实体型,接种后24小时称鼠重,并随机分为4组,每组10只,雌雄各半,空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药,iv给药,隔天一次,共给药4次,于停药后第2天小鼠称重,处死荷瘤小鼠并分离瘤块,称瘤重,所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.2.6实验结果:
结果见表5,结果表明,与空白对照组相比,2号(3mg/kg,1mg/kg)组iv给药均可显著地抑制S180的肿瘤生长作用(P<0.01,P<0.05),同时对实验小鼠的体重有减低作用,但与阳性药CTX相比,影响很小,且效果明显优于1号(160mg/kg,40mg/kg)ip给药。
表5 2号iv对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n=10)
组别 |
剂量(mg/kg) |
体重(g) |
瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
给药前 |
给药后 |
对照组2号CTX | 3130 |
20.1±1.3720.9±1.6020.6±1.5820.1±0.94 |
27.1±2.1324.9±2.8125.4±1.7124.3±1.68** |
1.43±0.230.85±0.36**1.09±0.36*0.51±0.18** | 40.4823.8065.81 |
*P<0.05 **P<0.01与空白对照组比较。