CN101485694B - 一种灵芝三萜类成分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于灵芝孢子油主要经过活性碳脱色、乙醚脱脂、正丁醇萃取得到萜类粗品后，再采用无水乙醇和丙酮精制得到灵芝三萜类成分，所得灵芝三萜类成分中，灵芝三萜含量≥85％。本发明方法操作简便，生产成本降低，所得灵芝三萜类成分的提取率高，灵芝三萜含量也较高。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种灵芝三萜类成分的提取方法。
背景技术
灵芝又称为瑞草、灵芝草，我国对灵芝的研究至少有二千年以上历史。关于灵芝的药效，李时珍曰：“主治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，久服轻身不老，延年，疗虚劳，治痔”。近40年来，对灵芝进行了大量科研及临床应用工作，已确认的灵芝功效成份有灵芝多糖，其具有免疫调节的功能，灵芝酸有强烈的药理活性，有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝等作用。灵芝的药理作用主要有：①提高超氧歧化酶作用②抗血栓形成及提高红细胞变形能力③灵芝提高细胞合成DNA、RNA、蛋白质的能力④提高机体免疫力⑤灵芝护肝解毒作用⑥灵芝可提高机体耐缺氧能力、提高血液供氧能力、提高动静脉氧差和降低机体静止状态下的耗氧量⑦降低血液粘度，增加心肌收缩力，增加冠状动脉血流量和心血输出量，改善心律⑧抗肿瘤⑨抗放射线和有毒化学物质对机体的损害⑩镇静、镇痛作用灵芝无毒副作用。灵芝对人体有扶正固本的效果，有多方面的药理活性，从历代名医用药和近代医疗临床都可佐证，凡与血液循环不畅，机体虚弱、抗病力下降有关的疾病，灵芝对其皆有一定的治疗效果。
灵芝孢子为多孔菌科(Ployporaceae)灵芝Ganoderma Lucium(Ley S.ex Fr.)Karest的干燥孢子，为人工栽培的灵芝弹放孢子时收集，晒干。主要产地为福建、安徽、江苏、山东等。近年来破壁粉碎技术的发展，使得灵芝孢子(粉)作为灵芝的又一药用部位逐渐为人们所认识。灵芝孢子油以灵芝孢子粉为原料，经常温纯物理破壁技术进行破壁后，再以超临界CO2萃取技术提取出灵芝孢子粉中抗肿瘤精华，其主要成份是三萜类灵芝酸、不饱和脂肪酸、有机锗，灵芝孢子油中还有少量的灵芝多糖。灵芝孢子油的主要功效有：①双向调节人体免疫力。1)调节肿瘤病人T细胞亚群比例：T淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，它有T3、T4、T8等10多个亚型。灵芝可使疾病状态时机体T4细胞数量提高，T8细胞数量降低，T4/T8值升高。2)提高NK细胞活性及吞噬细胞、IL-2、肿瘤坏死因子等活性，提高淋巴细胞转化率。②抑制肿瘤细胞的生理活性，预防癌细胞的再生和转移③创造治疗机会，使只能保守治疗的患者能够有机会接受手术及放、化疗④减轻患者因放、化疗引起的毒副作用，尤其是白细胞减少症。提高患者对放、化疗的耐受性；降低患者手术、放、化疗后的转移、复发率。1)降低肿瘤病人丙二醛(MDA)水平丙二醛(MDA)是脂质过氧化物的分解产物。丙二醛的量能反映体能自由基的量，自由基对机体可造成巨大的伤害。放化疗可使体内丙二醛增高，灵芝孢子油可降低丙二醛水平，从而降低丙二醛对肿瘤病人的伤害。2)提高肿瘤患者对放化疗的耐受性，减轻放化疗引起的食欲不振、呕吐、体重减轻、白细胞减少、贫血、抗感染能力降低等严重不良反应以及肝、肾、心功能的损害。3)放、化疗是肿瘤治疗的重要手段，放化疗能将肿瘤细胞迅速杀死，但同时也会伤及体内正常细胞，包括免疫系统，对机体造成巨大伤害，造成机体免疫功能低下，对肿瘤细胞的繁殖能毫无防御能力。而经放化疗受伤的肿瘤细胞复活很快，此时肿瘤细胞不受抑制而迅速繁殖，病人病情可很快恶化，甚至死亡。灵芝孢子油有提高机体抗放、化疗伤害能力，降低肿瘤患者因放、化疗引起的免疫抑制作用，防止肿瘤“死灰复燃”。
目前灵芝三萜的提取方法主要有大孔吸附树脂法及色谱柱制备法两种，由于灵芝孢子油中含有大量的油脂类成分，粘度较大，该两种方法均不适宜大规模生产。而且，油脂对树脂、色谱柱均有较大影响，流速低，对树脂及色谱填充物损伤大，生产成本极为高昂。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种灵芝三萜类成分的提取方法。
本发明的目的是通过以下方式实施的：
一种灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于灵芝孢子油主要经过活性碳脱色、乙醚脱脂、正丁醇萃取得到萜类粗品后，再采用无水乙醇和丙酮精制得到灵芝三萜类成分。
上述灵芝三萜类成分的提取方法具体包括如下步骤：取灵芝孢子油，向灵芝孢子油中加入活性碳，振荡搅拌25～35分钟后抽滤，得油；向油中加入乙醚，振荡萃取，静置分层后去除乙醚液，连续2～4次；向经过乙醚萃取后得到的油中加入正丁醇，振荡萃取，静置分层后取正丁醇溶液，连续操作5～7次，合并正丁醇溶液，将合并后的正丁醇溶液用少许重蒸水清洗萃取，并弃去水液；将正丁醇溶液蒸干，得浅黄色粉末，即为萜类粗品；向经过萃取后得到的萜类粗品中加入萜类粗品重量的2～4倍量无水乙醇，振荡溶解后，再加入无水乙醇5～7倍体积量丙酮，4℃密闭静置过夜，沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗2～4次，60～80℃恒温干燥3～5hr，得到类白色针类结晶，即为灵芝三萜类成分。
上述采用的灵芝孢子油可按照专利号99123952.0专利方法制备得到。
上述灵芝三萜类成分的提取方法主要是经过脱色、脱脂、萃取和精制四个阶段提取得到灵芝三萜类成分；首先向灵芝孢子油中加入活性碳脱色，采用一定量的乙醚进行脱脂后又通过一定量的正丁醇进行萃取得到萜类粗品，最后通过一定量的无水乙醇和丙酮进行精制后，得到灵芝三萜类成分。特别是无水乙醇和丙酮的量严格控制精制的效果。
采用本方法从灵芝孢子油中得到灵芝三萜类成分的提取率达3％以上，灵芝三萜类成分中，灵芝三萜含量≥85％。
本发明方法具体优选如下步骤：
一种灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于取灵芝孢子油，向灵芝孢子油中加入粉末状活性碳，振荡搅拌30分钟后抽滤，得油；向油中加入乙醚，振荡萃取5分钟，静置分层后去除乙醚液，连续3次；向经过乙醚萃取后得到的油中加入正丁醇，振荡萃取，静置分层后取正丁醇溶液，连续操作6次，合并正丁醇溶液，将合并后的正丁醇溶液用少许重蒸水清洗萃取，并弃去水液；将正丁醇溶液蒸干，得浅黄色粉末，即为萜类粗品；向经过萃取后得到的萜类粗品中加入萜类粗品重量的3倍量无水乙醇，振荡溶解后，再加入无水乙醇6倍体积量丙酮，4℃密闭静置过夜，可见少许沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗3次，70℃恒温干燥4hr，得到类白色针类结晶，即为灵芝三萜类成分。
目前还无市售灵芝孢子油原料，本发明所用灵芝孢子油按照专利号99123952.0方法制备得到。
本发明所用试剂为常规分析纯试剂，灵芝三萜含量采用HPLC高效液相色谱法检测。灵芝三萜的含量测定方法：Agilent 1100高效液相色谱仪，四元泵，二极管阵检测器，真空脱气机，柱温箱，自动进样器，Agilent化学工作站。色谱条件：C18柱，流动相 乙腈∶磷酸(40∶60)，流速0.8ml/min，检测波长234nm，进样量10μl。灵芝三萜对照品购自Sigma公司，含量＞99％，溶解溶剂(甲醇∶乙酸乙酯＝50∶50)。
本发明与现有技术比较有益效果：采用本方法从灵芝孢子油中得到灵芝三萜类成分的提取率达3％以上，其中，灵芝三萜成分中灵芝三萜含量≥85％，本发明方法操作简便，生产成本降低，灵芝孢子油中灵芝三萜类成分的提取率高，灵芝三萜纯度也较高。
附图说明
图1为按本发明实施例1方法提取的样品的HPLC高效液相色谱图。
图2为灵芝三萜对照品HPLC高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过试验例进一步阐述本发明方法得到的灵芝三萜类成分的有益效果。
1、试验材料
试验动物：昆明种小鼠和NIH小鼠，日龄40～50d(体重18～22g)，雌雄各半；
试验药物：灵芝三萜精制品(按实施例1方法制备得到)；阳性对照品选用环磷酰胺。
试验瘤株：小鼠肝癌腹水型(H22)和小鼠S180肉瘤(S180)
试验剂量：
将灵芝三萜精制品设置为高中低三个剂量，分别按人体临床口服用药200mg/人.日，40mg/人.日，8mg/人.日计算，动物实验按人体给药量的10倍给药。给药方式采用灌胃方式，给药体积为20ml/kg体重。
样品处理：
精密称取灵芝三萜精制品，加入少许重蒸水，经振荡超声制备成乳化液，再加重蒸水配制成相应的给药浓度。
2、方法与结果
对动物移植性肿瘤的抑制作用
(1)对子鼠S180肉瘤和肝癌H22实体瘤的影响
在灭菌条件下，分别取传代小鼠S180肉瘤和肝癌H22实体瘤瘤液以生理盐水1∶4稀释，每只0.2ml溶入小鼠右腋皮下，24h分组给药，按高中低剂量给小鼠灌胃(ig)灵芝三萜精制品，每天一次，连续10d；阳性对照组腹腔注射(ip)环磷酰胺15mg/kg，同时ig蒸馏水；对照组ig蒸馏水，末次给药后，次日处死小鼠，剥离瘤块称重，计算平均抑瘤率，用t值分析。结果如表1：
表1 灵芝三萜精制品对小鼠抑瘤率实验结果
由上表可以看出，灵芝三萜有较强的抑制肿瘤功效，且可看出相应量效比。
(2)对腹水型小鼠H22和S180肉瘤生存时间的影响
取小鼠H22和S180瘤液，同上法给小鼠注射，次日分组给药，分组和给药方案同上，停药后每天观察小鼠一次，记录死亡时间，以各鼠生存天数计算每组平均生存时间，给药组与对照组比较，结果如表2：
表2 灵芝三萜精制品对荷瘤小鼠生存时间统计结果
| 瘤株 | 组别 | 平均生存时间(d) |
| S180 | 对照组(水) | 4.4±1.6 |
| 环磷酰胺 | 24.2±0.9 | |
| 低剂量 | 25.3±1.7 | |
| 中剂量 | 29.5±3.7 | |
| ±高剂量 | 35.3±5.9 | |
| H22 | 对照组(水) | 14.3±1.2 |
| 环磷酰胺 | 25.1±1.7 | |
| 低剂量 | 22.9±1.9 | |
| 中剂量 | 27.9±2.7 | |
| 高剂量 | 36.2±3.4 |
3、结论
本发明灵芝三萜精制品具有很强的抑制肿瘤功效，并能延长荷瘤小鼠生存时间，具有较好药效，非常具有开发价值。
具体实施方式：
实施例1
精选灵芝孢子粉(破壁率95％)加入水，加入水量使所述灵芝孢子粉能粘结成型为准，用挤条机挤出，干燥后称取100KG，装入萃取器，控制压力26MPa，温度50℃，连续萃取30小时，分离得到灵芝孢子油15.8KG(具体按照专利号99123952.0专利实施例1制备)。取灵芝孢子油100g，加入约0.5g分析纯粉末状活性碳，振荡搅拌约30分钟，抽滤，去除油中的色素类杂质，得油95.6g。加入300ml分析纯乙醚，萃取振荡5分钟，静置分层后去除乙醚液，连续3次，脱去其中大部分油脂类成分，得样品12.5g。加入分析纯正丁醇30ml，振荡萃取，静置分层后取正丁醇溶液，连续操作6次，合并正丁醇溶液。将合并后的正丁醇溶液用少许重蒸水清洗萃取一次。并弃去水液。将正丁醇溶液水浴减压蒸干，得浅黄色粉末，即为萜类粗品，计6.2g，经检测，三萜含量为58.3％。将萜类粗品6.0g重量的3倍量加无水乙醇，振荡溶解，加入无水乙醇6倍体积量分析纯丙酮，4℃密闭静置过夜，可见少许沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗3次，70℃恒温干燥4hr，得到类白色针类结晶，共计3.1g。经检测，其三萜含量为85.3％。
实施例2
精选灵芝孢子粉(破壁率95％)加入水，加入水量使所述灵芝孢子粉能粘结成型为准，用挤条机挤出，干燥后称取100KG，装入萃取器，控制压力26MPa，温度50℃，连续萃取30小时，分离得到灵芝孢子油15.8KG(具体按照专利号99123952.0专利实施例1制备)。取灵芝孢子油100g加入约0.5g分析纯粉末状活性碳，振荡搅拌约35分钟，抽滤，去除油中的色素类杂质，得油96.1g。加入300ml分析纯乙醚，萃取振荡5分钟，静置分层后去除乙醚液，连续4次，脱去其中大部分油脂类成分，得样品12.8g。加入分析纯正丁醇30ml，振荡萃取，静置分层后取正丁醇溶液，连续操作7次，合并正丁醇溶液。将合并后的正丁醇溶液用少许重蒸水清洗萃取一次。并弃去水液。将正丁醇溶液水浴减压蒸干，得浅黄色粉末，即为萜类粗品，计6.7g，经检测，三萜含量为58.6％。将萜类粗品6.2g 4倍量加无水乙醇，振荡溶解，加入乙醇7倍体积量分析纯丙酮，4℃密闭静置过夜，可见少许沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗2次，80℃恒温干燥3hr，得到类白色针类结晶，共计3.3g。经检测，其三萜含量为86.0％。
Claims (3)
1.一种灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于灵芝孢子油主要经过活性碳脱色、乙醚脱脂、正丁醇萃取得到萜类粗品后，再采用无水乙醇和丙酮精制得到灵芝三萜类成分；其中，所述的精制是向经过萃取后得到的萜类粗品中加入萜类粗品重量的2～4倍量无水乙醇，振荡溶解后，再加入无水乙醇5～7倍体积量丙酮，4℃密闭静置过夜，沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗2～4次，60～80℃恒温干燥3～5hr，得到类白色针类结晶，即为灵芝三萜类成分。
2.根据权利要求1所述的灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于具体包括如下步骤：取灵芝孢子油，向灵芝孢子油中加入活性碳，振荡搅拌25～35分钟后抽滤，得油；向油中加入乙醚，振荡萃取，静置分层后去除乙醚液，连续2～4次；向经过乙醚萃取后得到的油中加入正丁醇，振荡萃取，静置分层后取正丁醇溶液，连续操作5～7次，合并正丁醇溶液，将合并后的正丁醇溶液用少许重蒸水清洗萃取，并弃去水液；将正丁醇溶液蒸干，得浅黄色粉末，即为萜类粗品；向经过萃取后得到的萜类粗品中加入萜类粗品重量的2～4倍量无水乙醇，振荡溶解后，再加入无水乙醇5～7倍体积量丙酮，4℃密闭静置过夜，沉淀析出，过滤，取沉淀，用重蒸水冲洗2～4次，60～80℃恒温干燥3～5hr，得到类白色针类结晶，即为灵芝三萜类成分。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝三萜类成分的提取方法，其特征在于从灵芝孢子油中得到灵芝三萜类成分的提取率达3％以上，灵芝三萜类成分中，灵芝三萜含量≥85％。
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