CN105125620A - 一种云实提取物，该提取物的制备方法及医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种云实提取物，该提取物的制备方法及医药用途，提取物制备方法包括：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的云实80～90份和甘草10～20份，混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。该提取物具有抗脑衰老的作用，可以开发成治疗抗脑衰老的药物。

Description

一种云实提取物，该提取物的制备方法及医药用途
技术领域
本发明涉及中药提取物领域，具体涉及一种云实提取物，该提取物的制备方法及医药用途，该提取物可以用于抗脑衰老。
背景技术
药材云实为豆科云实属植物云实的种子，又名员实、天豆(《吴普本草》)、马豆(《本草图经》)、朝天子(《天目山药用植物志》)。
原植物云实(学名Caesalpiniadecapetala)，又名药王子、牛网刺、阎王刺。豆科苏木属，生于我国南部山区，平原地带常栽培做绿篱，生长于平原、丘陵地、山谷及河边等；分布于长江流域以南各省区。根圆柱形，弯曲，有分枝，长短不等，直径2-6cm，根头膨大，外皮灰褐色，粗糙，具横向皮孔，纵皱纹明显。质坚，不易折断，断面皮部棕黄色，木部白色，占绝大部分。气微，味辛、涩、微苦。根皮呈卷筒状、槽状或不规则碎片状，长短厚薄不一，外表面灰褐色，粗糙，具疣状突起及灰黄色横向皮孔，常有内陷环纹；内表面浅褐色，略平坦，具细纵纹。质硬而脆，易折断，断面颗粒性，平整切面可见由石细胞群形成的斑纹。气微，味微涩。嚼之有砂粒感。以条大、皮厚者为佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云实提取物，其制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备治疗抗脑衰老的药物的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种云实提取物，该提取物由以下方法制备：
(a)以重量计，每100份药材包含干燥的云实80～90份和甘草10～20份，混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。
进一步地，步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差异，所述提取物的液相分析方法为：
色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0～5min，A10％→15％；5～15min，A15％→50％；15～23min，A50％→80％；23～25min，A80％→10％；25～30min，A10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
药物制剂，含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。
所述的提取物在制备治疗抗脑衰老的药物中的应用。
所述的药物制剂在制备治疗抗脑衰老的药物中的应用。
本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
所述药物制剂含有治疗有效量的本发明云实提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
本发明的优点：本发明通过对干燥的云实进行提取、除杂、富集处理，能得到具有抗脑衰老功能的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同批次制备的提取物的批间差异。
附图说明
图1为云实提取物HPLC液相图谱。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：提取物制备(云实85份，甘草15份)
药材来源：云实和甘草干燥根茎购自安徽亳州中药材市场。
主要试剂：食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；85％磷酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。
制备方法：将8.5kg干燥的云实和1.5kg的甘草干燥根茎混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物212g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积(18L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积(15L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得云实提取物约120g。
实施例2：提取物制备(云实80份，甘草20份)
制备方法：将8kg干燥的云实和2kg的甘草干燥根茎混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物212g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积(18L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积(15L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得云实提取物约120g。
实施例3：提取物制备(云实90份，甘草10份)
制备方法：将9kg干燥的云实和1kg的甘草干燥根茎混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物212g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积(18L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积(15L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得云实提取物约120g。
实施例4：提取物制备(云实75份，甘草25份)
制备方法：将7.5kg干燥的云实和2.5kg的甘草干燥根茎混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物212g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积(18L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积(15L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得云实提取物约120g。
实施例5：提取物制备(云实95份，甘草5份)
制备方法：将9.5kg干燥的云实和0.5kg的甘草干燥根茎混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物212g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积(18L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积(15L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得云实提取物约120g。
实施例6：液相色谱分析
供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL10％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加10％乙腈水溶液定容。
分析方法：
高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；
色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0～5min，A10％→15％；5～15min，A15％→50％；15～23min，A50％→80％；23～25min，A80％→10％；25～30min，A10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
用制备的10批次的云实提取物进行分析，进行色谱峰匹配，结果1～7号峰在10批样品色谱图中均出现，且均与周围色谱峰达到基线分离。因此标定7个峰为共有色谱峰，据此建立该提取物的HPLC质量控制图谱，结果见图1。
实施例7：提取物药理试验
一、材料与方法
1.1药品与试剂：云实提取物①～⑤分别按照实施例1～5制备，用蒸馏水配成实验浓度，置于4℃备用；SOD试剂盒由南京建成生物制品研究所提供；D-半乳糖由上海试剂二厂提供。
1.2实验动物：昆明种小鼠，体重(20±2)g，由安徽省医学检验所提供。
1.3实验方法：小鼠70只，雌雄各半，体重(20±2)g，将小鼠随机分为7组，每组10只，即正常对照组、D-半乳糖衰老模型组，云实提取物①～⑤组。除正常对照组外，其他六组动物均每日颈背皮下注射5％D-半乳糖0.5mL，正常组小鼠则颈背皮下注射生理盐水0.5mL。于注射D-半乳糖的第10d，云实提取物①～⑤组动物分别灌胃给予云实提取物①～⑤200mg·kg-1，正常对照组小鼠和衰老模型组动物则每日灌胃等体积生理盐水。连续用药30d。于最后一天灌胃和注射D-半乳糖2h后，眼眶取血，肝素抗凝(4℃保存)用于血清中过氧化脂质(LPO)含量的测定，然后断头处死动物，取出脑组织制成匀浆用于过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的含量测定。
二、结果
2.1云实提取物对脑衰老小鼠血清内CAT活性的影响-紫外分光光度法
表1显示，在D-半乳糖的作用下，模型组动物脑组织中的CAT活性显著下降，与正常对照组相比，差异十分显著。而灌胃云实提取物组①～③的小鼠血液中CAT活性明显上升(P<0.05)，高于模型组；但灌喂云实提取物组④～⑤的小鼠血液中的CAT活性无明显提高，说明云实提取物①～③可能对CAT活性有保护作用。
注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。
表1云实提取物对小鼠血清内CAT活性的影响(X±SD)
组别 剂量/(mg/kg) 蛋白含量/mg·mL-1 CAT(k/gHb)
正常对照组 - 0.750 80.19±23.77
模型组 - 0.717 73.14±21.35
提取物① 200 0.701 90.83±8.16*
提取物② 200 0.697 88.79±8.27*
提取物③ 200 0.700 89.75±8.13*
提取物④ 200 0.688 75.20±9.36
提取物⑤ 200 0.691 76.43±8.91
2.2云实提取物对脑衰老小鼠脑组织内LPO的影响-组织匀浆MDA比色法
表2显示，连续皮下注射5％半乳糖水溶液，小鼠脑组织中的LPO含量明显高于正常对照组，说明D-半乳糖可使细胞膜发生脂质过氧化作用，而云实提取物①～③可使小鼠脑组织中的LPO含量下降，与模型组比较差异明显(P<0.05)，提示它有抑制脂质过氧化的作用，而云实提取物④～⑤则对小鼠脑组织中的LPO含量无明显影响。
注：与模型组比较*P<0.05。
表2云实提取物对小鼠脑组织内LPO的影响(X±SD)
组别 剂量/(mg/kg) 动物数(只) MDA(nmoL/mgprot)
正常对照组 - 10 1.073±0.337
模型组 - 10 1.131±0.175
提取物① 200 10 1.032±0.124*
提取物② 200 10 1.037±0.128*
提取物③ 200 10 1.035±0.120*
提取物④ 200 10 1.127±0.133
提取物⑤ 200 10 1.125±0.125
2.3云实提取物对脑衰老小鼠脑组织内SOD活性的影响-光还原NBT法
表3显示，灌喂云实提取物①～③的小鼠脑组织内SOD活性与模型组比较显著提高(P<0.01)；而灌喂云实提取物④～⑤的小鼠脑组织内SOD活性无明显变化。提示云实提取物①～③对衰老小鼠脑组织中的SOD活性有明显的增强作用。
表3云实提取物对小鼠脑组织内SOD活性影响(X±SD)
组别 剂量/(mg/kg) 动物数(只) SOD活力(μ/mgprot)
正常对照组 - 10 5.393±1.444
模型组 - 10 3.504±1.473
提取物① 200 10 6.252±1.366**
提取物② 200 10 6.247±1.351**
提取物③ 200 10 6.244±1.372**
提取物④ 200 10 3.741±1.397
提取物⑤ 200 10 3.726±1.401
上述实验结果表明，云实提取物具有一定的抗脑衰老的作用。本发明中甘草的含量对云实提取物的抗脑衰老作用至关重要。
实施例8：片剂的制备
按实施例1方法制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例9：口服液的制备
按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。
实施例10：胶囊剂或颗粒剂的制备
按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例11：注射液的制备
按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例12：无菌粉针的制备
按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (6)

1.一种云实提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的云实80～90份和甘草10～20份，混合粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗12个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：
色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0～5min，A10％→15％；5～15min，A15％→50％；15～23min，A50％→80％；23～25min，A80％→10％；25～30min，A10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
4.药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受的载体。
5.权利要求1所述的提取物在制备治疗抗脑衰老的药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物制剂在制备治疗抗脑衰老的药物中的应用。
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