CN105193887A - 一种刺五加提取物及其抗氧化用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种刺五加提取物及其抗氧化用途，属于中药领域，具体涉及一种刺五加提取物及含有该提取物的药物制剂，该刺五加提取物可以用来制备抗氧化的药物。本发明通过对刺五加药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增强细胞膜通透性，具有抗氧化的作用。本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异性。

Description

一种刺五加提取物及其抗氧化用途

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种刺五加提取物及含有该提取物的药物制剂，该刺五加提取物可以用来制备抗氧化的药物。

背景技术

刺五加Acanthopanaxsenticosu(Rupr.EtMaxim)Harms的干燥根及根茎入药，其茎、叶也可药用。刺五加与人参同属于五加科植物，是一种落叶植物，因小枝密生针刺而得名。主产于中国东北部(黑龙江、吉林、辽宁、河北)、俄罗斯远东地区及日本北海道等地，刺五加是我国东北地区典型的药用植物，味辛、微苦、性温、无毒。刺五加具有益气健脾、补肾安神、益精壮骨之功效。本草纲目称刺五加为“本经上品”，能“补中益气，坚筋骨强意志，久服轻身耐老”。民间有“宁得一把五加，不用金玉满车”的说法。以刺五加为原料的中成药种类繁多，如刺五加片、刺五加注射液、安神补脑胶囊、脑安片等；另外中医处方对刺五加需求量也较大，刺五加全国年需求量500万公斤以上，使刺五加的市场供应日趋紧张。

刺五加化学成分复杂，根和根茎的主要成分为酚苷类化合物，实验证明刺五加总苷是其生物活性成分之一。已分离出七种刺五加苷(A、B、C、D、E、F、G)含量比例8:30:10:12:4:2:l，分别为胡萝卜苷(A)，紫丁香酚苷(B)，乙基半乳糖普(C)，紫丁香树脂酚二糖苷(D)，此外还有E、F和G，以及L。近些年对刺五加茎叶的研究不断深入，从叶中分离得到齐墩果酸为配基的五加叶苷I、K、L和M等。

现代药理研究表明刺五加可增强机体非特异性防御能力，除具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗损伤及抗疲劳作用外，还可治疗心脑血管疾病、糖尿病、神经衰弱等症。近年来，经过对刺五加生理活性和化学成分方面的研究，表明刺五加有效成分为苷类，其中刺五加苷B、E是主要有效成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺五加提取物，该提取物的制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备抗氧化药物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种刺五加提取物，该提取物由以下方法制备：

步骤一：将刺五加干燥根及根茎粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；

步骤二：用75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；

步骤三：对步骤二浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤四：正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用65％乙醇洗脱6个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

进一步地，步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105℃蒸制2小时。

为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同产地、批次药材制备的刺五加提取物批间差异，所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.5)；

梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

药物制剂，含有治疗有效量的所述刺五加提取物和药学上可接受的载体。

所述的刺五加提取物在制备抗氧化的药物中的应用。

所述的药物制剂在制备抗氧化的药物中的应用。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明刺五加提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明的优点：本发明通过对刺五加药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增强细胞膜通透性，具有抗氧化的作用；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异。

附图说明

图1为刺五加提取物的HPLC液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：刺五加提取物制备

主要试剂和材料：刺五加药材购自安徽亳州中药材市场；食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；85％磷酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。

方法：取刺五加药材5kg粉碎，用纱布包裹，置于高压灭菌锅中蒸制2小时，温度105℃，取出置烘干箱中烘干；烘干药材用75％乙醇热回流提取三次，每次提取2小时，每次用75％乙醇15L，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)；浓缩液依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积出去多糖，再用65％乙醇洗脱6个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(545g)。

实施例2：液相色谱分析

供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50ml棕色容量瓶中，加30ml20％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加20％乙腈水溶液定容。

分析方法：

高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；

色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.5)；

梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

对用10批不同产地、批次当归制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹配，结果1～9号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定9个峰为共有指纹峰，据此建立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。

实施例3：刺五加提取物药理试验

一、材料与方法

1.1试剂及仪器

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)含量测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

紫外可见分光光度计(752C型，上海第三分析仪器厂)；匀浆机，Glas-Col，USA；低温高速离心机(HettichZentrifugen，Universal16R，德国)。

1.2受试物：刺五加提取物，自制，制备方法见实施例1。

1.3动物及处理：

清洁级雄性10月龄老年昆明种小鼠40只，由中山大学实验动物中心提供，体重47±3g，喂养7d以适应环境，禁食12h，后眼眶静脉丛采血，按血清中MDA水平和体重随机分成4组：对照组和刺五加提取物10g/L、30g/L、50g/L组，每组10只，均饲以普通啮齿类动物饲料，自由摄食饮水，记录每日进食量，每周称体重1次。各组按0.2ml/(10gbw·d)分别灌胃给予生理盐水及10g/L、30g/L、50g/L刺五加提取物水溶液。6w后结束实验，禁食12h，摘除眼球取血分离血清；颈椎脱臼法处死动物，快速分离肝脏和脑组织；硫化钠脱去被毛，剪取背部皮肤。所有样品均在－20℃冻存备用。

1.4检测指标及方法

1.4.1皮肤Hyp含量测定

二甲氨基苯甲醛比色法。取冻存的背部皮肤组织，用预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其它结缔组织，滤纸拭干，称重，用剪刀剪碎，按1:9(w/v)加入预冷生理盐水制得10％组织匀浆，3500g离心10min，分离上清，用于Hyp测定。Bradford法测定蛋白浓度。

1.4.2肝脏和脑组织MAO-B活性测定

取冻存组织用预冷的生理盐水漂洗，制得10％组织匀浆后测定MAO-B活性，Bradford法测定上清液蛋白。

1.4.3血清抗氧化酶活性和MDA含量测定

SOD活性用黄嘌呤氧化酶法、GSH-Px活性用DTNB法，MDA用硫代巴比妥酸比色法。

1.5统计分析

采用SPSS10.0软件包，多组均数进行方差齐性检验和单因素方差分析(ANOVA)，各组间差异比较采用LSD法。

二、结果

2.1一般情况

6w喂养后，各组间体重和进食量均无显著性差异，说明给予刺五加提取物没有影响进食。

2.2血清抗氧化酶活性及MDA含量(表1)

刺五加提取物50g/L组血清SOD活性显著增高，而MDA含量显著低于对照组，刺五加提取物10g/L、30g/L组显示相似的变化趋势，但差异无统计学意义。各组间血清GSH-Px活性无显著性差异。

表1刺五加提取物对老年小鼠血清中抗氧化酶活性及MDA含量的影响(x±s)

刺五加提取物(g/L)	MDA(nmmoL/mL)	SOD(U/mL)	GSH-Px(U/mL·min)
				0	7.68±1.70	161.10±21.50	402.80±107.88
10	7.24±0.61	173.79±37.63	412.60±70.26
				30	6.20±1.61	175.83±34.10	454.86±70.57

50

5.13±0.90*

185.40±28.74a

495.28±70.71

与正常对照组比较^aP<0.05。

2.3肝、脑组织中MAO-B活性和皮肤Hyp含量

由表2可见，刺五加提取物50g/L可显著降低老龄小鼠脑组织MAO-B活性，刺五加提取物10，30g/L作用不明显。刺五加提取物对肝脏MAO-B活性影响不明显。

表2刺五加提取物对老年小鼠肝、脑组织中MAO-B活性和皮肤Hyp含量影响(x±s)

与正常对照组比较^aP<0.05。

Hyp含量可反应胶原蛋白的合成情况，对维持皮肤弹性有重要作用。而摄入刺五加提取物50g/L6w后，老龄小鼠皮肤中Hyp含量较对照组明显增加，接近2倍(1.04±0.17vs0.58±0.14)。

本实验结果表明，50g/L刺五加提取物可增加老龄小鼠血清SOD活性，同时减少MDA的生成，提示具有抗氧化生物活性。根据Harman的衰老自由基理论，氧化应激是促进机体衰老的重要因素。MAO-B是催化单胺类神经递质氧化脱氨基，同时生成H₂O₂的一种黄素酶。研究表明：MAO-B催化生成的H₂O₂是脑内氧化应激的一个特异性来源。随着年龄的增长，体内MAO-B活性逐渐增强，继而氧自由基生成增多，促进神经系统老化。本研究中50g/L刺五加提取物可降低脑中MAO-B活性，而不影响肝脏中该酶活性，提示刺五加提取物可以特异性的作用于脑组织MAO-B，对抑制神经系统内氧化应激有一定作用。皮肤中Hyp含量反映皮肤中胶原蛋白的生成情况，是衰老过程中敏感和特殊的生化指标。本实验观察到摄入刺五加提取物的老龄小鼠皮肤Hyp含量明显增加，提示刺五加提取物可能有助于增加皮肤胶原蛋白合成，改善皮肤弹性。上述实验结果均提示刺五加提取物具有抗氧化延缓衰老的作用。

实施例4：片剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例5：口服液的制备

按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例6：胶囊剂或颗粒剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例7：注射液的制备

按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例8：无菌粉针的制备

按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims (6)

1.一种刺五加提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：

步骤一：将刺五加干燥根及根茎粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；

步骤二：用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；

步骤三：对步骤二浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤四：正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10%乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用65%乙醇洗脱6个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105℃蒸制2小时。

3.根据权利要求1所述的刺五加提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：DiamonsilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；

流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6.5）；

梯度洗脱程序：0.01~70min，A20%→80%；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

4.药物制剂，其特征在于：所述制剂含有治疗有效量的权利要求1所述的刺五加提取物和药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的刺五加提取物在制备抗氧化的药物中的应用。

6.如权利要求4所述的药物制剂在制备抗氧化的药物中的应用。