CN111317752A - 一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途，治疗或预防流感病毒感染的药物为云实提取物并制备出药学上可接受的药物剂型。本发明提供的云实提取物可以抑制不同株型的流感病毒，如H1N1、H3N2、H7N8、奥司他韦耐药株H1N1和乙型流感病毒株IBV等，具有非常广谱的抗流感病毒活性。云实提取物对奥司他韦耐药株仍然具有同样的抑制作用。

Description

一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科的单负链RNA病毒，它传染速度快、变异力强，可引起人、禽、猪、蝙蝠等多种动物感染和发病。流感患者典型的临床症状是急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。流感病毒主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。人流感主要由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起。流感病毒严重威胁着人类健康，然而目前临床上并没有一种可以治愈所有流感患者的药物，鉴于不断突变的流感病毒株的出现，研发新型抗流感病毒药物迫在眉睫。

现有技术存在的问题及缺陷：对于流感病毒，目前有疫苗接种和药物治疗两种方法。接种疫苗是主要的预防措施，但它仅限于已知的流行毒株。由于流感病毒容易发生突变，无法抑制不断变化的病毒是流感病毒疫苗的主要问题。其次，疫苗生产周期长，需要长达六个月的时间，也大大限制了疫苗对病人预防的有效时间。除了疫苗之外，目前经FDA批准的抗流感药物如M2离子通道抑制剂和NA抑制剂等也存在种种问题。M2离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺已经有数十年的历史，由于副作用强且普遍存在的耐药株，目前已不推荐用来治疗流感病毒。NA抑制剂有奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦三种，其中奥司他韦在临床上被广泛应用。然而，它们对流感病毒的治疗具有窗口期，不应晚于感染初始症状出现后48小时。对于晚期和重症患者，临床上并没有明显的改善效果。最近批准的抗流感新药巴洛沙韦可以抑制流感病毒的RNA聚合酶。然而，与成人治疗结果相比，巴洛沙韦在临床上对包括儿童、青少年和老年人在内的易感人群的治疗效果较弱，不能缩短病程。目前仅有的几种抗流感药物的缺陷是只针对病毒靶标，容易产生耐药性。其次是用药有效窗口仅限于发病早期。现有药物的这两个缺陷不能满足流感临床治疗等需要，寻找不易耐药且广谱的抗流感病毒药物迫在眉睫。

云实的背景：植物是天然的化合物库，富含多种成分，通过植物治疗人类疾病具有悠久的历史。其中，最著名的药物之一青蒿素最初就是从青蒿中提取的，现在已在世界范围内用于治疗疟疾。云实属于豆科云实属，拉丁文全称是Caesalpinia decapetala(Roth)Alston，别名百鸟不停、老虎刺尖、到钩刺、黄牛刺、马豆、牛王刺、药王子，广泛分布在世界各地。云实包含多种成分如卡山烷型二萜、羽扇豆醇、查尔酮、牡荆素、胡萝卜苷、豆甾醇和β-谷甾醇等。已有报道云实提取物有阵痛、抗氧化、抗肿瘤等作用。尽管科研工作者对云实进行了一些分析，但主要集中在化学成分方面，近代药理药效分析并不多见，其有效成分，有效部位以及作用机理尚不明确。到目前为止并未发现任何关于云实抗流感病毒的相关报道。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)现有抗流感药物只针对病毒靶标，容易产生耐药性。

(2)其次是用药有效窗口仅限于发病早期(48小时内)。

(3)有的抗流感药物不具备广谱抗流感病毒的作用。

(4)植物所含的天然小分子化合物都是天然产物，不是针对病毒靶标分子设计的，如果被发现有抗病毒作用，通常会针对宿主(人体)靶标，因此也通常会具有广谱抗流感病毒作用且不易产生耐药性。但是目前有效的植物抗流感药物还非常少。

(5)目前为止，并未发现任何关于云实抗流感病毒的相关报道。

解决以上问题及缺陷的难度为：与流感感染及治病有关的宿主靶标分析还很不清楚，这也是目前还缺乏针对宿主靶标抗流感药物的原因。

解决以上问题及缺陷的意义为：通过发现植物云实提取物的抗流感病毒作用，为解决抗流感药物耐药等问题创造条件。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途。

本发明是这样实现的，一种云实在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的用途。云实即Caesalpinia decapetala(Roth)Alston，别名百鸟不停、老虎刺尖、到钩刺、黄牛刺、马豆、牛王刺、药王子。目前，并没有公开的云实抗病毒或抗流感病毒的任何报道。

进一步，治疗或预防流感病毒感染的药物包括云实乙醇提取物、云实水提取物、云实其他溶剂提取物中的一种。所述云实水提取物、云实其他溶剂提取物均能达到与云实乙醇提取物同样的效果。

所述云实其他溶剂提取物中的溶剂为甲醇、丙酮、石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷中的一种物质或两种以上混合物。

进一步，所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用途中的药物制备的药学上可接受的药物剂型。

进一步，所述药学上可接受的药物剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或注射剂中的一种。

本发明的另一目的在于提供一种药物的制备方法。云实植株由中科院武汉植物分析所植物系统分类学家确认和鉴定。植株干燥后磨成粉末，并用75％乙醇水溶液提取云实可溶性成份云实提取物，通过滤膜过滤后储存在4度冰箱。每次制备云实提取物，都另取1mL冷冻干燥后定量。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明对不同提纯方法对云实抗流感作用进行了分析：我们通过水和乙醇两种溶剂进行提纯，分析发现，云实植株在水中的溶解度较小，而容易溶于乙醇中。从不同浓度乙醇制备的云实提取物在细胞上的抗病毒效果来看，通过75％乙醇提取的植物提取物对流感病毒具有更好的抑制效果(如图2所示)。从表1中可以看到，在0.1MOI的流感病毒感染细胞，75％云实乙醇提取物在U937和A549细胞上对流感病毒的选择指数分别为62.7和107.8。

本发明对云实乙醇提取物在A549细胞上对流感病毒的抑制作用进行了分析：研究发现，通过75％乙醇提取接近饱和溶解的云实提取物，其冷冻干燥后的干重约为70mg/mL。为了计算出精确的CC₅₀、EC₅₀和选择指数SI，通过前期摸索将云实乙醇提取物设置在3.5mg/mL开始3倍梯度稀释，对系列浓度的云实乙醇提取物进行药效的动力学分析。结果显示，云实乙醇提取在A549上对细胞的毒性CC₅₀(半数毒性浓度)为326.4μg/mL，在0.25MOI流感病毒感染情况下对流感病毒H1N1(PR8)抑制的EC₅₀为9.8μg/mL(如图3所示)。除此之外，通过可感染性流感病毒的产生及IFA(间接免疫荧光)方法测定病毒蛋白M2，在14μg/mL浓度时候，对流感病毒H1N1(PR8)可以达到50％的抑制。在43μg/mL的云实提取物作用下，对流感病毒可以达到完全的抑制，且对细胞没有任何毒性作用。

本发明分析了云实乙醇提取物对不同株型流感病毒的广谱抑制作用：A549细胞以0.25MOI分别感染不同类型的流感病毒株A/PuertoRico/8/1934、奥司他韦耐药株A/PuertoRico/8/1934(H274Y)、A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)、A/human/Hu bei/3/2005(H3N2)、A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)和B/human/Hubei/1/2007。结果显示，云实提取物对不同株型的流感病毒都具有广谱的抑制作用(表2)。除此之外，流感病毒还可以感染其它类型的细胞。分析发现，云实乙醇提取物在人单核细胞U937和狗肾细胞MDCK上对不同株型的流感病毒同样具有广谱的抑制作用，。

本发明还分析了云实乙醇提取物在动物水平对小鼠的保护作用：体重约18g左右的的BALB/c小鼠通过滴鼻方式感染4LD₅₀的流感病毒。感染3h后口服60、30和15mg/kg/d的云实提取物和对照溶液，每组10只小鼠。研究发现，云实乙醇提取物可以提高小鼠存活率，降低小鼠肺洗液中的病毒滴度和总细胞数，改善小鼠病理损伤(如图4所示)。

相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：本发明的目的在于弥补现有治疗方法的不足，为临床上预防或治疗流感病毒感染提供一种新的途径。本发明提供的云实乙醇提取物可以抑制不同株型的流感病毒H1N1(PR8)、H1N1(2009)、H3N2、H7N8、奥司他韦耐药株H1N1(274Y)和乙型流感病毒株IBV，具有非常广谱的抗流感病毒活性。

云实乙醇提取物在较低的浓度下对奥司他韦耐药株仍然具有较好的抑制作用。其中在A549上对奥司他韦耐药株的EC₅₀(半数抑制浓度)为5.7μg/mL，选择指数(SI)为55.1。

云实广泛的分布于自然界，取材容易、方便制备。云实乙醇提取物在致死剂量流感病毒即4LD₅₀感染后仍然可以提高小鼠存活率。

本发明证实，云实的乙醇提取物在在动物水平上可以提高致死剂量流感病毒感染后小鼠的存活率，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有抗流感病毒的作用，具有广泛的应用前景。

结合实验发明和现有技术对比得到的效果和优点：

由于流感病毒很容易发生突变，往往导致现阶段抗流感病毒药物失效。本发明的实验数据表明：首先，云实乙醇提取物可以抑制测试过的全部株型的流感病毒，如H1N1、H3N2、H7N8、奥司他韦耐药株H1N1和乙型流感病毒株IBV，具有非常广谱的抗流感病毒活性。本发明预测出对于新突变的流感病毒株应该有抑制效果。其次，云实乙醇提取物在较低的浓度下对奥司他韦耐药株仍然具有同等的抑制作用，弥补了现有市场上主要的抗流感药物奥司他韦的不足。除此之外，动物实验分析发现云实乙醇提取物可以显著提高致死剂量流感病毒感染后小鼠的存活率，降低病毒感染后小鼠肺洗液中的病毒滴度和总细胞数，改善小鼠肺组织的病理损伤。因此，本发明证实了云实在细胞和动物水平对流感病毒都具有抑制作用，可以用于预防或治疗流感病毒的感染。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是相关分析资料中云实包含的一些化合物成分。

图2是通过不同方法提纯的云实提取物的抗流感病毒效果。

图3是本发明实施例提供的云实乙醇提取物可以抑制流感病毒在A549细胞上的复制效果分析。

图4是本发明实施例提供的云实乙醇提取物在动物水平对流感的治疗作用效果分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途，下面结合实验及附图对本发明作详细的描述。

目前，抗流感病毒药物临床前的分析主要分为细胞水平和动物水平两个阶段。首先，在细胞水平上，云实乙醇提取物可以有效抑制流感病毒在A549细胞上的感染。通过感染不同株型的流感病毒H1N1(PR8)、奥司他韦耐药株H1N1(274Y)、H1N1(2009)、H3N2、H7N8和IBV发现，云实乙醇提取物无论是在人肺上皮细胞A549还是人单核细胞系U937上对流感病毒株具有广谱的抑制。其次，在动物水平上高剂量流感病毒感染小鼠后，云实提取物仍然可以减缓小鼠体重下降并有效提高小鼠存活率。不仅如此，云实提取物还可以降低小鼠肺洗液中流感病毒滴度和总细胞数，改善高剂量流感病毒感染后小鼠的肺组织病理损伤。

本发明提供一种云实在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的用途。云实即Caesalpinia decapetala(Roth)Alston，别名百鸟不停、老虎刺尖、到钩刺、黄牛刺、马豆、牛王刺、药王子。目前，并没有公开的云实抗病毒或抗流感病毒的任何报道。

治疗或预防流感病毒感染的药物包括云实乙醇提取物、云实水提取物、其他溶剂提取物(甲醇、丙酮、石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等)或混合溶剂提取物中的一种。

所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

本发明还提供一种利用所述用途中的药物制备的药学上可接受的药物剂型。

所述药学上可接受的药物剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或注射剂中的一种。

本发明还提供一种药物的制备方法。云实植株由中科院武汉植物分析所植物系统分类学家确认和鉴定。植株干燥后磨成粉末，并用75％乙醇水溶液提取云实可溶性成份云实提取物，通过滤膜过滤后储存在4度冰箱。每次制备云实提取物，都另取1mL冷冻干燥后定量。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：不同提纯方法对云实提取物的抗流感作用的影响分析

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

人肺上皮细胞A549(ATCC CCL-185)和人单核细胞U937(ATCC CRL-1593.2)为实验室保存。A型流感病毒H1N1(A/PuertoRico/8/1934)为实验室保存。云实植株由中科院武汉植物分析所植物系统分类学家确认和鉴定。植株干燥后磨成粉末，并经75％乙醇提纯。云实提取物通过滤膜过滤后储存在4度冰箱。

1.2实验仪器

化学发光多功能检测仪(PerkinElmer)

2.实验方法和结果

2.1实验方法

2.1.1药物在不同细胞系上的毒性测定

云实提取物在不同细胞系上的毒性通过CellTiter-Glo进行检测。A549细胞在96孔细胞培养板中长成单层后加入稀释好的不同浓度药物，37℃细胞培养箱中培养48h。检测时每孔加入20μL CellTiter-Glo试剂，室温避光孵育10min后检测。同理，U937细胞和不同浓度梯度稀释后的云实提取物混合液培养在384孔板中，37℃培养48小时后，每孔加入15μLCellTiter-Glo试剂，室温孵育10min后检测。

2.1.2药物抗流感病毒活性检测

云实提取物对不同流感病毒的抑制作用通过NA底物MUNANA进行检测。2-(4-Methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid(MUNANA)是流感病毒神经氨酸酶NA的底物，常被用来检测流感病毒的复制水平。A549或U937细胞在感染流感病毒株H1N1(PR8)同时，加入3倍梯度稀释好的不同方法提纯的云实提取物，37度培养2d后检测上清的病毒含量。检测时，将样品转移至96或384孔板上，与20μM的MUNANA溶液混合，避光置于37℃孵育60min，在多功能酶标检测仪上测定荧光值。激发光为355nm，发射波长485nm。

2.2实验结果

2.2.1通过75％乙醇提取的云实提取物对流感病毒具有较好的抑制效果

为了分析不同提纯方法对云实植物抗流感效果作用的影响，我们通过水和乙醇两种溶剂进行提纯。其中，水提取的温度设置了60和95度提纯两种，醇提的乙醇浓度设置了60％、75％和90％三个浓度。U937细胞以0.1MOI感染流感病毒株A/PuertoRico/8/1934。结果显示，云实植株在水中的溶解度很小，而绝大部分可以溶于乙醇中。从不同浓度乙醇制备的云实提取物在细胞上的效果来看，通过75％乙醇提取的植物提取物对流感病毒具有更好的抑制效果，其中在0.1MOI感染情况下，75％云实乙醇提取物在U937细胞上对流感病毒的选择指数为62.7(图2通过不同方法提纯的云实提取物的抗流感病毒效果)。

2.2.2在不同细胞系上，不同方法制备的云实提取物对流感病毒的抑制作用。

为了分析云实提取物在其它细胞系上是否可以同样抑制流感病毒，本发明额外将A549细胞以0.1MOI量感染流感病A/PuertoRico/8/1934。通过水和乙醇两种溶剂进行提纯的云实提取物在A549细胞上进行进一步验证。结果显示，与U937细胞上的结果类似，通过75％乙醇提取的植物提取物对流感病毒具有更好的抑制效果，在0.1MOI感染情况下，75％云实乙醇提取物在A549细胞上对流感病毒的选择指数为107.8(表1)。

表1：不同提取方法制备的云实提取物在两种不同细胞中的抗流感病毒作用

CC₅₀:50％细胞毒性浓度(μg/mL)；EC₅₀:50％有效浓度(μg/mL)；SI(选择指数):CC₅₀与IC₅₀之比。

实施例2：云实乙醇提取物在细胞水平上对流感病毒的抑制作用分析

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

狗肾细胞MDCK(ATCC CCL-34)、人肺上皮细胞A549(ATCC CCL-

185)和人单核细胞U937(ATCC CRL-1593.2)为实验室保存。A型流感病毒H1N1(A/PuertoRico/8/1934)、奥司他韦耐药株A/PuertoRico/8/1934(H274Y)、A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)、H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)、H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)和B型流感病毒(B/Human/Hubei/1/2007)均为实验室保存。云实植株由中科院武汉植物分析所植物系统分类学家确认和鉴定。植株干燥后磨成粉末，并经75％乙醇提纯。云实提取物通过滤膜过滤后储存在4度冰箱。

1.2实验仪器

化学发光多功能检测仪(PerkinElmer)

2.实验方法和结果

2.1实验方法

2.1.1药物在不同细胞系上的毒性测定

云实提取物在不同细胞系上的毒性通过CellTiter-Glo进行检测，方法同实施例1。

2.1.2药物抗流感病毒活性检测

云实提取物对不同流感病毒的抑制作用通过NA底物MUNANA进行检测。方法同实施例1。

2.1.3间接免疫荧光

待MDCK细胞细胞贴壁为单层后，感染0.25MOI的A/PuertoRico/8/1934(H1N1)流感病毒，感染同时加入稀释好的不同浓度的云实提取物。4℃吸附1小时后，去除药物病毒混合液，加入同样不同浓度的云实提取物维持液，培养48小时后进行间接免疫荧光检测。细胞用4％多聚甲醛固定。室温孵育鼠抗M2蛋白一抗及FITC标记的二抗。最后在高内涵成像系统上进行观察和量化分析。

2.1.4病毒的TCID₅₀检测

将MDCK细胞以1.5×10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂恒温箱中培养。待细胞长成单层后用细胞培养维持液将病毒作连续10倍梯度稀释8个梯度，每梯度设6个复孔，100μL每孔感染细胞，37℃细胞培养中培养，定时观测细胞有无明显CPE。培养2d后检测上清的病毒含量，按照Spearman–Karber法计算病毒的滴度。

2.2实验结果

2.2.1云实提取物可以抑制流感病毒在A549细胞上的感染

云实提取物对流感病毒的抑制作用通过可感染性流感病毒的产生及IFA(间接免疫荧光)方法进行检测。A549细胞感染0.25MOI的流感病毒，云实乙醇提取物从3.5mg/mL浓度起始，3倍梯度稀释，37度培养48小时后进行检测。(A)细胞活力和对流感病毒的抑制用Cell Titer-Glo和NA活性进行检测。(B)不同浓度云实提取物对流感病毒可感染性的抑制通过TCID₅₀方法进行检测。(C)通过IFA方法检测，并使用抗M2抗体验证云实提取物对流感病毒的抑制作用。

结果显示，根据曲线拟合测得云实提取物的CC₅₀为326.4μg/mL，对流感病毒H1N1(PR8)抑制的EC₅₀为9.8μg/mL(图3A)。除此之外，随着云实提取物浓度的升高，可感染性流感病毒颗粒逐渐减少，在14μg/mL浓度时候，对流感病毒可以达到将近一半的抑制(图3B)。通过IFA方法检测流感病毒M2蛋白，从而验证云实提取物对流感病毒的抑制作用。结果显示，跟对照相比，在43μg/mL的云实提取物作用下，细胞可以保持完全活力，同时对流感病毒几乎达到完全的抑制，与病毒滴度检测结果相符。

2.2.2在不同细胞系上，云实提取物可以抑制不同类型的流感病毒

已知云实提取物可以有效抑制流感病毒，为了分析云实提取物是否可以同样抑制不同株型的流感病毒，本发明将MDCK、A549和U937细胞以0.25MOI量感染不同类型的流感病A/PuertoRico/8/1934、奥司他韦耐药株A/PuertoRico/8/1934(H274Y)、A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)、A/human/Hubei/3/2005(H3N2)、A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)和B/human/Hubei/1/2007。云实提取物从2.5mg/mL浓度起始3倍梯度稀释，37度培养2d后收取上清检测。结果显示，云实植物提取物在MDCK、A549和U937上对不同种类的A型和B型流感病毒都具有抑制作用(表2)。

表2：云实乙醇提取物在A549、MDCK和U937细胞上对A型和B型流感病毒的广谱抗病毒作用

CC₅₀:50％细胞毒性浓度(μg/mL)；EC₅₀:50％有效浓度(μg/mL)；SI(选择指数):CC₅₀与IC₅₀之比。

^aA/PuertoRico/8/1934(H1N1)；^bA/PuertoRico/8/1934(H1N1,H274Y,oseltamivirresistant)；^cA/Human/Hubei/1/2009(H1N1)；^dA/human/Hubei/3/2005(H3N2)；^eA/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)；^f B/human/Hubei/1/2007。

实施例3：云实提取物在动物水平对流感的治疗作用分析

1.实验材料

1.1病毒、药物和小鼠

A型流感病毒H1N1(A/PuertoRico/8/1934)为实验室保存。云实植株由中科院武汉植物分析所植物系统分类学家确认和鉴定。植株干燥后磨成粉末，并75％乙醇提纯。云实提取物通过滤膜过滤后储存在4度冰箱。6-8周龄BALB/c小鼠购自北京实验动物中心，饲养在湖北省武汉市武汉病毒分析所的生物安全二级(ABSL-2)实验室。所有动物实验都按照经武汉病毒分析所动物福利委员会批准的实验规则进行操作(WIVA08201601)。

1.2实验仪器

化学发光多功能检测仪(PerkinElmer)、细胞计数仪(BioRad)

2.实验方法和结果

2.1实验方法

2.1.1动物实验

将6-8周龄18g左右的BALB/c小鼠随小鼠经3-溴乙醇麻醉，然后采用滴鼻方式感染4LD50的H1N1(A/PuertoRico/8/1934)鼠肺适应株病毒液20μL。小鼠随机分为不同浓度的药物评价组和阴性对照组(15％乙醇+PBS)，每组10只。感染3h后开始给药，一直持续到感染后第6天。药物与PBS混合后立即给药，采用口腔灌胃给药，每天一次，定时称量每组动物体重直至实验完成。整个实验周期为18d。除此之外，小鼠肺洗液在感染后3和7天收集。用2.5mL注射器吸取1mL预冷的0.1％BSA PBS灌进气管。自然挤出，再次灌进，反复三次后1500rpm离心后收集，即肺洗液bronchoalveolar lavage fluids(BALF)。肺洗液中病毒滴度通过TCID₅₀方法检测。根据统计结果，利用GraphPad Prism6.0绘制出体重变化曲线和生存率曲线。

2.1.2肺组织病理检测

小鼠肺组织通过HE染色进行病理分析。将小鼠处死后，取肺后经4％多聚甲醛固定，包埋在石蜡里进行切片。肺组织通过HE方法染色，然后再数字切片扫描分析系统扫描成像分析。

2.2实验结果

2.2.1云实植物提取物可以提高流感病毒感染后小鼠的存活率

为了进一步分析云实提取物在动物水平对流感病毒的抑制效果，本发明以小鼠为模型，分析致死剂量的流感病毒感染后，不同浓度的云实提取物对小鼠存活率和体重变化的影响。将生长至6-8周体重约18g左右的的BALB/c小鼠通过滴鼻方式感染4LD₅₀的流感病毒。感染3h后口服60、30和15mg/kg/d的云实提取物和对照溶液，每组10只小鼠。每天称重直至感染后18天，计算小鼠存活率和体重变化。结果显示，对照组小鼠在感染7d后开始死亡，感染10d后全部死光(图4A)。给予60mg/kg/d和30mg/kg/d剂量云实提取物的小鼠即在第18天后仍有40％和30％的存活率。除此之外，相比于对照组小鼠，给予60mg/kg/d和30mg/kg/d剂量云实提取物的小鼠体重降低相对缓慢，感染第10天后体重开始明显回升(图4BC)。给予10mg/kg/d剂量云实提取物的小鼠只有10％存活率，体重无明显的恢复(图4D)。综上所述，云实提取物在高剂量流感病毒感染后，对小鼠体重仍有保护作用。

2.2.2云实植物提取物降低小鼠肺洗液病毒滴度并改善流感病毒感染后小鼠肺部组织病理损伤。

为了具体分析云实提取物对感染流感病毒后小鼠的肺组织病理变化的作用效果，本发明分别在第3d和7d的时候取肺洗液，测定肺洗液中总细胞数和病毒滴度。结果显示，相比于对照组，无论是第3d还是第7d，云实提取物都可以降低小鼠肺洗液中的病毒滴度和总细胞数(图4EF)。

除此之外，本发明取小鼠肺组织进行HE染色观察。将约18g左右的的BALB/c小鼠通过滴鼻方式感染4LD₅₀的流感病毒，感染3h后口服60mg/kg/d的云实提取物和对照溶液。分别在第3d和7d的时候取小鼠肺组织，用多聚甲醛固定后染色观察小鼠肺组织病理变化。结果所示，对照组小鼠感染流感后第7d肺组织后肺泡气血屏障损坏，肺组织损伤严重，浸润和聚集了大量的炎症细胞。相比于对照组小鼠，云实提取物的小鼠肺组织无论是第3d还是第7d，肺部损伤都有所改善(图4G)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种云实在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，治疗或预防流感病毒感染的药物包括云实乙醇提取物、云实水提取物、云实其他溶剂提取物中的一种。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述云实其他溶剂提取物中的溶剂为甲醇、丙酮、石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷中的一种物质或两种以上混合物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

5.一种利用权利要求1～4任意一项所述用途中的药物制备的药学上可接受的药物剂型。

6.如权利要求5所述的药学上可接受的药物剂型，其特征在于，所述药学上可接受的药物剂型为片剂、胶囊中的一种。

7.如权利要求5所述的药学上可接受的药物剂型，其特征在于，所述药学上可接受的药物剂型为颗粒剂、口服液的一种。

8.如权利要求5所述的药学上可接受的药物剂型，其特征在于，所述药学上可接受的药物剂型为缓释制剂。

9.如权利要求5所述的药学上可接受的药物剂型，其特征在于，所述药学上可接受的药物剂型为控释制剂或注射剂。

10.一种如权利要求1～4任意一项所述用途中的药物的制备方法，其特征在于，所述药物的制备方法包括：云实植株干燥后磨成粉末，用75％乙醇水溶液提取云实可溶性成份，云实提取物通过滤膜过滤后4摄氏度保存。

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