CN113662949A - N-乙酰-d-甘露糖胺在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种N‑乙酰‑D‑甘露糖胺在制备抗病毒药物中的应用。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入N‑乙酰‑D‑甘露糖胺，能够使SVA的复制水平降低，表明N‑乙酰‑D‑甘露糖胺具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。但本发明并不局限于SVA，在本发明所述的了N‑乙酰‑D‑甘露糖胺能够抑制SVA病毒的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。

Description

N-乙酰-D-甘露糖胺在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种N-乙酰-D-甘露糖胺在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年新传入我国的病毒，是小RNA病毒科(Picornaviridae)新增的塞内卡病毒属的唯一成员，临床症状与口蹄疫难以区分，主要表现为口鼻部、蹄部等产生水泡和溃疡。2014年之前，SVA仅在美国和加拿大零星发生，但自2015年以来，巴西、越南、哥伦比亚、泰国、中国等陆续出现SVA疫情，并不断蔓延。2015年SVA传入我国，中国学者首先在广东省发现猪感染SVA的病例。随后，湖北、黑龙江、福建、河南、广西、河北、辽宁、山东、浙江、安徽、四川、江西和陕西等省份发生疫情，不断流行和蔓延、致病性增强，危害加重。由于SVA是新发传染病，目前尚无商业化的疫苗，且其致病和免疫机制仍不完全清楚。
前期研究表明RIG-I是SVA激活天然免疫的关键分子，但是SVA的2C和3Cpro蛋白能够降低RIG-I的蛋白表达，对RIG-I起到相反的拮抗功能；SVA的2C和3Cpro也能够激活Caspase-3，诱导细胞凋亡；SVA的3Cpro利用自身的酶活性切割MAVS、TRIF和TANK等关键天然免疫分子，抑制宿主的天然免疫应答；SVA的3Cpro蛋白还抑制IRF3/7的蛋白表达和去除RIG-I、TBK1和TRAF3分子的泛素化，拮抗宿主的抗病毒功能；因此，由于上述免疫关键分子及SVA蛋白的存在，抑制了SVA的复制，无法实现大规模的复制。此外，SVA感染还可激活细胞的自噬。上述研究主要集中于SVA与天然免疫通路中关键分子的互作调控，而关于化学物质抑制SVA复制的研究还未见报道。
N-乙酰-D-甘露糖胺(N-Acetyl-D-mannosamine)是白色-淡黄色的晶体粉末，可用于神经疾病的治疗，还可作为合成的中间体，生成多个下游产品。N-乙酰-D-甘露糖胺是合成N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的必需前体，也是细菌荚膜聚唾液酸(PA)的特异性单体。N-乙酰-D-甘露糖胺分别通过GNE和GlcNAc 2-差向异构酶(肾素结合蛋白，RnBP)代谢成ManNAc-6-磷酸和GlcNAc。N-乙酰基-D-甘露糖胺及其衍生物激活食欲素神经元中的hypocretin(HCRT)基因表达，为神经疾病的治疗提供了潜在的可能。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入N-乙酰-D-甘露糖胺，能够使SVA的复制水平降低，表明N-乙酰-D-甘露糖胺具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。
发明内容
本发明提供了一种N-乙酰-D-甘露糖胺在制备抗病毒感染药物中的应用。具体包括以下内容：
第一方面本发明提供了一种N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗病毒感染药物中的应用。
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
优选地，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
第二方面，本发明提供了一种N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐在制备病毒疫苗佐剂中的应用。
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
优选地，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
本发明的有益效果是：本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入N-乙酰-D-甘露糖胺，能够抑制SVA的复制，表明N-乙酰-D-甘露糖胺具有抑制SVA复制的作用，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制SVA病毒的复制。
附图说明
图1N-乙酰-D-甘露糖胺在IB细胞中抑制SVA复制的结果图；
图2不同浓度的N-乙酰-D-甘露糖胺在IB细胞中抑制SVA复制的结果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
N-乙酰-D-甘露糖胺购自sigma公司；
塞内卡病毒菌株SVA/FJ-201由本团队分离，并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
实施例1 N-乙酰-D-甘露糖胺抑制SVA复制
1.含N-乙酰-D-甘露糖胺培养基的制备
在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的N-乙酰-D-甘露糖胺，使其浓度分别为0mM/L、0.2mM/L、0.25mM/L和0.5mM/L。
2.N-乙酰-D-甘露糖胺孵育细胞的样品制备
用配制好的含有甘露糖胺的培养基孵育IB细胞，然后接种SVA/FJ-201(1MOI)，接种后8h收取上清。
3.SVA病毒滴度测定
测定上步骤2中获得的上清的TCID50，进行病毒滴度分析。
TCID50的测定步骤如下：提前16h将IB细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IB细胞，接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)作为感染空孔，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μL病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图1所示，在IB细胞培养过程中，加入N-乙酰-D-甘露糖胺后，SVA的TCID50显著降低，表明，N-乙酰-D-甘露糖胺显著降低了SVA的病毒TCID50，抑制了SVA病毒的复制。
实施例2不同浓度的甘露糖胺在抑制SVA的复制
1.含N-乙酰-D-甘露糖胺培养基的制备
在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的N-乙酰-D-甘露糖胺，使其浓度分别为0mM/L、0.25mM/L、0.5mM/L、1.0mM/L和2.0mM/L。
2.N-乙酰-D-甘露糖胺孵育细胞的样品制备
用配制好的含有甘露糖胺的培养基孵育IB细胞，然后接种SVA/FJ-201(1MOI)，接种后8h收取上清。
3.SVA病毒滴度测定
感染SVA后收集细胞上清，通过TCID50测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定：提前16h将IB细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IB细胞，分别接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)，另设两列阴性对照孔。分别在感染孔中加入100μL病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图2所示，在IB细胞培养过程中，加入不同浓度的N-乙酰-D-甘露糖胺，对SVA复制的影响效果一致。当加入0.25mM/L的甘露糖胺时，SVA的TCID50降低，且随着N-乙酰-D-甘露糖胺含量的增加，SVA的TCID50降低，成剂量依赖关系，其最适浓度为0mM/L-0.5mM/L。上述结果表明，N-乙酰-D-甘露糖胺显著降低了SVA的病毒TCID50，抑制了SVA病毒的复制。
综上，本发明实施例以宿主细胞IB细胞为例，研究证明了N-乙酰-D-甘露糖胺能够在宿主细胞IB细胞中抑制SVA病毒的复制，表明，本发明所述的N-乙酰-D-甘露糖胺能够抑制SVA病毒的复制，可用于制备抗SVA病毒感染的药物或佐剂。
需要说明的是，小RNA病毒科主要包括以下四个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属，而SVA属于口疮病毒属。由于小RNA病毒科四个属之间的病毒结构蛋白具有高度保守性。本发明虽然以小RNA病毒科病毒的SVA为例，证明了了N-乙酰-D-甘露糖胺可以抑制SVA病毒的复制，但本发明并不局限于SVA，在本发明所述的了N-乙酰-D-甘露糖胺能够抑制SVA病毒的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。

Claims (10)

1.N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗病毒感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒为塞内卡病毒。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
6.N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐在制备病毒疫苗佐剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒为塞内卡病毒。
9.如权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰-D-甘露糖胺或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
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