CN114295753A - 云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法。采用UPLC‑MS/MS建立云实皮提取物中3‑去氧苏木查尔酮、异甘草素、原苏木素B、原苏木素B‑10‑O‑β‑D‑葡萄糖苷4种成分在大鼠血浆和心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠组织中的分析方法，开展云实皮提取物在大鼠体内的药代动力学和组织分布研究。药动学参数结果显示，各指标成分的t1/2z在4.57～13.47h，Tmax在0.22～0.51h，Cmax在27.60～6418.38μg·L‑1，AUC0‑t在112.45～11824.25h·μg·L‑1，MRT0‑t在3.89～9.01h，CLz/F在9.85～96.87L·h‑1·kg‑1。组织分布结果显示，在不同时间点上，各指标成分在体内分布较为广泛，具有不均衡的特征，在胃和十二指肠分布较多，其次分布于肝、脾、肺、肾等组织，在心脏中分布最少。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分体内代谢研究技术领域，特别涉及云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法。
背景技术
云实皮为豆科植物云实Caesalpinia decapetala(Roxb.)Alston的干燥根或根皮，主产贵州，其已被《贵州省中药材、民族药材质量标准》、《苗族医药学》、《中华本草》(苗药卷)收载。目前以云实皮为主药上市的贵州民族药品种有“云实感冒合剂”、“清痹通络药酒”等。文献报道云实皮具有祛风除湿、解毒消肿之功效，民间常将其用于风寒感冒、支气管炎、咳嗽、咽喉肿痛、风湿痹痛等症的治疗。云实具有解热、镇痛、抗炎、抗病毒、抗氧化活性，主要含有黄酮类、萜类、苯丙酸类、甾体类和酚类化学成分。目前，关于云实皮的研究报道主要集中在化合物分离鉴定和药理活性方面，体内过程尚缺乏研究。体内过程是药物发挥药理作用、产生疗效的基础，从中药体内过程研究其药效物质基础及机制存在明显优势。云实皮药物代谢动力学与组织分布的动物模型构建未见报道，从而影响了云实皮药物的进一步的开发应用。
近年来不断发展的液质联用技术作为中药体内过程研究的有力手段，以其快速、便捷、灵敏度高、专属性强等特点较好地解决了中药成分复杂、进入体内含量相对较低、检测干扰大所带来的困扰。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
1.云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法，其特征在于，大鼠灌胃给予云实皮提取物药液后，在不同时间点采集血浆，通过测定标志性成分在大鼠血浆中的含量，得到云实皮药物大鼠体内的药代动力学参数；大鼠灌胃给予云实皮提取物药液后，经股动脉放血后取大鼠组织用于药代动力学分析，通过测定标志性成分在大鼠各组织中的含量，得到云实皮药物大鼠组织分布的药代动力学数据。
作为优选，大鼠血浆的采集时间分别为给药后0.083h、0.167h、0.33h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h经大鼠尾静脉取血。
作为优选，所述标志性成分为：原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素。
作为优选，包括以下步骤：
(1)测试样品的制备
a.云实皮药液配制:取云实皮药材，加入乙醇提取，滤液减压浓缩，饱和正丁醇萃取，真空干燥，即得云实皮提取物；云实皮提取物加入羧甲基纤维素钠溶液，超声溶解并搅拌，即得药液；
b.大鼠血浆样品采集：取健康大鼠，单次给予所述药液，于给药后经尾静脉取血，即得含药大鼠血浆样品；
c.大鼠血浆样品处理：取所述步骤b中所得大鼠血浆样品，置EP管中，依次加甲酸水，葛根素内标溶液，甲醇，涡混，超声，离心，取上清液置于离心管中，氮气吹干；残留物用甲醇复溶，涡混，超声，离心，取上清液，即得含药大鼠血浆分析样品；
d.大鼠组织样品采集：取健康大鼠，灌胃给予所述药液，股动脉放血后，迅速取出组织，心、肝、脾、肺、肾、胃以及十二指肠，即得；
e.大鼠组织样品处理：取出步骤d中大鼠组织样品，制成匀浆；取各组织匀浆液，离心，取上层匀浆液，置EP管中，补加甲醇，加入甲酸水，涡混，加入葛根素内标溶液，再加入甲醇，涡混，超声，离心，取上清液置EP管中，吹干，甲醇复溶，涡混，超声，离心，取上清液，即得大鼠组织分析样品；
f.对照品溶液制备：称取原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素对照品溶于甲醇中，获得储备液；分别量取4种对照品储备液，用甲醇梯度稀释至所需浓度，即得混合系列对照品溶液；
g.葛根素内标溶液：称取葛根素溶于甲醇中，即得葛根素内标储备液；取内标储备液，用甲醇定容，得葛根素内标溶液；
h.大鼠空白血浆样品：取大鼠空白血浆，加入混合对照品溶液，依照步骤c进行处理，即得大鼠空白血浆分析样品；
i.大鼠空白组织样品：将不给予药物的相应组织匀浆作为空白匀浆液；取各组织匀浆液，依照步骤e进行处理，即得大鼠空白组织分析样品；
(2)UPLC-MS/MS分析色谱条件和检测条件：Waters BEH C18色谱柱，保护柱：Waters Van Guard BEH C18，流速：0.30mL·min-1，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL；
(3)测定方法：将步骤(1)中所得含药大鼠血浆分析样品、大鼠组织分析样品；加入一定浓度对照品溶液和内标溶液的大鼠空白血浆分析样品和大鼠空白组织分析样品，注入UPLC-MS/MS，测定，即得。
作为优选，其中步骤d中，分别于给药后进行股动脉放血的时间分别为0.25h、0.5h、2h和6h四个时间点。
作为优选，其中步骤(2)中，质谱条件为采用电喷雾电离源，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：1.5kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速：650L·hr-1，去溶剂气温度：350℃，扫描方式为多反应选择离子监测，质谱数据采集及处理软件为Masslynx 4.1质谱工作站。
作为优选，其中步骤(2)中，流动相采用梯度洗脱，洗脱液由A相、B相组成；A相为0.1％甲酸水；B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱开始时，0～0.5min，10％B相；0.5～3min，10％～90％B相；3～4min，90％B相；4～4.5min，90％～10％B相；4.5～5min，10％B相。
作为优选，其中步骤(3)中，所述大鼠空白血浆分析样品，对照品溶液组分由原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素组成，采用三个浓度质控组，低浓度组：313.9、100.4、0.6、19.7ng·mL-；中浓度组：1252.5、200.8、4.9、78.9ng·mL-1；高浓度组：5010.0、502.0、19.6、315、5ng·mL-1。
作为优选，其中步骤(3)中，所述大鼠空白组织分析样品，对照品溶液组分由原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素组成，采用三个浓度质控组，低浓度组：25.1、25.2、2.5、25.2ng·mL-1；中浓度组：100.2、100.4、10.0、100.8ng·mL-1；高浓度组：501.0、502.0、20.1、504.0ng·mL-1。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过分析血浆中原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素Tmax在0.22～0.51h，表明这几种成分吸收速率较快。原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷的Cmax为6418.38±2539.39μg·L，AUC0-t11824.25±1766.75h·μg·L-1，明显高于其他成分，表明其吸收程度较高。
(2)本发明测定原苏木素B在体内呈现出吸收快、消除慢、清除率高的特征，这与已报到的原苏木素B单体的口服后体内药动学研究特征相吻合。异甘草素达峰时间0.22h，吸收较快，在2h左右浓度又升高，这可能与异甘草素在体内的吸收特征有关，其在肠道内的吸收程度顺序为：结肠>空肠>回肠>十二指肠。3-去氧苏木查尔酮是几种成分中吸收程度最低的，图3中该成分出现了双峰现象，可能该成分在大鼠体内存在肝肠循环现象，该现象有利于延长药物在体内的滞留时间，有利于药效的维持。
(3)根据药动实验结果，选择了0.25h、0.5h、2h、6h进行组织分布研究，包含了分布相、平衡相、消除相。在0.25h时，4种成分在组织中呈现出较高的含量，表明4种成分能较快的广泛分布于各组织中。2～6h时，3-去氧苏木查尔酮在肝、脾、肾、胃、十二指肠中浓度都有上升趋势，与药动出现双峰现象的结果相符。3-去氧苏木查尔酮含量虽低，但响应较好，在各组织中均有分布，给药后除胃、肠组织以外，在肾组织浓度较高，提示该成分容易通过肾脏被清除。异甘草素在体内分布广泛，除了心脏，其他组织均有分布，不同时间段的含量变化差异不大。原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B只在胃和肠组织中被检测到，且含量较高。4种成分在大鼠体内各组织脏器中分布差异较大，各采样时间上胃和肠组织浓度均很高。
(4)本发明首次建立了UPLC-MS/MS同时测定云实皮提取物中4种成分在大鼠血浆和组织中的含量分析方法，并将其运用于云实皮的药动学和组织分布特征研究。
附图说明
图1 UPLC-MS/MS图:A.空白血浆；B.空白血浆加对照品溶液；C.实测样品；
图2原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷4种成分的C-t药时曲线(
n＝6)；
图3云实皮提取物在大鼠体内的分布情况(
n＝6)；
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
对照品溶液、内标溶液和质控样品的制备
精密称取原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素对照品适量溶于甲醇中，获得浓度分别为1.0020mg·mL-1、1.0040mg·mL-1、0.5021mg·mL-1、1.0080mg·mL-1的储备液。分别精密量取适量的4种对照品储备液，用甲醇梯度稀释至所需浓度，即得混合系列对照品溶液。
称取葛根素适量溶于50％甲醇中，获得浓度为0.4951mg·mL-1的葛根素内标储备液。取内标储备液适量，用50％甲醇定容，得最终浓度为20ng·mL-1的内标溶液。
色谱条件
Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，保护柱：Waters Van Guard BEHC18(2.1mm×5mm，1.7μm)，流速：0.30mL·min-1，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，流动相：0.1％甲酸乙腈(B)-0.1％甲酸水(A),梯度洗脱(0～0.5min，10％B；0.5～3min，10％～90％B；3～4min，90％B；4～4.5min，90％～10％B；4.5～5min，10％B)，进样体积为1μL。
质谱条件
采用电喷雾电离源(ESI)，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：1.5kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速：650L·hr-1，去溶剂气温度：350℃，扫描方式为多反应选择离子监测(MRM)，质谱数据采集及处理软件为Masslynx 4.1质谱工作站。四种成分及内标用于定量分析的监测离子见表1。
表1四种成分及内标的质谱条件
云实皮提取物的制备
云实皮药材30kg，第一次加入10倍量70％乙醇提取1.5h，过滤，药渣再加入8倍量的70％乙醇提取1.0h，过滤，合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至1g生药/mL，加入1:1水饱和的正丁醇萃取3次，收集正丁醇层，45℃真空干燥，即得。提取率6.15％。
药液的配置
称取云实皮提取物适量，置于烧杯中，加入0.5％羧甲基纤维素钠溶液，超声溶解并搅拌，现用现配。
血浆样品的收集
健康SD大鼠6只，单次给药，6.70g·kg-1(根据提取物中各单体含量测定结果，折算出3-去氧苏木查尔酮、异甘草素、原苏木素B、原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷的给药量分别为1.76、16.40、286.88、145.38mg·kg-1)，给药前12h禁食不禁水，于给药后0.083h、0.167h、0.33h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h经尾静脉取血约0.25mL，置于涂有肝素钠的塑料离心管中，6000r·min-1，离心6min，分离血浆，于-20℃冰箱保存，直至分析。
组织样品的收集
健康SD大鼠24只，分为四组，每组6只，给药前12h禁食不禁水，灌胃给予云实皮提取物(6.70g·kg-1)，分别于给药后0.25h，0.5h、2h和6h四个时间点股动脉放血后，迅速取出组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠)。用冰生理盐水将组织表面的血迹以及内容物洗去，并用滤纸将其沾干，装入自封袋中，冷冻(-20℃)保存，备用。
血浆样品
取大鼠血浆100μL，置1.5mLEP管中，依次加2％甲酸水50μL，葛根素内标溶液50μL，甲醇400μL，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液置于离心管中，37℃下氮气吹干。残留物用50％甲醇150μL复溶，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液进样分析。
组织样品的处理
取出大鼠组织样品，室温解冻，将各组织在冰上剪碎后，混合均匀。精密称取混匀好的各组织，加入2倍量的冰生理盐水，用组织匀浆机粉碎组织，制成匀浆。将不给予药物的相应组织匀浆作为空白匀浆液。取1mL各组织匀浆液，4℃、5000r·min-1离心8min，取上层匀浆液100μL，置1.5mL EP管中，补加甲醇100μL，加入2％甲酸水50μL，涡混1min，加入50μL葛根素内标溶液，再加入甲醇300μL，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液置EP管中，37℃吹干，150μL50％甲醇复溶，涡混1min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液进样分析。
取大鼠空白血浆100μL，加入100μL混合对照品溶液，置1.5mLEP管中，依次加2％甲酸水50μL，葛根素内标溶液50μL，甲醇400μL，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液置于离心管中，37℃下氮气吹干。残留物用50％甲醇150μL复溶，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液进样分析。制备含原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素的低(313.9、100.4、0.6、19.7ng·mL-1)、中(1252.5、200.8、4.9、78.9ng·mL-1)、高(5010.0、502.0、19.6、315、5ng·mL-1)浓度质控(QC)样品用于药代动力学研究。
取胃组织匀浆100μL，取1mL各组织匀浆液，4℃、5000r·min-1离心8min，取上层匀浆液100μL，置1.5mL EP管中，补加甲醇100μL，加入2％甲酸水50μL，涡混1min，加入50μL葛根素内标溶液，再加入甲醇300μL，涡混2min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液置EP管中，37℃吹干，150μL50％甲醇复溶，涡混1min，超声10min，4℃、12000r·min-1离心10min，取上清液进样分析。配制含原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素的低(25.1、25.2、2.5、25.2ng·mL-1)、中(100.2、100.4、10.0、100.8ng·mL-1)、高(501.0、502.0、20.1、504.0ng·mL-1)浓度QC样品用于组织分布研究。
结果
取大鼠空白血浆和胃组织匀浆(作为组织样品分析的代表)、加入一定浓度对照品溶液和内标溶液的大鼠空白血浆和胃组织匀浆、给药后的血浆和胃组织匀浆，处理样品进样分析，所得结果见图1。结果表明，各成分间分离良好，空白血浆和组织中的内源性物质不干扰待测成分的测定。
标准曲线和线性范围
取大鼠空白血浆和胃组织匀浆，处理之后的样品，分别加入100μL混合对照品溶液，以待测物的峰面积与葛根素内标峰面积之比为纵坐标Y，各物质浓度(C)为横坐标X进行直线回归，求得直线方程，即为标准曲线。S/N≥10时定义为定量下限(LLOQ)。结果见表2、表3，各成分在其线性范围内线性关系良好。
表2原苏木素B等4种成分的回归曲线方程
表3各组织中4种成分的标准曲线
准确度和精密度
将前面配制好的配制高、中、低3个浓度的QC样品，每一个浓度平行5份。日内连续进样，计算日内精密度。3日连续进样，计算日间精密度，4种成分在大鼠血浆和组织中的日内和日间精密度RSD(％)均<15％，在血浆和组织样品中的准确度范围分别为85.19％～103.34％，84.01％～106.47％，提示该方法准确、可靠、重复性好。
提取回收率和基质效应
取100μL大鼠空白血浆和胃组织匀浆，加入高、中、低3个浓度混合对照品溶液经过前处理，进样得峰面积A；另取经过前处理的100μL空白血浆和胃组织匀浆，加入相应浓度的混合对照品溶液，进样得峰面积B；配制高、中、低3个浓度混合对照品溶液经前处理，进样得峰面积C。以A/B×100％计算提取回收率，以B/C×100％计算基质效应。3种浓度下4种成分在空白血浆中和空白组织匀浆中的提取回收率分别在87.05％～103.28％和84.30％～104.97％范围内，基质效应分别在89.90％～105.61％和85.43％～104.40％范围内，RSD(％)均小于15％，表明各成分提取回收率良好，无明显的基质效应。
样品稳定性
取大鼠空白血浆和胃组织匀浆，配制高、中、低3个浓度的QC样品，考察样品在自动进样器中放置6h，冻融3次条件下的稳定性，每一个浓度平行5份。结果显示样品在两种条件下均较稳定，RSD(％)均小于15％，符合生物样品测定要求。
药代动力学实验结果
应用建立的UPLC-MS/MS分析方法测定原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷，原苏木素B，3-去氧苏木查尔酮，异甘草素等4种成分各时间点的血药浓度，其血药浓度的数据如表4所示，血药浓度-时间曲线如图2。通过WinNonLin 8.2软件处理后，相关药动学参数见表5。
表4云实皮提取物在大鼠体内各成分的浓度测定结果(ng·mL-1，
n＝6)
表5原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷等4种成分在大鼠体内的主要药动学参数(
n＝6)
组织分布研究
将配制好的云实皮提取物灌胃给予大鼠后，被测成分在大鼠体内不同时间点各组织中的浓度见表6，其同一化合物4个时间点在不同器官的分布矩形图，见图3。
表6给药后4种成分在大鼠体内的分布情况(
n＝6)
注：组织中未检测到成分均未在表中显示.
药动学结果表明，大鼠灌胃给予云实皮提取物后，血浆中原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素Tmax在0.22～0.51h，表明这几种成分吸收速率较快。原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷的Cmax为6418.38±2539.39μg·L，AUC0- t11824.25±1766.75h·μg·L-1，明显高于其他成分，表明其吸收程度较高。
本发明测定原苏木素B在体内呈现出吸收快、消除慢、清除率高的特征，这与已报到的原苏木素B单体的口服后体内药动学研究特征相吻合。异甘草素达峰时间0.22h，吸收较快，在2h左右浓度又升高，这可能与异甘草素在体内的吸收特征有关，其在肠道内的吸收程度顺序为：结肠>空肠>回肠>十二指肠。3-去氧苏木查尔酮是几种成分中吸收程度最低的，图3中该成分出现了双峰现象，可能该成分在大鼠体内存在肝肠循环现象，该现象有利于延长药物在体内的滞留时间，有利于药效的维持。
根据药动实验结果，选择了0.25h、0.5h、2h、6h进行组织分布研究，包含了分布相、平衡相、消除相。在0.25h时，4种成分在组织中呈现出较高的含量，表明4种成分能较快的广泛分布于各组织中。2～6h时，3-去氧苏木查尔酮在肝、脾、肾、胃、十二指肠中浓度都有上升趋势，与药动出现双峰现象的结果相符。3-去氧苏木查尔酮含量虽低，但响应较好，在各组织中均有分布，给药后除胃、肠组织以外，在肾组织浓度较高，提示该成分容易通过肾脏被清除。异甘草素在体内分布广泛，除了心脏，其他组织均有分布，不同时间段的含量变化差异不大。原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B只在胃和肠组织中被检测到，且含量较高。4种成分在大鼠体内各组织脏器中分布差异较大，各采样时间上胃和肠组织浓度均很高。这可能与药物通过灌胃给药，药物须通过胃肠，尤其是小肠吸收入进入体内，药物吸附于胃肠道，致使药物在胃肠浓度偏高；药物因存在首过效应，在尚未吸收进入血循环之前，在肠粘膜和肝脏被代谢，而使进入血循环的原形药量减少，进入各组织的原形药量相对较少。
本发明首次建立了UPLC-MS/MS同时测定云实皮提取物中4种成分在大鼠血浆和组织中的含量分析方法，并将其运用于云实皮的药动学和组织分布特征研究。4种指标成分在在体内吸收迅速，主要分布器官表现出相似性同时又存在差异性。通过研究云实皮在大鼠体内的药代动力学和组织分布特征，以期为云实皮的进一步体内研究和深度开发利用提供研究基础。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.云实皮药物药代动力学和组织分布的动物模型构建方法，其特征在于，大鼠灌胃给予云实皮提取物药液后，在不同时间点采集血浆，通过测定标志性成分在大鼠血浆中的含量，得到云实皮药物大鼠体内的药代动力学参数；大鼠灌胃给予云实皮提取物药液后，经股动脉放血后取大鼠组织用于药代动力学分析，通过测定标志性成分在大鼠各组织中的含量，得到云实皮药物大鼠组织分布的药代动力学数据。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大鼠血浆的采集时间分别为给药后0.083h、0.167h、0.33h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h，经大鼠尾静脉取血。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标志性成分为：原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测试样品的制备
a.云实皮药液配制:取云实皮药材，加入乙醇提取，滤液减压浓缩，饱和正丁醇萃取，真空干燥，即得云实皮提取物；云实皮提取物加入羧甲基纤维素钠溶液，超声溶解并搅拌，即得药液；
b.大鼠血浆样品采集：取健康大鼠，单次给予所述药液，于给药后经尾静脉取血，即得含药大鼠血浆样品；
c.大鼠血浆样品处理：取所述步骤b中所得大鼠血浆样品，置EP管中，依次加甲酸水，葛根素内标溶液，甲醇，涡混，超声，离心，取上清液置于离心管中，氮气吹干；残留物用甲醇复溶，涡混，超声，离心，取上清液，即得含药大鼠血浆分析样品；
d.大鼠组织样品采集：取健康大鼠，灌胃给予所述药液，股动脉放血后，迅速取出组织，心、肝、脾、肺、肾、胃以及十二指肠，即得；
e.大鼠组织样品处理：取出步骤d中大鼠组织样品，制成匀浆；取各组织匀浆液，离心，取上层匀浆液，置EP管中，补加甲醇，加入甲酸水，涡混，加入葛根素内标溶液，再加入甲醇，涡混，超声，离心，取上清液置EP管中，吹干，甲醇复溶，涡混，超声，离心，取上清液，即得大鼠组织分析样品；
f.对照品溶液制备：称取原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮和异甘草素对照品溶于甲醇中，获得储备液；分别量取4种对照品储备液，用甲醇梯度稀释至所需浓度，即得混合系列对照品溶液；
g.葛根素内标溶液：称取葛根素溶于甲醇中，即得葛根素内标储备液；取内标储备液，用甲醇定容，得葛根素内标溶液；
h.大鼠空白血浆样品：取大鼠空白血浆，加入混合对照品溶液，依照步骤c进行处理，即得大鼠空白血浆分析样品；
i.大鼠空白组织样品：将不给予药物的相应组织匀浆作为空白匀浆液；取各组织匀浆液，依照步骤e进行处理，即得大鼠空白组织分析样品；
(2)UPLC-MS/MS分析色谱条件和检测条件：Waters BEH C18色谱柱，保护柱：WatersVan Guard BEH C18，流速：0.30mL·min-1，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL；
(3)测定方法：将步骤(1)中所得含药大鼠血浆分析样品、大鼠组织分析样品；加入一定浓度对照品溶液和内标溶液的大鼠空白血浆分析样品和大鼠空白组织分析样品，注入UPLC-MS/MS，测定，即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤d中，分别于给药后进行股动脉放血的时间分别为0.25h、0.5h、2h和6h四个时间点。
6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(2)中，质谱条件为采用电喷雾电离源，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：1.5kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速：650L·hr-1，去溶剂气温度：350℃，扫描方式为多反应选择离子监测，质谱数据采集及处理软件为Masslynx 4.1质谱工作站。
7.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(2)中，流动相采用梯度洗脱，洗脱液由A相、B相组成；A相为0.1％甲酸水；B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱开始时，0～0.5min，10％B相；0.5～3min，10％～90％B相；3～4min，90％B相；4～4.5min，90％～10％B相；4.5～5min，10％B相。
8.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(3)中，所述大鼠空白血浆分析样品，对照品溶液组分由原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素组成，采用三个浓度质控组，低浓度组：313.9、100.4、0.6、19.7ng·mL-；中浓度组：1252.5、200.8、4.9、78.9ng·mL-1；高浓度组：5010.0、502.0、19.6、315、5ng·mL-1。
9.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(3)中，所述大鼠空白组织分析样品，对照品溶液组分由原苏木素B-10-O-β-D-葡萄糖苷、原苏木素B、3-去氧苏木查尔酮、异甘草素组成，采用三个浓度质控组，低浓度组：25.1、25.2、2.5、25.2ng·mL-1；中浓度组：100.2、100.4、10.0、100.8ng·mL-1；高浓度组：501.0、502.0、20.1、504.0ng·mL-1。
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