CN113671091B - 一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法。所述方法包含如下步骤：采集动物在未饲喂四臣止咳颗粒前的血液样本作为对照组；给予动物四臣止咳颗粒，预定时间后收集所述动物的血液样本作为实验组；采用液相色谱‑质谱法对所述实验组和所述对照组的血液样本进行检测，基于所得到的液相色谱结果确定四臣止咳颗粒入血化学成分；液相色谱的色谱条件中采用的流动相包括：流动相A，所述流动相A选自甲酸水溶液；流动相B，所述流动相B选自乙腈。本发明的方法能够对四臣止咳颗粒提取物入血成分进行分析鉴定，且具有靶点筛选效果高、准确度好、灵敏度高、分析速度快等优点。

Description

一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法。

背景技术

四臣止咳颗粒出自《新编藏药配方》，由岩白菜、螃蟹甲、甘草、猪毛蒿4味药材组成，为藏医理论经典古方，具有清热解毒，止咳平喘，润喉祛痰的功效。

目前对四臣止咳颗粒的研究主要集中于提取工艺及药效学的研究，如慢性支气管炎急性发作等，研究表明四臣止咳颗粒治疗慢性支气管炎急性发作疗效显著，但其发挥药效的活性成分尚不完全清楚。

因此，亟需对四臣止咳颗粒提取物入血成分进行分析鉴定，明确其吸收进入体内的原型成分，探讨其直接作用物质，可为四臣止咳颗粒的临床应用提供参考。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法，该方法能够对四臣止咳颗粒提取物入血成分进行分析鉴定，且具有靶点筛选效果高、准确度好、灵敏度高、分析速度快等优点。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含如下步骤：给予动物四臣止咳颗粒，预定时间后收集所述动物的血液样本；采用液相色谱-质谱法对所述血液样本进行检测，基于所得到的液相色谱结果确定四臣止咳颗粒入血化学成分；所述液相色谱的色谱条件中采用的流动相包括：流动相A，所述流动相A选自甲酸水溶液；流动相B，所述流动相B选自乙腈。

根据本发明的实施例，血清药物化学理论认为，能够吸收入血的原型成分就是发挥作用的有效成分，在此理论基础上，通过分析口服给药后动物血浆中吸收的药源性物质，可以评价中药潜在的药理活性物质。因此，发明人通过大量试验，采用血清药物化学理论，结合现代液相色谱-质谱技术，对四臣止咳颗粒提取物灌胃后的大鼠血浆中的原型成分进行鉴定，该方法能够同时对多种有效成分进行检测，具有操作简便、易于控制、准确性高、检测速度快等优点。并且，发明人通过大量试验发现，通过采用上述流动相，能够将待测样品中的入血成分完全分离，从而方便后期对不同入血成分的检测。由此，对入血成分的检测准确性高。若采用其他流动相，容易出现待测组分无法完全分离（分离度低）、待测组分不出峰、峰面积过大或过小、峰型不佳导致无法积分获取相应面积信息、出峰时间晚导致检测时间长等问题，从而导致检测结果准确性低。

根据本发明的实施例，所述四臣止咳颗粒入血化学成分包含：胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、毛蕊花糖苷、甘草苷、新甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、绿原酸、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、岩白菜素、熊果苷、甘草次酸。由此，发明人通过大量试验，确定了上述16中有效成分为四臣止咳颗粒的入血有效成分。

根据本发明的实施例，进行所述检测之前，预先将所述血液样本进行如下处理：将所述血液样本与乙腈混合，将所得混合液进行第二离心，收集上层液；将所述上层液进行干燥，将所得干燥物用甲醇复溶，得到复溶液；将所述复溶液进行第三离心，收集上清液，将所述上清液进行所述检测。由此，能够将血液样本中的有效成分提取出来，从而方便后期对入血成分进行检测。采用乙腈作为提取剂可以同时提取出全部待测组分，且提取充分，其他组分少，保证检测结果的准确性。若采用其他提取剂提取，不易同时提取出所有待测组分，且携带的杂质较多，影响后续色谱分离检测。

根据本发明的实施例，所述乙腈的用量为所述血液样本体积的2-5倍。发明人通过大量试验发现，采用上述条件，对血液样本中有效成分的提取效果较佳。

根据本发明的实施例，所述第二离心是在10000-15000 r/min的转速下进行10-20min；所述第三离心是在10000-15000 r/min的条件下进行5-10 min。由此，能够将血液中的沉淀完全去除，从而防止其他杂质后期对四臣止咳颗粒中入血成分的干扰。

根据本发明的实施例，所述色谱条件中采用的梯度洗脱程序为：0~9 min，5-95%所述流动相B；9~12 min，95-5%所述流动相B。发明人经过大量实验得到上述较佳的洗脱条件，由此，能够将待测样品中的入血成分完全分离，获得良好的色谱图，从而能够准确的检测出入血成分。若采用其他洗脱条件，容易出现待测组分无法完全分离（分离度低）、待测组分不出峰、峰面积过大或过小、峰型不佳导致无法积分获取相应面积信息、出峰时间晚导致检测时间长等问题，从而导致检测结果准确性低。

根据本发明的实施例，所述甲酸水溶液的浓度为0.05~0.2体积%。由此，对待测样品中入血成分的分离效果较佳。

根据本发明的实施例，所述色谱条件中采用的色谱柱为Cortecs C18色谱柱，流速0.2-0.4 mL/min，柱温20-40℃，温度为2-5℃，进样体积2 μL。由此，能够将有效分离和检测四臣止咳颗粒中入血成分，并获得良好的色谱图。相比与其他检测方法，该方法仅12min即可实现对样品的检测，可为入血成分的筛查鉴定提供了参考。

根据本发明的实施例，所述质谱的条件如下：采集模式为MRM模式；毛细管电压在负离子模式下为2.5 kV，在正离子模式下为3.0 kV；离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流速1000L/Hr。发明人通过大量试验得到上述较佳的质谱条件，能够获得良好的二级碎片图，且质量精度高，从而能够准确地对四臣止咳颗粒中入血成分进行鉴定，具有准确度高、灵敏度高的等优点。相比与其他检测方法，该方法仅12min即可实现对样品的检测，可为入血成分的筛查鉴定提供了参考。

根据本发明的实施例，采用口服方式给予动物所述四臣止咳颗粒，给药方式为每天2-3次，连续给药3-7天。由此，能够保证四臣止咳颗粒中的有效成分进入到血液，然后通过分析口服给药后大鼠血浆中吸收的药源性物质，可以评价中药潜在的药理活性物质。

根据本发明的实施例，所述含药血浆分别在所述末次给药后0.5、1、2、4、6h进行采集。由此，保证对血液样品中入血成分检测的准确度，避免随机误差。

根据本发明的实施例，所述四臣止咳颗粒提取物的制备方法包含如下步骤：将四臣止咳颗粒进行研磨后，加水稀释，然后进行离心取上清液，制得所述四臣止咳颗粒提取物。由此，能够将四臣止咳颗粒中的有效成分进行提取，方便小鼠对四臣止咳颗粒提取物中的有效成分进行吸收。

根据本发明的实施例，所述第一离心的次数至少为两次，每次离心后均取上清液。由此，能够将四臣止咳颗粒中的有效成分进行充分提取。

根据本发明的实施例，所述第一离心是在10000-15000 r/min的条件下进行10-20min。由此，能够将四臣止咳颗粒中的有效成分进行充分提取。

根据本发明的实施例，所述四臣止咳颗粒g：所述水mL=1：（3-7）。由此，能够将四臣止咳颗粒中的有效成分进行充分提取。

根据本发明的实施例，所述有效成分的保留时间、离子对、锥孔电压和碰撞能量见下表：

。由此，本发明的方法能够同时检测出四臣止咳颗粒中的16种入血成分，具有检测结果准确度高、灵敏度高、检测快等优点。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1 为四臣止咳颗粒入血成分图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中涉及的仪器和试剂：

Acquity TM超高效液相色谱系统串联XEVO TQS micro质谱仪：MassLynx V4.2质谱工作站，电喷雾离子源，美国Waters公司；

Cortecs C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.6 μm）；

岩白菜素、山栀苷甲酯、绿原酸、甘草酸、甘草次酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、熊果苷7种标准品均购买自中国食品药品检定研究院；

胡麻属苷、毛蕊花糖苷2种标准品购买自成都曼斯特生物科技有限公司；

甘草素标准品购买自上海源叶生物科技有限公司。

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、猪毛蒿Artemisia scoparia Waldst. etKit.、螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerj.、岩白菜Bergenia purpurascens（Hook.f. et Thoms.）4味药材由西藏藏医学院提供，经西藏藏医学院尼玛次仁教授鉴定为豆科植物甘草干燥根和根茎、菊科植物滨蒿的干燥地上部分、唇形科植物螃蟹甲的干燥块根、虎耳草科植物岩白菜的干燥根茎。

实施例1：

1、试验动物

6只SPF级雄性SD大鼠，体重180-200 g，购买自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。置于北京中医药大学SPF级动物房进行饲养，实验室保障温度20-25 ℃，相对湿度50%左右，大鼠自由饮水饮食，适应一周。所有操作符合动物实验伦理规范。

2、方法

2.1 四臣止咳颗粒提取物的制备

取四臣止咳颗粒适量，研细，精密称取1.0 g，加5 mL水溶解，13000 r/min离心15min，取上清液，加水稀释100倍后，再次以13000 r/min离心15 min，取上清液，作为四臣止咳颗粒提取物。

2.2 血浆样品的收集与制备

取6只SPF级雄性SD大鼠，体重180-200 g，SPF级动物房进行饲养，实验室保障温度20-25 ℃，相对湿度50%左右，大鼠自由饮水饮食，适应一周。所有实验用大鼠于实验前禁食12h，自由饮水，称重，尾部标记，采用尾尖取血，取未饲喂四臣止咳颗粒之前的血浆置于含有EDTA的抗凝管中，作为对照组。

给大鼠灌予四臣止咳颗粒提取物，每天2次，连续3天，末次给药后分别在0.5、1、2、4、6h采集含药血浆，每次200 μL，采集方式与对照组相同。所得血浆样品以3500 r/min，10℃条件下离心10 min，分离上清血浆于离心管中，置于-80℃超低温冰箱贮存备用，作为试验组。

取试验组中各个取血时间点的血浆样品各100 μL，合并，加血浆样品总体积3倍量的乙腈涡旋5 min，然后于13000 r/min离心15 min，沉淀并除去蛋白干扰。取离心后的上层样品氮气吹干，残渣加100 μL甲醇，涡旋5 min，再以13000 r/min离心10 min，取上清，制得待测样品。

取对照组中的血浆样品100 μL，加血浆样品总体积3倍量的乙腈涡旋5 min，然后于13000 r/min离心15 min，沉淀并除去蛋白干扰。取离心后的上层样品氮气吹干，残渣加100 μL甲醇，涡旋5 min，再以13000 r/min离心10 min，取上清，制得对照样品。

2.3 采用UPLC-MS/MS检测条件分别对试验样品、对照样品和不同的标准品进行检测。检测条件如下：

色谱条件为：Cortecs C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.6 μm）；0.1%甲酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱：0~9 min，5-95%B；9~12 min，95-5%B；流速0.3 mL/min；柱温30℃；样品室温度4℃；进样体积2 μL。

质谱条件为：毛细管电压在负离子模式下为2.5 kV，在正离子模式下为3.0 kV；离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流速1000L/Hr；采集模式为MRM（多反映监测）模式。

3、结果

通过对照组的检测结果相比，发现试验样品中含有16种入血成分，并参考标准品色谱图及报道的相关文献，16中入血成分结果见表1和图1。

表1 血中移行成分信息表

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种检测四臣止咳颗粒入血化学成分的方法，其特征在于，包含如下步骤：

采集动物在未饲喂四臣止咳颗粒前的血液样本作为对照组；

给予动物四臣止咳颗粒，预定时间后收集所述动物的血液样本作为实验组；

采用液相色谱-质谱法对所述实验组和所述对照组的血液样本进行检测，基于所得到的液相色谱结果确定四臣止咳颗粒入血化学成分；

进行所述检测之前，预先将所述血液样本进行如下处理：

将所述血液样本与乙腈混合，将所得混合液进行第二离心，收集上层液；

将所述上层液进行干燥，将所得干燥物用甲醇复溶，得到复溶液；

将所述复溶液进行第三离心，收集上清液，将所述上清液进行所述检测；

所述液相色谱的色谱条件中采用的流动相包括：

流动相A，所述流动相A选自甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的浓度为0.05~0.2体积%；

流动相B，所述流动相B选自乙腈；

所述色谱条件中采用的梯度洗脱程序为：0~9 min，5-95%所述流动相B；9~12 min，95-5%所述流动相B；

所述色谱条件中采用的色谱柱为Cortecs C18色谱柱，所述色谱柱的粒径为100mm×2.1mm×1 .6μm，流速0.2-0.4 mL/min，柱温20-40℃，温度为2-5℃，进样体积2 μL；

所述质谱的条件如下：

采集模式为MRM模式；

毛细管电压在负离子模式下为2.5 kV，在正离子模式下为3.0 kV；

离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流速1000L/Hr；

所述四臣止咳颗粒入血化学成分包含：

胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、毛蕊花糖苷、甘草苷、新甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、绿原酸、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、岩白菜素、熊果苷、甘草次酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙腈的用量为所述血液样本体积的2-5倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二离心是在10000-15000 r/min的转速下进行10-20 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三离心是在10000-15000 r/min的条件下进行5-10 min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，采用口服方式给予动物所述四臣止咳颗粒，给药方式为每天2-3次，连续给药3-7天。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，含药血浆分别在末次给药后0.5、1、2、4、6h进行采集。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，四臣止咳颗粒提取物的制备方法包含如下步骤：

将四臣止咳颗粒进行研磨后，加水稀释，然后进行第一离心取上清液，制得所述四臣止咳颗粒提取物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一离心的次数至少为两次，每次离心后均取上清液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一离心是在10000-15000 r/min的条件下进行10-20 min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述四臣止咳颗粒g：所述水mL=1：（3-7）。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，有效成分的保留时间、离子对、锥孔电压和碰撞能量见下表：

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