CN103760269A

CN103760269A - 一种兽药残留的检测方法

Info

Publication number: CN103760269A
Application number: CN201410032399.1A
Authority: CN
Inventors: 王海; 田亚平; 姜艳彬; 单吉浩
Original assignee: Individual
Current assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: CN103760269B

Abstract

本发明提供一种兽药的检测方法，所述方法包括如下步骤：（1）样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后经过多个步骤处理得到上清液过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；（2）兽药残留的测定，将得到的样品在一定的测定条件下进行超高效液相色谱与质谱联用的测定。本发明的检测方法具有灵敏度高，专属性强的特点，能够满足兽药残留的测定。

Description

一种兽药残留的检测方法

技术领域

本发明涉及以一种检测方法，特别是涉及一种兽药残留的检测方法。

背景技术

兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而，由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。

随着人们对动物源食品由需求型向质量型的转变，动物源食品中的兽药残留已逐渐成为全世界关注的一个焦点。兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质残留。目前，在动物源食品中较容易引起兽药残留量超标的兽药主要有抗生素类、磺胺类和激素类等药物。

滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留，这对人体健康造成直接危害。例如长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时人体会产生多种急慢性中毒现象。目前，国内外已有多起有关人食用盐酸克仑特罗超标的猪肺脏而发生急性中毒事件的报道。

四环素类药物能够与骨骼中的钙结合，抑制骨骼和牙齿的发育。磺胺类药物能够破坏人体造血机能等。另一方面，动物机体长期反复接触某种抗菌药物后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖，耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效。此外，滥用兽药对畜牧业的发展和生态环境也造成极大危害。动物用药后，一些性质稳定的药物随粪便、尿被排泄到环境中后仍能稳定存在，从而造成环境中的药物残留。长期滥用药物严重制约着畜牧业的健康持续发展。如长期使用抗生素易造成畜禽机体免疫力下降，影响疫苗的接种效果，还可引起畜禽内源性感染和二重感染。

对动物性食品中的兽药残留进行监控的一个重要手段就是建立快速准确的残留分析方法。目前，报道的文献及国家标准中大多是单一兽药或单一种类兽药的检测方法，但在实际工作中，由于动物性食品安全的保证需要多个指标进行综合指证，因此，单个样本常需要多次检测工作，极大的浪费了人力、物力及财力。多残留的检测能够更好的节省时间、提高工作效率，并能更加有效地监测动物产品的安全性。另一方面，国内外报道的动物源性食品中药物残留检测的检测方法主要有液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)、酶联免疫法及生物传感器技术。

酶联免疫分析技术(ELISA)是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法，其敏感性和特异性较好。ELISA具有样品前处理简单，纯化步骤少，大量样本分析时间短，适合于做成试剂盒现场筛选等优点，使其可实现快速现场监测，是现阶段食品安全检测领域应用较多的一项检测技术。但它也存在着很多缺陷：对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。

生物传感器是由一种生物敏感膜和电化学转换器两部分配合，对特定种类的化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。在兽药残留分析上得到了较广泛的应用。虽然生物传感器具有微型化、响应速度快、样品用量少的特点，但还存在着结果的稳定性、重现性和使用寿命方面的问题。

现有技术的方法常有灵敏度不高、前处理繁琐、检测药物单一或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的同时确证检测。

液质联用（HPLC-MS）的检测方法以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析领域具有了广泛的应用。液质联用（HPLC-MS）分析样品中定性和定量方面的优势是单独液相分析不能媲美的。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供一种新的兽药残留的检测方法，具体来说，其是通过液质联用的检测方法实现多种类多样品的检测。

具体来说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；

（2）兽药残留的测定

将步骤（1）得到的样品进行超高效液相色谱与质谱联用的测定，测定条件如下：

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；源温为105℃-115℃；脱溶剂温度为340℃-360℃；脱溶剂气流速度为600L·h^-1-700L·h^-1；锥孔反吹气流速度为45L·h^-1-55L·h^-1。

其中，所述兽药为四环素类药物、β受体激动剂类药物、喹诺酮类药物和/或磺胺类药物。

其中，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种、几种或全部。

其中，步骤（2）所述梯度洗脱程序为：

0-10.0min：甲醇的体积比为3.0％-90.0%；

10.0-10.1min：甲醇的体积比为90.0％A-3.0％；

10.1-13.0min：甲醇的体积比为3.0％。

其中，步骤（1）所述氮气吹干上清液的温度为25℃-35℃，优选在30℃下进行。

其中，步骤（1）所述第一次离心和第二次离心的转速为9000r·min^-1-11000r·min^-1，离心的时间为8min-12min，优选所述第一次离心和第二次离心的转速为10000r·min^-1，离心的时间为10min。

其中，步骤（1）所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（15～25）：（75～85）；更优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。

其中，步骤（1）所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取和分离，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。

其中，步骤（2）的甲酸水溶液的体积浓度为0.04％-0.07％，优选体积浓度为0.05％。

其中，步骤（2）所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为110℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气流速度为650L·h^-1；锥孔反吹气流速度为50L·h^-1。

本发明的有益技术效果如下：

本发明的检测方法具有灵敏度高，专属性强的特点。

本发明采用的超高液相色谱进行测定，超高效液相色谱（UltraPerformance Liquid Chromatography简称UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高液相色谱在测定上相对于普通液相色谱存在很多优点。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。

UPLC-MS/MS联用技术，结合了液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势，尤其是串联质谱技术(MS/MS或MSⁿ)的应用，可以获得丰富、有效的化合物结构信息，建立快速、高效的分析研究体系。

本发明的目的是克服现有技术的不足，针对4种四环素类药物、18种磺胺类药物、14种喹诺酮类药物及10种β受体激动剂药物建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，以保障对动物源性食品中该类药物残留的检测。

此外，本发明为了提高分析的灵敏度和专一性，进行多时间段的多反应检测扫描（MRM）（multi-period MRM，mpMRM），即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM扫描，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的准确性和专属性。

本发明建立了稳定高效的测定方法，当待测样品通过本发明测定方法进行测定时，通过与所述的定性离子色谱图及保留时间进行残留药物的定性分析，并进一步通过定量离子色谱图和标准曲线最终确定残留药物的含量。

附图说明

图1：4种四环素类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；

图2：10种β-受体激动剂类药物和3种氘代内标混合对照物的定量离子通道色谱图；

图3：14种喹诺酮类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；

图4：18种磺胺类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；

上述各图是UPLC-MS/MS测定结果的原始图谱，由于软件系统是英文的，故输出的原始图是英文的，其中1207代表样品的名称，图中的英文翻译如下：

Channels：质谱检测离子的通道

Tetracycline：四环素、Oxytetracycline：土霉素、Chlorotetracycline：金霉素、Doxycycline：强力霉素；

Terbutaline；特步他林、Cimaterol：西马特罗、Salbutamol：沙丁胺醇、Salbutamol-D6：氘代沙丁胺醇、Fenoterol：菲诺特罗、Ractopamine：莱克多巴胺、Ractopamine-D6：氘代莱克多巴胺、Clorprenaline：氯丙那林、Clenbuterol：克伦特罗、Clenbuterol-D9：氘代克伦特罗、Tulobuterol：妥布特罗、Penbutolol：喷布洛尔、Phenyl EA A：苯乙醇胺A；

Pefloxacin：培氟沙星，Ciprofloxacin：环丙沙星，Enrofloxacin：恩诺沙星，Ofloxacin：氧氟沙星，Enoxacin：伊诺沙星、Pipemidic Acid吡哌酸、Nalidixic Acid：萘啶酸、Cinoxacin：西诺沙星、Norfloxacin：诺氟沙星、Danofloxacin：达氟沙星、Lomefloxacin：洛美沙星、Difloxacin：二氟沙星、Sarafloxacin：沙氟沙星、Sparfloxacin：司帕沙星;

Sulfadoxine：磺胺邻二甲氧嘧啶、Sulfadiazine：磺胺嘧啶、Sulfathiazole：磺胺噻唑、Sulfapyridine：磺胺吡啶、Sulfamerazine：磺胺甲基嘧啶、Sulfamoxol：磺胺二甲基噁唑、Sulfameter：磺胺对甲氧嘧啶、Sulfamethazine：磺胺二甲嘧啶、Sulfamethizole：磺胺甲噻二唑、Sulfamethoxypyridazine：磺胺甲氧哒嗪、Sulfamethoxazole：磺胺甲噁唑、Sulfachloropyridazine：磺胺氯达嗪、Sulfamonomethoxine：磺胺间甲氧嘧啶、Sulfacetamide：磺胺醋酰、Sulfisoxazole：磺胺二甲异噁唑、Sulfaphenazole：磺胺苯吡唑、Sulfadimethoxine：磺胺二甲氧嘧啶、Sulfaquinoxaline：磺胺喹噁啉。

具体实施方式

本发明提供了一种兽药残留的检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）样品的处理：将待测样品进行粉碎，加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；

所述待测样品是各类动物源的肉、蛋、奶。当所述的样品为肉时，前处理的步骤是通过料理机进行粉碎；当待测样品是蛋时，去壳打碎；当待测样品是奶时，只需要简单过滤除杂就可以。

所述的两次离心分离目的是使样品中蛋白质尽量全部除去，防止堵塞液相色谱柱，同时减少残留物质对测定结果的干扰。

所述的提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液，两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（15～25）：（75～85），优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。所述的提取剂的选择是考虑到

蛋白沉淀、药物溶解性及酸碱性进行选择的结果，选择单独的有机溶剂不利于小分子药物的溶解。选择酸性溶液过多会使样品中的残留药物破环，而影响测定结果的准确性。

优选地，所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。

优选地，所述的再次提取是将沉淀加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行离心分离得到上清液，将得到的该上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。所述微孔滤膜的孔径大小为0.45μm。

优选地，氮气吹干上清液的温度为25℃-35℃，优选在30℃下进行。

优选地，所述第一次离心和第二次离心的转速为9000r·min^-1-11000r·min^-1，离心的时间为8min-12min；优选第一次离心和第二次离心的转速为10000r·min^-1，离心的时间为10min。

通过所述的提取过程尽量地将药物提取，并保证动物内源性杂质的去除最大化，在两者同时兼顾的前提下，在本发明检测方法中提取的次数以2次为优选。

（2）兽药残留的测定

将步骤（1）得到的样品进行超高效液相色谱与质谱联用的测定；测定条件如下：

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和0.05％甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；进样量为10μL；

优选地，所述梯度洗脱程序为：

0-10.0min：甲醇的体积比为3.0％-90.0%；

10.0-10.1min：甲醇的体积比为90.0％-3.0％；

10.1-13.0min：甲醇的体积比为3.0％。

所述梯度洗脱的流动相配比和洗脱程序可以保证各个药物的良好分离和定量。

优选地，所述兽药为四环素类药物、β受体激动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。

优选地，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种或几种或全部。

所述的四种兽药残用途较为广泛，在动物组织中残留较多，同时检测上述四类兽药对于食品的检测具有重要意义。上述46种药物涉及的范围很广，结构类型丰富，这说明本发明的方法可以用于多种药物的检测。

在一种优选的实施方式中，本发明兽药残留的检测方法包括如下步骤：（1）样品前处理

动物性肌肉组织首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的动物源性食品5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=20：80）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，10000r·min^-1离心10min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以10000r·min^-1的速率高速离心10min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

（2）样品的检测：色谱条件与质谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相:A相为甲醇，B相为0.05％甲酸水溶液，梯度洗脱：0-10.0min：3.0％A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0％A-3.0％A；10.1-13.0min：3.0％A；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；进样量为10μL。

电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为110℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气流速为650L·h^-1；锥孔反吹气流速为50L·h^-1。

实施例

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器

Waters Ultra Performance LC液相色谱仪(Waters公司)，Quattro Premier XE质谱仪(Waters公司)，MassLynx v4.1数据处理软件(Waters公司)；WatersAcquity UPLC BEH C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；TranssonicTP690超声波清洗器（Elma公司）;3K15离心机（Sigma公司）；Millipore Elix Milli-Q纯水仪。

1.2材料

色谱纯甲醇（Fisher Scientific公司产品）；色谱纯乙腈（Fisher Scientific公司产品）；超纯水；其他试剂均为分析纯。

所用46种药物均是商购获得，各个药物的纯度均高于98.0%。

将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）定量加入所述的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（以下简称46种兽药），将加入兽药后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=20：80）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，10000r·min^-1离心10min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以10000r·min^-1的速率高速离心10min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和0.05％甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.05％甲酸水溶液，0-10.0min：3.0％A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0％A-3.0％A；10.1-13.0min：3.0％A；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；进样量为10μL。

2.1.2质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为110℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气流速度为650L·h^-1；锥孔反吹气流速度为50L·h^-1。

2.2质谱条件优化

将所述的46种药物分别进行MS扫描，确定各个药物的定性离子和定量离子，并优化各个药物离子对的碰撞电压。为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测模式(Multi-Reaction Monitoring，MRM)进行检测，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的定性准确性和专属性。46种药物保留时间、定性离子对和定量离子对列于表1。

为了增强方法的灵敏度，本研究进行多时间段的多反应检测扫描，即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM扫描，以增加每个药物的扫描时间，进而提高灵敏度。具体来说，根据各个药物的保留时间确定监测时间，得到测定结果见表2。

表1 46种药物的保留时间、定性离子对和定量离子对

表2 46个药物的mpMRM参数

mpMRM数据采集模式在一个循环中检测多个药物，节约分析时间，尤其是mpMRM灵敏度高，能够检测含量较低的待测组分。现有技术中，对四环素类药物检测的定量限为500.0ppb，或200.0ppb，而在mpMRM扫描中上述4个药物的检测限均能达到5.0ppb，表明该数据采集模式能够显著提高灵敏度。

2.3方法验证

2.3.2专属性实验

将1.2制备的用于检测的样品进行测定得到色谱图见图1-4。通过图可以看出，46种药物能和其他色谱峰完全分离，空白组织没有干扰，达到了多药物的同时检测。

2.3.3线性关系和检测限

准确量取适量的46个药物的标准液，分别添加到5.0g健康牛肉中，制得含量为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0,200.0ng·mL^-1的系列空白添加试样，按1.2的前处理方法项下所述方法进行处理，然后进行UPLC-MS/MS测定。对于四环素类药物、磺胺类及喹诺酮类药物，以各药物定量离子的色谱峰面积为纵坐标，样品浓度(ng·mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，并测定检出限（S/N>3）和定量限（S/N>10），对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算，结果见表3。

表3 46种药物的标准曲线、定量限和检测限

通过表3数据可以看出4种四环素类药物在5.0ng·mL^-1-200.0ng·mL^-1的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.990，检测限为2.0ng·mL^-1，定量限为5.0ng·mL^-1；喹诺酮及磺胺类药物在1.0ng·mL^-1-100.0ng·mL^-1的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996；检测限为0.5ng·mL^-1，定量限为1.0ng·mL^-1。对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算，结果表明10种β-受体激动剂类药物在1.0ng·mL^-1-100.0ng·mL^-1的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.992；检测限为0.5ng·mL^-1，定量限为1.0ng·mL^-1。上述数据说明本发明检测方法灵敏度高，检测限和定量限较低。2.3.3回收率和精密度试验

准确量取适量的46个药物的标准液，配制高、中、低浓度的46种标准溶液，分别添加到5.0g健康牛肉中，按照1.2的样品前处理方法项下处理样品，并测定药物浓度，每个浓度测定6个样本，每个浓度的测得量与加入量相比，最终得回收率。日内精密度按高、中、低3个浓度分别在1天的不同时间测6次进行计算，日间精密度按高、中、低浓度连续测定3天进行计算。

表4 46种药物的准确度及精密度

通过表4可以看出，本发明方法的准确度在80%～110%之间，日内精密度中10%以下，日间精密度在12%以下，大部分的日间精密度在10%以下。这说明该方法准确度高，且重现性良好。

实施例2

将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）按照每克牛肉中分别加入2.0mL所述的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的混合物（浓度为10ng/ml）。将加入药物后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=20：80）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，10000r·min^-1离心10min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以10000r·min^-1的速率高速离心10min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和0.03％甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.05％甲酸水溶液，0-10.0min：3.0％A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0％A-3.0％A；10.1-13.0min：3.0％A；流速为0.25mL·min^-1；柱温为25℃；进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为105℃；脱溶剂温度为340℃；脱溶剂气流速度为600L·h^-1；锥孔反吹气流速度为45L·h^-1。

测定得到的谱图与图1的色谱图形态相同，说明样品中含有四环素、土霉素、金霉素和强力霉素，同时计算各物质的含量分别为3.53ng/g，3.62ng/g，3.76ng/g及3.69ng/g，回收率在88.3%-94.0%之间，表明准确度较高。

实施例3

将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）按照每克牛肉中分别加入0.5mL所述的10种β-受体激动剂类药物混合物及3种氘代内标混合物（浓度为10ng/ml）。将加入药物后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=25：75）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，9000r·min^-1离心12min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于25℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以9000r·min^-1的速率高速离心12min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和0.04％甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.04％甲酸水溶液，0-10.0min：3.0％A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0％A-3.0％A；10.1-13.0min：3.0％A；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为105℃；脱溶剂温度为30℃；脱溶剂气流速度为600L·h^-1；锥孔反吹气流速度为45L·h^-1。

测定得到的谱图与图2的色谱图形态相同，说明样品中含有10种所述的β-受体激动剂类药物。同时计算各物质的含量，结果表明含量在0.821-0.962ng/g之间，回收率在82.1%-96.2%之间，表明准确度较高。

实施例4

将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）按照每克牛肉中分别加入0.5mL所述的14种喹诺酮类药物的混合物（浓度为10ng/ml）。将加入药物后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=15：85）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，11000r·min^-1离心8min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于35℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以11000r·min^-1的速率高速离心8min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和0.07％甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.07％甲酸水溶液，0-10.0min：3.0％A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0％A-3.0％A；10.1-13.0min：3.0％A；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃；进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5KV；锥孔电压为3.0V；RF透镜电压为0.5V；源温为105℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气流速度为600L·h^-1；锥孔反吹气流速度为55L·h^-1。

测定得到的谱图与图3的色谱图形态相同，说明样品中含有14种喹诺酮类药物，同时计算各物质的含量，结果表明含量在0.864-0.963ng/g之间，回收率在86.4%-96.3%之间，表明准确度较高。

实施例5

将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）按照每克牛肉中分别加入0.5mL所述的18种磺胺类药物的混合物（浓度为10ng/ml）。将加入药物后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0g，置于50mL的离心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=20：80）10.0mL，充分匀浆后，超声提取10min，10000r·min^-1离心10min，上清液转移到另一50mL离心管中，残渣再用提取液10.0mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0mL溶解，涡旋混匀，以10000r·min^-1的速率高速离心10min。取适量上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件

测定得到的谱图与图4的色谱图形态相同，说明样品中含有14种喹诺酮类药物，同时计算各物质的含量，结果表明含量在0.853-0.927ng/g之间，回收率在85.3%-92.7%之间，表明准确度较高。

Claims

1.一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样品的处理：

将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；

（2）兽药残留的测定

2.如权利要求1所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素类药物、β受体激动剂类药物、喹诺酮类药物和/或磺胺类药物。

3.如权利要求1或2所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种、几种或全部。

4.如权利要求1-3任一项所述的兽药残留的检测方法，步骤（2）所述梯度洗脱程序为：

0-10.0min：甲醇的体积比为3.0％-90.0%；

10.0-10.1min：甲醇的体积比为90.0％-3.0％；

10.1-13.0min：甲醇的体积比为3.0％。

5.如权利要求1-4任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述氮气吹干上清液的温度为25℃-35℃，优选在30℃下进行。

6.如权利要求1-5任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述第一次离心和第二次离心的转速为9000r·min^-1-11000r·min^-1，离心的时间为8min-12min，优选所述第一次离心和第二次离心的转速为10000r·min^-1，离心的时间为10min。

7.如权利要求1-6任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（15～25）：（75～85）；更优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。

8.如权利要求1-7任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取和分离，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。

9.如权利要求1-8任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（2）的甲酸水溶液的体积浓度为0.04％-0.07％，优选体积浓度为0.05％。

10.如权利要求1-9任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（2）所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25mL·min^-1；柱温为30℃。