CN108051507A - 一种分析羊肉中残留兽药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析测试领域，具体涉及到一种分析羊肉中残留兽药的方法。至少包括样品前处理、酶解、提取、净化，以及上机测试等步骤。与现有的检测方法相比具有更高的准确度，可以同时提取、净化和测试多种兽药，快速高效。本发明提供的方法采用三类不同的溶剂多次提取的方法，尽可能充分提取羊肉中的兽药，提高检测的准确性，减少基质对兽药检测过程中的影响。此外，在梯度淋洗过程中引入第三个流动相，避免原有的两个流动相由于溶解性以及色谱柱中的吸附剂等的作用下而分层，使目标药物分在两个溶剂中，检测器检测出的特征峰分裂成两个主次特征峰，降低检测出的药物的含量，同时影响其余药物的测定。

Description

一种分析羊肉中残留兽药的方法
技术领域
本发明涉及检测分析兽药领域，具体涉及到一种分析羊肉中残留兽药的方法。
背景技术
如今在畜牧业生产中兽药的使用不可避免，为了保证食品安全，我国已经建立了对应的兽药休药期制度。兽药残留的休药期指畜禽停止给药到许可屠宰或其产品许可上市的间隔时间。我国农业部278号公告规定，凡是供食用动物使用的药物或其他化学物质，均需规定休药期。但在实际畜牧养殖过程中，由于缺乏相关方面的知识，以及经济利益的驱动，部分畜牧养殖户未能按照国家规定的休药期制度执行，从而使得兽药在动物体内残留。此外，未经批准的药物的使用也是兽药残留产生的重要原因之一。我国农业部265号公告中明文规定，不得使用不符合《兽药标签和说明书管理办法》规定的兽药产品，不得使用《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》所列21类药物及未经农业部批准的兽药，不得使用进口国明令禁用的兽药，畜禽产品中不得检出禁用药物。虽然相关规定已明确指出了不得使用的兽药品种，但目前违禁药物(如克伦特罗、莱克多巴胺、氯霉素等)在畜牧生产中的使用现象仍然存在，肉类食品安全事故时而发生，例如，当年震惊全国的为了促进脂肪分解，提高瘦肉率的效果而非法使用克伦特罗而造成的双汇瘦肉精事件。
这些残留在肉当中的兽药对人类的危害主要体现在一下四个方面：首先，兽药由动物代谢吸收，并在动物体内积累，从而会对人体产生直接毒性作用。例如人体摄入一定剂量的克伦特罗，会出现焦虑，心率增加，头痛，肌肉震颤等症状；氨基糖苷类则表现为对人脑神经的损害，出现头晕、耳鸣、听力下降，甚至耳聋等症状。其次，某些药物会对人体造成“三致”作用(致癌、致畸、致突变)，如呋喃西林等硝基咪唑类，雌激素等已被证明对人体具有致癌作用。此外，链霉素会损害婴儿听力神经，造成新生儿听力障碍。某些苯并咪唑类兽药有可能引起人体细胞突变。第三，动物由于长期接触抗菌药物，从而使其积累于体内，动物体内的耐药性微生物被选择性的大量繁殖，使得一些常用药物的疗效下降，如青霉素、氯霉素、庆大霉素、磺胺类等药物在畜牧生产中已经产生了抗药性。如果人类长期食用含有抗菌药物残留的动物源性食品，也会对药物产生一定的耐药性。最后，过敏反应是某些半抗原、低分子物质(如抗生素)与体内细胞蛋白质结合成全抗原，并产生抗体。当再次与药物接触时，引起过敏性反应。人类食用含有某些兽药残留的动物源食品，如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等，也可引起过敏反应。例如磺胺类药物容易引起皮肤的过敏性损伤；青霉素则可引皮疹等过敏现象，较为严重的也有可能起过敏性休克。为了禁止兽药在畜牧业中的泛滥过度使用，中国在内的许多国家和国际组织对牛、羊、猪、马等肉类食品中的兽药残留量做了严格限定，包括“暂定最大残留量”、“一律限量标准”、“豁免蛋”等，但是这些兽药的检测仍然存在不少问题。
我国目前的兽药检测方法主要还是以兽药分类检测为主，这些方法暴露出几个方面的缺陷：例如，对于非检测项目兽药残留筛查能力不足，对于不同种类的兽药残留，其在检测方法上存在差异，使得兽药残留检测仅能对规定的检测兽药种类进行测定，而对于样品中是否含有其他类型的非检测兽药残留，缺乏筛查能力，这就使食品安全监控存在隐患。其次，对同一样品的不同兽药残留检测项目，需采用不同的前处理及检测方法，其不但延长了检测周期，增大检测成本和检测难度，而且降低了工作效率。再者，传统兽药检测方法提取净化过程繁琐，成本高，而且耗时费力，难以满足大批量样品测定的目的。而且在检测肉中残留兽药的含量时，由于有一些兽药与肉类基质之间的作用力比较强，检测过程中对一些兽药的检测影响比较大，导致这些药物的检出限和定量限偏高，例如羊肉中的沙丁胺醇，由于其结构上的特殊性，在检测过程中一受到羊肉基质和溶剂的影响，检测出来的结果比其实际含量低，而且有可能会影响其他兽药的测试结果。因此，开发研究肉中多类兽药残留快速检测技术研究具有重大意义，本研究主要以羊肉样品为主，提供快速、简便的分析羊肉中残留兽药的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，至少包括如下步骤：
(1)将羊肉样品绞碎，于匀浆机中匀浆；
(2)称取5.00g匀浆好的羊肉样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L的乙酸钠缓冲溶液10ml，并加乙酸调节PH值到5～5.5，混合均匀；再加入0.1ml等量的β-葡萄糖醛甙酶和芳基硫酸酯酶，震荡混合均匀后在35～40℃恒温水浴中水解12～24小时，4000转/min离心5min，将分离所得到的清液转移至50ml离心管中；离心分离后的残渣中加入5ml甲酸，于旋涡混合器上涡旋2min，4000转/min，离心5min，并与所得清液合并；
(3)所得清液中加入高氯酸调节PH值到0.5～1.5，混合均匀10～20min，然后4000转/min离心5min后浓缩所得清液，并将其转移至50ml离心管中；
(4)第三步中所得的清液中加入氢氧化钠，调节其PH值到9.5～11.5，并且加入1.0g盐析剂，在漩涡混合器上涡旋混合5min，再加入适量提取剂提取，并且提取液4000转/min离心5min；
(5)于所得提取液中加入10ml正己烷涡旋混合5min，离心分离，所得的清液中依次加入100mg的C18吸附剂和100mg乙二胺-N-丙基硅烷，在漩涡混合器上涡旋混合5min，并且4000转/min离心5min后，清液在40℃和氮气氛围的条件下吹干，并用1ml体积比为1：9的甲醇和0.1wt％甲酸水混合溶液定容，过滤，以备测试；
(6)分别称取适量的各兽药标准品用甲酸溶解，并用甲醇定容，配成浓度为100μg/mL的标准储备液；分别吸取所得标准储备液置于一个50ml容量瓶中，配成1.0μg/mL的混合标准工作液；
(7)对空白的羊肉样品按照上述(1)～(5)步骤的方式进行处理，定容得到空白样品基质溶液；取适量的混合标准工作液，浓缩吹干，并用空白样品基质溶液溶解，配成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、100.0μg/mL的系列基质匹配标准溶液；
(8)采用UPLC-MS/MS法对基质匹配标准溶液进行测试得到标准曲线，并求得其浓度的线性相关性，再用同样的方法对待测样品进行测试与标准曲线对比得到目标兽药的残留量。
作为本发明一种优选的技术方案，第(4)步骤中所述的提取剂提取过程包括如下步骤；
A)对调节PH值到9.5～11.5，并且添加盐析剂离心分离所得的清液中加入10ml第一类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X1提取液；
B)将A步骤中所得的X1提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第二类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X2提取液；
C)将B步骤中所得的X2提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第三类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液共混得到X3提取液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述第一类提取剂选自甲酸、乙酸、二甲基亚砜中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述第二类提取剂为四氢呋喃和/或乙腈。
作为本发明一种优选的技术方案，所述第三类提取剂选自甲醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，第(8)步中所述的UPLC-MS/MS法测试待测液的步骤包括：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相和C二甲基亚砜流动相进行梯度洗脱，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤a)中所述B甲酸水溶液的浓度为0.1wt％；所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 90～100％的B、0～10％的A；
3～6min 50～70％的B、30～50％的A；
6～8min 10～20％的B、70～80％的A和0～10％的C；
8-～16min 10～20％的B、75～85％的A和0～5％的C；
17～20min 70～80％的B、20～30％的A和0～5％的C；
20～25min 0～10％的B、90～100％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤b)中所述质谱分析的条件为电喷雾电离正离子多反应监测模式，电喷雾毛细管电压为4000～4500V，锥孔电压10-90V，脱溶剂气温度：350-400℃，碰撞能量10-90V离子源温度为200～350℃；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均采用氮气体积比含量为99.999％的氮气。
作为本发明一种优选的技术方案，所述兽药为恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、甲氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、加替沙星、氧氟沙星、依诺沙星、西诺沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃苯烯酸钠、呋喃妥因、硝基糠腙、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、青霉素、土霉素、四环素、链霉素、红霉素、氯霉素、新生霉素、己烯雌酚、雌二醇、炔诺酮、醋酸氯地孕酮、左旋咪唑、三氯苯唑、多拉菌素、氯氰碘柳胺、二氯二甲吡啶酚、地克珠利、妥曲珠利、二硝托胺、尼卡巴嗪等抗球虫药、三氮脒、沙莫林、芬苯达唑、阿苯达唑、丙氧咪唑、奥芬达唑、丙硫咪唑、以及克伦特罗、齐帕特罗、波洛母特罗、西巴特罗、克仑潘特、妥洛特罗、沙丁胺醇、特布它林、喷布特罗、非诺特罗、倍他索洛尔、心得安、交沙霉素、克林霉素、罗红霉素、泰妙霉素、泰乐霉素、达氟沙星、二氟沙星、氟罗沙星、氟甲喹、麻保沙星、萘啶酸、奥比沙星、沙拉沙星、吡哌酸、司帕沙星、苯甲酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、金霉素、地美环素、强力霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、周效磺胺、磺胺甲氧哒嗪、磺胺苯吡唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、异丙硝唑、甲硝唑、特硝唑、替硝唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨砜、坎苯达唑、非班太尔、芬苯哒唑、氟苯达唑氨基代谢产物、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、奥苯达唑、噻苯咪唑、5-羟基-噻苯咪唑、班布特罗、溴布特罗、克仑塞罗、马普特罗、马喷特罗、喷布洛尔、莱克多巴胺、妥布特罗、四烯雌酮、a-去甲雄三烯醇酮、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、氟轻松、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲基强的松龙、泼尼松龙、康力龙、睾酮、群勃龙乙酸酯、乙酰丙嗪、咔唑心安、氯丙嗪、甲苯噻嗪中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述兽药为特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述盐析剂为氯化钠、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁中的一种或多种。
有益效果
发明人意料不到的发现本发明提供的分析羊肉中残留兽药的方法与现有的检测方法相比具有更高的准确度，可以同时提取、净化和测试多种兽药，快速高效。本发明提供的方法采用三类不同的溶剂多次提取的方法，尽可能充分提取羊肉中的兽药，提高检测的准确性，减少基质对兽药检测过程中的影响。此外，在梯度淋洗过程中引入第三个流动相，避免原有的两个流动相由于溶解性以及色谱柱中的吸附剂等的作用下而分层，使目标药物分在两个溶剂中，检测器检测出的特征峰分裂成两个主次特征峰，降低检测出的药物的含量，同时影响其余药物的测定结果。通过给出的实施例中也可以看出，本发明提供的分析方法线性相关性普遍很高，准确度和净化效果高；检出限和定量限都比较低，灵敏度和精密度高；回收率普遍高，而且一些平时回收率地的药物(如沙丁胺醇)也得到很大的提高，稳定性好。而且，本发明操作简便、成本低、符合多残留分析的方法。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖，而非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。“和/或”表示两者任意一种情况和两者共存的情况，例如“A和/或B”之意包括“A、B，以及A和B”这三类情况。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
为了解决上述技术问题本发明提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，至少包括样品前处理、酶解、提取、净化，以及上机测试等步骤。
具体包括：
(1)将羊肉样品绞碎，于匀浆机中匀浆；
(2)称取5.00g匀浆好的羊肉样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L的乙酸钠缓冲溶液10ml，并加乙酸调节PH值到5～5.5，混合均匀；再加入0.1ml等量的β-葡萄糖醛甙酶和芳基硫酸酯酶，震荡混合均匀后在35～40℃恒温水浴中水解12～24小时，4000转/min离心5min，将分离所得到的清液转移至50ml离心管中；离心分离后的残渣中加入5ml甲酸，于旋涡混合器上涡旋2min，4000转/min，离心5min，并与所得清液合并；
(3)所得清液中加入高氯酸调节PH值到0.5～1.5，混合均匀10～20min，然后4000转/min离心5min后浓缩所得清液，并将其转移至50ml离心管中；
(4)第三步中所得的清液中加入氢氧化钠，调节其PH值到9.5～11.5，并且加入1.0g盐析剂，在漩涡混合器上涡旋混合5min，再加入适量提取剂提取，并且提取液4000转/min离心5min；
(5)于所得提取液中加入10ml正己烷涡旋混合5min，离心分离，所得的清液中依次加入100mg的C18吸附剂和100mg乙二胺-N-丙基硅烷，在漩涡混合器上涡旋混合5min，并且4000转/min离心5min后，清液在40℃和氮气氛围的条件下吹干，并用1ml体积比为1：9的甲醇和0.1wt％甲酸水混合溶液定容，过滤，以备测试；
(6)分别称取适量的各兽药标准品用甲酸溶解，并用甲醇定容，配成浓度为100μg/mL的标准储备液；分别吸取所得标准储备液置于一个50ml容量瓶中，配成1.0μg/mL的混合标准工作液；
(7)对空白的羊肉样品按照上述(1)～(5)步骤的方式进行处理，定容得到空白样品基质溶液；取适量的混合标准工作液，浓缩吹干，并用空白样品基质溶液溶解，配成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、100.0μg/mL的系列基质匹配标准溶液；
(8)采用UPLC-MS/MS法对基质匹配标准溶液进行测试得到标准曲线，并求得其浓度的线性相关性，再用同样的方法对待测样品进行测试与标准曲线对比得到目标兽药的残留量。
在一种优选的实施方式中，第(4)步骤中所述的提取剂提取过程包括如下步骤；
A)对调节PH值到9.5～11.5，并且添加盐析剂离心分离所得的清液中加入10ml第一类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X1提取液；
B)将A步骤中所得的X1提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第二类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X2提取液；
C)将B步骤中所得的X2提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第三类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液共混得到X3提取液。
在一种优选的实施方式中，所述第一类提取剂选自甲酸、乙酸、二甲基亚砜中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述第二类提取剂为四氢呋喃和/或乙腈。
在一种优选的实施方式中，所述第三类提取剂选自甲醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，第(8)步中所述的UPLC-MS/MS法测试待测液的步骤包括：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相和C二甲基亚砜流动相进行梯度洗脱，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
在一种优选的实施方式中，步骤a)中所述B甲酸水溶液的浓度为0.1wt％；所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 90～100％的B、0～10％的A；
3～6min 50～70％的B、30～50％的A；
6～8min 10～20％的B、70～80％的A和0～10％的C；
8-～16min 10～20％的B、75～85％的A和0～5％的C；
17～20min 70～80％的B、20～30％的A和0～5％的C；
20～25min 0～10％的B、90～100％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比。
在一种优选的实施方式中，步骤b)中所述质谱分析的条件为电喷雾电离正离子多反应监测模式，电喷雾毛细管电压为4000～4500V，锥孔电压10-90V，脱溶剂气温度：350-400℃，碰撞能量10-90V离子源温度为200～350℃；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均采用氮气体积比含量为99.999％的氮气。
在一种优选的实施方式中，所述兽药为恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、甲氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、加替沙星、氧氟沙星、依诺沙星、西诺沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃苯烯酸钠、呋喃妥因、硝基糠腙、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、青霉素、土霉素、四环素、链霉素、红霉素、氯霉素、新生霉素、己烯雌酚、雌二醇、炔诺酮、醋酸氯地孕酮、左旋咪唑、三氯苯唑、多拉菌素、氯氰碘柳胺、二氯二甲吡啶酚、地克珠利、妥曲珠利、二硝托胺、尼卡巴嗪等抗球虫药、三氮脒、沙莫林、芬苯达唑、阿苯达唑、丙氧咪唑、奥芬达唑、丙硫咪唑、以及克伦特罗、齐帕特罗、波洛母特罗、西巴特罗、克仑潘特、妥洛特罗、沙丁胺醇、特布它林、喷布特罗、非诺特罗、倍他索洛尔、心得安、交沙霉素、克林霉素、罗红霉素、泰妙霉素、泰乐霉素、达氟沙星、二氟沙星、氟罗沙星、氟甲喹、麻保沙星、萘啶酸、奥比沙星、沙拉沙星、吡哌酸、司帕沙星、苯甲酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、金霉素、地美环素、强力霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、周效磺胺、磺胺甲氧哒嗪、磺胺苯吡唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、异丙硝唑、甲硝唑、特硝唑、替硝唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨砜、坎苯达唑、非班太尔、芬苯哒唑、氟苯达唑氨基代谢产物、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、奥苯达唑、噻苯咪唑、5-羟基-噻苯咪唑、班布特罗、溴布特罗、克仑塞罗、马普特罗、马喷特罗、喷布洛尔、莱克多巴胺、妥布特罗、四烯雌酮、a-去甲雄三烯醇酮、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、氟轻松、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲基强的松龙、泼尼松龙、康力龙、睾酮、群勃龙乙酸酯、乙酰丙嗪、咔唑心安、氯丙嗪、甲苯噻嗪中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述兽药为特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述盐析剂为氯化钠、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁中的一种或多种。
本发明人在研究过程中发现，现有的方法中单独采用甲酸和/或乙腈对羊肉样品进行提取时，共提物中羊肉脂肪等基质含量比较多，提取液不易净化，也不易进行后续操作。而且一些之类物质中存在的目标药物还未被充分提取出来就被吸附剂吸附除掉，导致目标药物的回收率偏低(尤其是沙丁胺醇)，实际检测的时候降低检测含量。而采用甲酸和/或二甲基亚砜作为第一提取剂，利用这两种溶剂的大极性、溶度参数，以及大部分兽药(尤其是β-受体激动剂类兽药)在甲酸和二甲基亚砜中的溶解性高等特点尽可能多的提取出样品中的目标兽药。接着采用在油中分散系数高于水中的分散系数，对脂肪类共提物，以及样品中的油类杂质的溶解性相对较弱，而对目标兽药溶解性相对少强的四氢呋喃和/或乙腈等溶剂进行第二步提取，去掉共提物中的杂质成分。最后采用甲醇、乙酸乙酯、异丙醇等对目标兽药溶解性高，而对脂肪类等杂质共提物溶解性不好的溶剂进行最后的提取，是得到的提取液中共提物和杂质含量尽可能的少，同时对羊肉样品中的各类兽药(尤其是β-受体激动剂类兽药)能够被充分的提取出来。
此外，本发明人意料不到的发现甲酸和乙腈共混后静置72～84小时(三天左右)后会出现分层的情况。在甲酸和乙腈的混合溶剂中溶解了一些标准兽药药品(尤其是沙丁胺醇)之后溶液分层的情况花的时间更短，大概会在12个小时左右就会出现比较明显的分层，而在甲酸和乙腈混合溶剂中添加一定量的二甲基亚砜之后溶解目标药物，这中分层的情况得到明显的改善，在药物存在的情况下静置96小时(四天)也没有出现分层的情况。出现这些情况可能的机理为沙丁胺醇等目标药物含有酚羟基、醇羟基等亲水性基团，同时含有叔丁基等亲油性基团，而在甲酸和乙腈的混合溶剂中甲酸的亲水性比较强，在水中的分散系数高于在油中的分散系数，而乙腈则相反，在水中点的分散系数低于油中的分散系数，因此有药物溶解在该混合溶剂的情况下，这两种溶剂倾向于往目标药物两个亲水性和疏水性基团处移动，而且当药物的亲水性比较强的时候(如沙丁胺醇)，周围与其相互作用的溶剂更多的是甲酸，油中分散系数较大的溶剂(如乙腈)缓慢的被分离开来，加快溶剂的分离。当两种溶剂的密度存在较大的差异，而且在色谱柱分离时，由于色谱柱中的吸附剂等作用这种情况更加明显。在采用梯度淋洗过程中，流动相含量比例较大时目标产物可能分在两种溶剂中，影响最终测定结果。因此在沙丁胺醇等药物还未被淋洗出来的时候加入第三流动相二甲基亚砜，利用其大的极性和对沙丁胺醇等药物的溶解性，避免其在甲酸和乙腈混合溶剂中的分离，提高检测准确度和检测的可靠性。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，购于国药化学试剂。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，包括如下步骤：
(1)将羊肉样品绞碎，于匀浆机中匀浆；
(2)称取5.00g匀浆好的羊肉样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L的乙酸钠缓冲溶液10ml，并加乙酸调节PH值到5，混合均匀；再加入0.1ml等量的β-葡萄糖醛甙酶和芳基硫酸酯酶，震荡混合均匀后在35℃恒温水浴中水解12小时，4000转/min离心5min，将分离所得到的清液转移至50ml离心管中；离心分离后的残渣中加入5ml甲酸，于旋涡混合器上涡旋2min，4000转/min，离心5min，并与所得清液合并；
(3)所得清液中加入高氯酸调节PH值到0.5，混合均匀10min，然后4000转/min离心5min后浓缩所得清液，并将其转移至50ml离心管中；
(4)第三步中所得的清液中加入氢氧化钠，调节其PH值到9.5，并且加入1.0g等量的氯化钠和硫酸钠，在漩涡混合器上涡旋混合5min，再加入10ml甲酸提取剂提取，并且提取液4000转/min离心5min；
(5)于所得提取液中加入10ml正己烷涡旋混合5min，离心分离，所得的清液中依次加入100mg的C18吸附剂和100mg乙二胺-N-丙基硅烷，在漩涡混合器上涡旋混合5min，并且4000转/min离心5min后，清液在40℃和氮气氛围的条件下吹干，并用1ml体积比为1：9的甲醇和0.1wt％甲酸水混合溶液定容，过滤，以备测试；
所述C18吸附剂和乙二胺-N-丙基硅烷吸附剂的规格为40～60目，购自Waters公司，其余溶剂均为液相色谱级的规格，实验用水符合GB/T 6682一级水的标准。
(6)分别称取适量的沙丁胺醇、特布它林、塞曼特罗、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品用甲酸溶解，并用甲醇定容，配成浓度为100μg/mL的标准储备液；分别吸取所得标准储备液置于一个50ml容量瓶中，配成1.0μg/mL的混合标准工作液，即所得的混合标准工作液中每种兽药的浓度为1.0μg/mL。
所述沙丁胺醇CAS号为18559-94-9，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；特布它林CAS号为23031-25-6，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；塞曼特罗CAS号为54239-37-1，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；塞布特罗CAS号为54239-39-3，购自阿拉丁试剂；恩诺沙星CAS号为93106-60-6，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；莱克多巴胺盐酸盐CAS号为90274-24-1，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；土霉素CAS号为6153-64-6，购自北京世纪奥科生物科技有限公司；克伦特罗盐酸盐CAS号为37148-27-9，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、罗红霉素CAS号为80214-83-1，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、诺氟沙星CAS号为70458-96-7，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、达氟沙星CAS号为112398-08-0，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、环丙沙星CAS号为85721-33-1，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、四环素CAS号为60-54-8，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、溴代克伦特罗盐酸盐CAS号为78982-84-0，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、溴布特罗CAS号为41937-02-4，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、马贲特罗CAS号为54238-51-6，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、交沙霉素CAS号为16846-24-5，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、替米考星CAS号为108050-54-0，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、马布特罗盐酸盐CAS号为56341-08-3，购自北京世纪奥科生物科技有限公司、苯氧苯酚胺盐酸盐CAS号579-56-6，购自北京世纪奥科生物科技有限公司。
(7)对空白的羊肉样品按照上述(1)～(5)步骤的方式进行处理，定容得到空白样品基质溶液；取适量的混合标准工作液，浓缩吹干，并用空白样品基质溶液溶解，配成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、100.0μg/mL的系列基质匹配标准溶液；
(8)采用UPLC-MS/MS法对基质匹配标准溶液进行测试得到标准曲线，并求得其浓度的线性相关性，再用同样的方法对待测样品进行测试与标准曲线对比得到目标兽药的残留量(在实施例中采用的液相色谱-串联质谱仪为美国安捷伦公司Agilent 1290-6460)。
所述UPLC-MS/MS法的测试方法包括如下步骤：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B 0.1wt％的甲酸水溶液流动相，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 90的B、10％的A；
3～6min 50％的B、50％的A；
6～8min 10的B、90％的A；
8-～16min 20％的B、80％的A；
17～20min 80％的B、20的A；
20～25min 10％的B、90％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9765、0.9741、0.9213、0.9948、0.9881、0.9990、0.9989、0.9992、0.9991、0.9989、0.9995、0.9788、0.9745、0.9965、0.9978、0.9981、0.9987、0.9990、0.9977、0.9997。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.1、1.0、4.7、1.9、1.0、1.5、2.1、1.8、2.0、1.8、1.9、1.0、1.2、1.4、1.5、1.5、1.1、1.0、0.9、1.2(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：112.9、111.1、55.5、85.7、110.2、91.8、89.8、91.5、95.1、94.4、93.2、110.1、109.4、96.8、96.5、100.1、94.8、96.8、95.8、97.1。
实施例2
实施例2提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，包括如下步骤：
(1)将羊肉样品绞碎，于匀浆机中匀浆；
(2)称取5.00g匀浆好的羊肉样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L的乙酸钠缓冲溶液10ml，并加乙酸调节PH值到5.2，混合均匀；再加入0.1ml等量的β-葡萄糖醛甙酶和芳基硫酸酯酶，震荡混合均匀后在37℃恒温水浴中水解24小时，4000转/min离心5min，将分离所得到的清液转移至50ml离心管中；离心分离后的残渣中加入5ml甲酸，于旋涡混合器上涡旋2min，4000转/min，离心5min，并与所得清液合并；
(3)所得清液中加入高氯酸调节PH值到1.2，混合均匀15min，然后4000转/min离心5min后浓缩所得清液，并将其转移至50ml离心管中；
(4)第三步中所得的清液中加入氢氧化钠，调节其PH值到11，并且加入1.0g氯化钠和硫酸钠，在漩涡混合器上涡旋混合5min，再加入10ml甲酸提取剂提取，并且提取液4000转/min离心5min；
(5)于所得提取液中加入10ml正己烷涡旋混合5min，离心分离，所得的清液中依次加入100mg的C18吸附剂和100mg乙二胺-N-丙基硅烷，在漩涡混合器上涡旋混合5min，并且4000转/min离心5min后，清液在40℃和氮气氛围的条件下吹干，并用1ml体积比为1：9的甲醇和0.1wt％甲酸水混合溶液定容，过滤，以备测试；
(6)分别称取适量的沙丁胺醇、特布它林、塞曼特罗、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺盐酸盐、土霉素、克伦特罗盐酸盐、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗盐酸盐、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗盐酸盐、苯氧苯酚胺盐酸盐标准品用甲酸溶解，并用甲醇定容，配成浓度为100μg/mL的标准储备液；分别吸取等量所得标准储备液置于一个50ml容量瓶中，配成1.0μg/mL的混合标准工作液，即所得的混合标准工作液中每种兽药标准品的浓度为1.0μg/mL；
(7)对空白的羊肉样品按照上述(1)～(5)步骤的方式进行处理，定容得到空白样品基质溶液；取适量的混合标准工作液，浓缩吹干，并用空白样品基质溶液溶解，配成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、100.0μg/mL的系列基质匹配标准溶液；
(8)采用UPLC-MS/MS法对基质匹配标准溶液进行测试得到标准曲线，并求得其浓度的线性相关性，再用同样的方法对待测样品进行测试与标准曲线对比得到目标兽药的残留量。
所述UPLC-MS/MS法的测试方法包括如下步骤：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 95的B、5％的A；
3～6min 65％的B、35％的A；
6～8min 20的B、80％的A；
8-～16min 15％的B、85％的A；
17～20min 80％的B、20的A；
20～25min 5％的B、95％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9715、0.9781、0.9248、0.9988、0.9895、0.9983、0.9990、0.9998、0.9991、0.9985、0.9992、0.9700、0.9785、0.9988、0.9995、0.9995、0.9995、0.9998、0.9994、0.9998。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.2、1.0、4.6、1.9、1.0、1.4、2.1、1.9、1.8、1.8、1.7、1.0、1.1、1.7、1.5、1.6、1.0、1.0、0.9、1.0(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：112.6、110.8、57.0、88.0、110.1、92.4、90.2、93.0、96.4、93.8、95.1、110.0、109.9、95.2、95.8、100.4、95.5、96.5、96.1、97.5。
实施例3
实施例3提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例2不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取方法，包括如下步骤；
A)对调节PH值到11，并且添加盐析剂离心分离所得的清液中加入10ml等量的甲酸和二甲基亚砜，匀质30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X1提取液；
B)将A步骤中所得的X1提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml乙腈，匀质30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X2提取液；
C)将B步骤中所得的X2提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml甲醇，匀质30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行3次重复提取，并将所得的清液共混得到最终的X3提取液。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9723、0.9794、0.9261、0.9987、0.9895、0.9987、0.9992、0.9997、0.9992、0.9989、0.9985、0.9727、0.9791、0.9990、0.9992、0.9993、0.9994、0.9998、0.9994、0.9999。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.1、0.9、3.9、1.4、0.8、1.1、1.7、1.4、1.4、1.2、1.1、0.9、1.0、1.2、1.0、1.0、0.8、0.7、0.5、0.8(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：1101.5、110.2、78.9、94.0、109.7、95.7、93.8、96.7、98.1、95.6、97.8、109.9、108.8、98.3、97.9、101.8、97.0、100.7、99.0、98.2(单位％)。
实施例4
实施例4提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取过程中B)步骤中的乙腈由四氢呋喃代替。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9731、0.9793、0.9267、0.9988、0.9890、0.9987、0.9995、0.9995、0.9990、0.9994、0.9980、0.9720、0.9797、0.9992、0.9995、0.9991、0.9997、0.9998、0.9995、0.9998。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.0、0.8、3.8、1.5、0.9、1.1、1.8、1.4、1.5、1.3、1.2、0.8、0.9、1.2、1.1、1.0、0.8、0.7、0.6、0.8(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：111.1、110.2、78.2、94.8、109.6、96.6、93.1、96.0、98.5、95.3、98.6、108.8、110.9、98.1、98.2、98.9、97.2、100.2、98.8、98.0。
实施例5
实施例5提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取过程中C)步骤中的甲醇由乙酸乙酯代替。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9743、0.9788、0.9271、0.9991、0.9887、0.9988、0.9992、0.9994、0.9992、0.9998、0.9987、0.9728、0.9792、0.9998、0.9999、0.9992、0.9996、0.9998、0.9996、0.9999。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.1、0.8、3.7、1.5、1.0、1.1、1.8、1.5、1.5、1.3、1.2、0.9、1.0、1.2、1.2、1.0、0.8、0.7、0.6、0.9(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：110.8、109.8、78.4、94.7、108.4、96.8、94.4、96.7、98.1、95.6、98.7、108.4、110.8、98.5、98.0、98.4、97.6、101.3、98.6、98.2。
实施例6
实施例6提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取过程中只有A)和C)步骤，没有B)步骤。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9742、0.9780、0.9284、0.9988、0.9876、0.9986、0.9994、0.9994、0.9997、0.9998、0.9990、0.9733、0.9795、0.9998、0.9999、0.9997、0.9996、0.9998、0.9999、0.9999。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.1、0.9、5.8、2.0、1.0、1.8、2.3、2.0、2.1、1.7、1.5、1.0、1.1、1.8、1.9、1.5、1.5、1.2、1.1、1.6(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：110.9、110.0、61.1、87.7、109.1、94.6、93.4、95.3、97.5、94.9、97.3、110.8、108.3、96.8、97.7、96.4、97.3、102.3、97.4、97.8。
实施例7
实施例7提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取过程中只有B)和C)步骤，没有B)步骤。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9733、0.9784、0.9285、0.9974、0.9866、0.9992、0.9990、0.9997、0.9993、0.9998、0.9988、0.9737、0.9790、0.9998、0.9994、0.9998、0.9993、0.9998、0.9999、0.9995。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为0.9、0.8、5.9、2.2、0.8、1.9、2.1、2.1、2.4、1.9、1.8、0.7、0.9、1.7、1.9、1.6、1.5、1.3、1.2、1.4(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、10、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：111.9、110.8、60.7、88.2、110.1、94.3、93.0、94.8、96.7、95.5、95.3、109.8、109.4、96.1、100.1、96.8、96.5、98.1、95.8、95.1。
实施例8
实施例8提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于第(4)步骤中所述的提取剂提取过程采取梯度提取过程中只有A)步骤，没有B)和C)步骤。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9722、0.9780、0.9265、0.9983、0.9875、0.9989、0.9991、0.9998、0.9992、0.9989、0.9990、0.9721、0.9786、0.9992、0.9994、0.9998、0.9993、0.9998、0.9996、0.9997。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.1、0.8、4.7、1.8、3.3、1.3、2.1、2.0、1.7、1.8、1.7、0.9、1.1、1.6、1.4、1.7、1.1、1.0、1.0、1.0(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：112.6、111.4、58.7、88.2、108.8、92.0、90.0、93.2、96.7、93.7、95.0、100.2、107.5、95.1、96.8、100.0、96.1、97.0、95.9、96.7。
实施例9
实施例9提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于，先进行B)步骤，再进行A)步骤，然后进行C)步骤，即样品先用乙腈提取得到X2提取液，再对X2提取液用等量的甲酸和二甲基亚砜提取得到X1提取液，然后对X1提取液用甲醇提取得到最终的X3提取液。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9743、0.9787、0.9271、0.9992、0.9870、0.9982、0.9990、0.9991、0.9988、0.9991、0.9994、0.9732、0.9791、0.9993、0.9995、0.9998、0.9995、0.9998、0.9997、0.9998。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.0、0.9、4.6、1.7、3.3、1.4、2.0、2.1、1.6、1.7、1.8、1.0、1.1、1.7、1.4、1.6、0.9、1.0、0.9、1.0(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：112.4、111.7、59.5、88.7、110.9、92.5、90.7、93.8、96.0、94.1、95.5、106.6、100.1、95.0、96.3、101.0、96.5、97.2、95.6、96.1。
实施例10
实施例10提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于，先进行C)步骤，再进行B)步骤，然后进行A)步骤，即样品先用甲醇提取得到X3提取液，再对X3提取液用乙腈提取得到X2提取液，然后对X2提取液用等量的甲酸和二甲基亚砜提取得到最终的X1提取液。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9752、0.9779、0.9268、0.9987、0.9877、0.9983、0.9994、0.9997、0.9982、0.9990、0.9991、0.9738、0.9790、0.9983、0.9992、0.9995、0.9990、0.9994、0.9995、0.9997。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为0.8、0.9、4.8、1.9、1.0、1.7、2.2、2.4、1.8、1.8、2.0、1.0、1.2、1.8、1.6、1.7、1.2、1.4、1.2、1.3(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5、5.0、5.0、5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：111.8、110.4、56.9、86.4、108.9、91.0、89.1、92.9、94.5、93.7、94.8、107.7、108.5、93.9、95.8、100.1、95.0、95.0、96.3、95.7。
实施例11
实施例11提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于，所述UPLC-MS/MS法的测试方法包括如下步骤：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相，以及C二甲基亚砜流动相，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 95的B、5％的A；
3～6min 65％的B、35％的A；
6～8min 20的B、70％的A和10％的C；
8-～16min 15％的B、80％的A和5％的C；
17～20min 75％的B、20的A和5％的C；
20～25min 5％的B、95％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9888、0.9898、0.9779、0.9997、0.9967、0.9993、0.9996、0.9998、0.9992、0.9996、0.9995、0.9898、0.9897、0.9999、0.9998、0.9998、0.9997、0.9994、0.9997、0.9996。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.0、1.1、2.4、1.3、2.5、1.0、1.6、1.3、1.4、1.1、0.9、1.0、2.7、1.2、1.0、1.1、0.7、0.6、0.5、0.6(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、10、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：98.2、96.0、86.9、94.4、85.6、95.8、94.1、96.8、98.5、96.6、97.8、95.5、94.0、98.1、98.0、98.3、97.2、98.5、97.9、98.7。
实施例12
实施例12提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例3不同之处在于，所述UPLC-MS/MS法的测试方法包括如下步骤：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相，以及C二甲基亚砜流动相，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 95的B、5％的A；
3～6min 65％的B、35％的A；
6～8min 20的B、73％的A和7％的C；
8-～16min 16％的B、80％的A和4％的C；
17～20min 77％的B、20的A和3％的C；
20～25min 5％的B、95％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的线性相关系数分别为0.9921、0.9933、0.9890、0.9998、0.9994、0.9996、0.9999、0.9999、0.9995、0.9995、0.9997、0.9998、0.9994、0.9999、0.9998、0.9999、0.9997、0.9997、0.9997、0.9998。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的检出限分别为1.2、1.1、2.3、1.2、1.0、1.0、1.5、1.4、1.4、1.0、1.2、1.1、0.9、1.1、1.0、1.0、0.7、0.6、0.5、0.7(单位：μg/kg)；定量限分别为：5、5、10、5.0、5、5.0、5、5.0、5、5、5.0、5、5、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：97.7、95.4、89.1、96.8、98.0、96.6、95.7、97.0、98.7、97.5、98.0、98.7、98.6、98.4、98.0、97.9、97.5、98.3、98.0、98.4。
实施例13
实施例13提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例12不同之处在于，第(6)步骤中的兽药只有特布它林、恩诺沙星、环丙沙星、四环素、塞曼特罗。
性能测试
1.线性相关性测试：样品定量根据目标化合物外标基质匹配标准曲线进行定量计算。
测试得到特布它林、塞曼特罗、恩诺沙星、环丙沙星、四环素标准品的线性相关系数分别为0.9991、0.9987、0.9997、0.9998、0.9994。
2.检出限和定量限测试：以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比大于等于10确定方法的定量限。
测试得到特布它林、塞曼特罗、恩诺沙星、环丙沙星、四环素标准品的检出限分别为2.3、1.8、1.9、2.1、2.2(单位：μg/kg)；定量限分别为：5.0、5.0、5.0、5.0、5.0(单位：μg/kg)。
3.回收率测定：在5、10、20和50μg/kg四个浓度水平做加标回收试验。
测试得到特布它林、塞曼特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、恩诺沙星、莱克多巴胺、土霉素、克伦特罗、罗红霉素、诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、四环素、溴代克伦特罗、溴布特罗、马贲特罗、交沙霉素、替米考星、马布特罗、苯氧苯酚胺标准品的平均回收率分别为：92.8、93.0、96.1、91.1、94.9。
实施例14
实施例14提供了一种分析羊肉中残留兽药的方法，与实施例12不同之处在于，第(6)步骤中的兽药只有沙丁胺醇。
线性相关性99.4％；检出限为2.1；定量限为5.0；回收率为：89.8。
前述的实施例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
(1)将羊肉样品绞碎，于匀浆机中匀浆；
(2)称取5.00g匀浆好的羊肉样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L的乙酸钠缓冲溶液10ml，并加乙酸调节PH值到5～5.5，混合均匀；再加入0.1ml等量的β-葡萄糖醛甙酶和芳基硫酸酯酶，震荡混合均匀后在35～40℃恒温水浴中水解12～24小时，4000转/min离心5min，将分离所得到的清液转移至50ml离心管中；离心分离后的残渣中加入5ml甲酸，于旋涡混合器上涡旋2min，4000转/min，离心5min，并与所得清液合并；
(3)所得清液中加入高氯酸调节PH值到0.5～1.5，混合均匀10～20min，然后4000转/min离心5min后浓缩所得清液，并将其转移至50ml离心管中；
(4)第三步中所得的清液中加入氢氧化钠，调节其PH值到9.5～11.5，并且加入1.0g盐析剂，在漩涡混合器上涡旋混合5min，再加入适量提取剂提取，并且提取液4000转/min离心5min；
(5)于所得提取液中加入10ml正己烷涡旋混合5min，离心分离，所得的清液中依次加入100mg的C18吸附剂和100mg乙二胺-N-丙基硅烷，在漩涡混合器上涡旋混合5min，并且4000转/min离心5min后，清液在40℃和氮气氛围的条件下吹干，并用1ml体积比为1：9的甲醇和0.1wt％甲酸水混合溶液定容，过滤，以备测试；
(6)分别称取适量的各兽药标准品用甲酸溶解，并用甲醇定容，配成浓度为100μg/mL的标准储备液；分别吸取所得标准储备液置于一个50ml容量瓶中，配成1.0μg/mL的混合标准工作液；
(7)对空白的羊肉样品按照上述(1)～(5)步骤的方式进行处理，定容得到空白样品基质溶液；取适量的混合标准工作液，浓缩吹干，并用空白样品基质溶液溶解，配成浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、100.0μg/mL的系列基质匹配标准溶液；
(8)采用UPLC-MS/MS法对基质匹配标准溶液进行测试得到标准曲线，并求得其浓度的线性相关性，再用同样的方法对待测样品进行测试与标准曲线对比得到目标兽药的残留量。
2.如权利要求1所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，第(4)步骤中所述的提取剂提取过程包括如下步骤；
A)对调节PH值到9.5～11.5，并且添加盐析剂离心分离所得的清液中加入10ml第一类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X1提取液；
B)将A步骤中所得的X1提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第二类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液合并共混得到X2提取液；
C)将B步骤中所得的X2提取液浓缩并转移至50ml离心管中，加入10ml第三类提取剂，匀质15～30min，离心分离，过滤取上层清液；对离心分离所得的样品残渣按照此步骤进行2～3次重复提取，并将所得的清液共混得到X3提取液。
3.如权利要求2所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，所述第一类提取剂选自甲酸、乙酸、二甲基亚砜中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，所述第二类提取剂为四氢呋喃和/或乙腈。
5.如权利要求2所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，所述第三类提取剂选自甲醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，第(8)步中所述的UPLC-MS/MS法测试待测液的步骤包括：
a)将滤液经过C18反相色谱柱分离，以A乙腈流动相、B甲酸水溶液流动相和C二甲基亚砜流动相进行梯度洗脱，流速为0.2ml/min，柱温25℃，进样量15μL；
b)采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000amu扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测质谱分析，羊肉基质匹配标准溶液标准曲线法进行定性定量的液相色谱串联质谱分析检测，即可检测羊肉中残留兽药的含量。
7.如权利要求6所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，步骤a)中所述B甲酸水溶液的浓度为0.1wt％；所述梯度洗脱的洗脱程序为：
0～3min 90～100％的B、0～10％的A；
3～6min 50～70％的B、30～50％的A；
6～8min 10～20％的B、70～80％的A和0～10％的C；
8-～16min 10～20％的B、75～85％的A和0～5％的C；
17～20min 70～80％的B、20～30％的A和0～5％的C；
20～25min 0～10％的B、90～100％的A；
所述A为乙腈流动相、B为甲酸流动相和C为二甲基亚砜流动相，所采用的为体积百分比。
8.如权利要求6所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，步骤b)中所述质谱分析的条件为电喷雾电离正离子多反应监测模式，电喷雾毛细管电压为4000～4500V，锥孔电压10-90V，脱溶剂气温度：350-400℃，碰撞能量10-90V离子源温度为200～350℃；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均采用氮气体积比含量为99.999％的氮气。
9.如权利要求1中任意一项所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，所述兽药为恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、甲氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、加替沙星、氧氟沙星、依诺沙星、西诺沙星、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃苯烯酸钠、呋喃妥因、硝基糠腙、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、青霉素、土霉素、四环素、链霉素、红霉素、氯霉素、新生霉素、己烯雌酚、雌二醇、炔诺酮、醋酸氯地孕酮、左旋咪唑、三氯苯唑、多拉菌素、氯氰碘柳胺、二氯二甲吡啶酚、地克珠利、妥曲珠利、二硝托胺、尼卡巴嗪等抗球虫药、三氮脒、沙莫林、芬苯达唑、阿苯达唑、丙氧咪唑、奥芬达唑、丙硫咪唑、以及克伦特罗、齐帕特罗、波洛母特罗、西巴特罗、克仑潘特、妥洛特罗、沙丁胺醇、特布它林、喷布特罗、非诺特罗、倍他索洛尔、心得安、交沙霉素、克林霉素、罗红霉素、泰妙霉素、泰乐霉素、达氟沙星、二氟沙星、氟罗沙星、氟甲喹、麻保沙星、萘啶酸、奥比沙星、沙拉沙星、吡哌酸、司帕沙星、苯甲酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、金霉素、地美环素、强力霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、周效磺胺、磺胺甲氧哒嗪、磺胺苯吡唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、异丙硝唑、甲硝唑、特硝唑、替硝唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨砜、坎苯达唑、非班太尔、芬苯哒唑、氟苯达唑氨基代谢产物、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、奥苯达唑、噻苯咪唑、5-羟基-噻苯咪唑、班布特罗、溴布特罗、克仑塞罗、马普特罗、马喷特罗、喷布洛尔、莱克多巴胺、妥布特罗、四烯雌酮、a-去甲雄三烯醇酮、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、氟轻松、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲基强的松龙、泼尼松龙、康力龙、睾酮、群勃龙乙酸酯、乙酰丙嗪、咔唑心安、氯丙嗪、甲苯噻嗪中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的分析羊肉中残留兽药的方法，其特征在于，所述盐析剂为氯化钠、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁中的一种或多种。
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